用於治療代謝性骨疾病的藥物組合物及其製備方法

2023-05-21 16:43:26

專利名稱：用於治療代謝性骨疾病的藥物組合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種用於治療代謝性骨疾病的複合藥物組合物及其製備方法，其中所述的組合物被製成一種含有骨化三醇、阿侖特羅和適量其他添加劑的複合藥劑。按照本發明的藥物組合物，可以抑制當單獨給予骨化三醇時引起的血鈣過多，由於骨化三醇的存在可以補償由阿侖特羅引起的對骨質重建活性的抑制，並且還可以改善藥物的依從性。因此，有效地預防了骨質疏鬆症的發生。
相關領域的說明骨質疏鬆症是一種全身性代謝性骨疾病，其特徵是在不影響骨本身化學組成的情況下發生骨質量減少和骨中微結構改變，它導致骨折的易感性增加。特別是，已知老年患者更易受骨折的傷害，這通常發生於甚至是較小的身體震動；事實上，已知在美國兩千五百萬骨質疏鬆症患者中，每年有將近一百三十萬的患者經受骨折的痛苦，此數量幾乎佔美國人口總數的10％。
骨質疏鬆症可以分成I型和II型。I型骨質疏鬆症更頻繁地發生於絕經後的婦女中，並且特點是由於雌激素的缺乏而導致骨吸收顯著增加。由於雌激素缺乏導致的骨吸收增加是非常顯著的。可以很經常地觀察到I型骨質疏鬆症的患者丟失骨小梁並由此導致脊柱或腕的頻繁骨折。同時，II型骨質疏鬆症通常發生於老年人或男性，並且以骨質重建能力急劇下降而不是骨吸收增加為特點。但是，已知由破骨細胞所致的骨吸收增加以及鈣吸收下降，是兩種類型的骨質疏鬆症所共同的。
在臨床領域中治療骨質疏鬆症所用的治療劑通常被分為兩組；一組能夠促進骨質重建，而另一組能夠防止骨吸收。能夠促進快速骨質重建的活性治療劑的實例包括合成代謝的類固醇、氟化物、維生素D和甲狀旁腺激素。隨著目前骨生成機理的引入，由於維生素D衍生物在調節骨質平衡方面的作用，它已經成為公眾關注的對象。骨化三醇，用1，25-(OH)2-D3表示的活性維生素D3之一，是一種上述的骨質重建激活劑，並且還是一種能夠預防骨質疏鬆症的激素，原因是它不僅能夠增加鈣從腸道中的吸收，而且還能夠抑制骨質量的下降。但是，骨化三醇還顯示當單獨使用時引起血鈣過多。血鈣過多，是一種代謝性疾病，它的特點是血中血漿鈣的濃度為11.0mg/dL或者更高，是最常見的與致死性疾病例如腫瘤緊密相關的威脅生命的疾病之一。事實上，骨化三醇通過骨代謝導致血鈣濃度的增加以及非正常的鈣濃度調節，因而產生血鈣過多。由於骨化三醇的副作用和維生素D的過量所致的血鈣過多或鈣成癮(長時間血鈣過多的嚴重情況)的症狀，與血鈣過多中所顯示的症狀非常相似。血鈣過多偶而會出現例如食欲不振、頭痛、嘔吐、便秘的急性症狀和包括營養不良、感覺異常、發熱口渴、多尿症(hyperurisis)、脫水、倦怠、生長遲緩，尿路感染等的血鈣過多的慢性症狀。血鈣過多的患者經常出現併發症，這增加了治療疾病例如骨質疏鬆症的困難。
在治療骨質疏鬆症中作為骨吸收抑制劑使用的常規藥劑包括雌激素、降鈣素、二膦酸鹽和異丙氧黃酮。日本專利公開說明書No.7-330613公開了一種骨質重建激活劑，它含有阿侖特羅(一種二膦酸鹽)作為一種活性劑，在二羥基維生素D3的存在下，它可以激活成骨細胞的鈣化以及骨基質的形成。
歐洲專利公開說明書No.88-4628公開了一種用於口服給藥的藥劑，此藥劑用二膦酸鹽作為一種基質，並且含有適量的十二烷基硫酸鈉。
美國專利No.125,372公開了含有二膦酸鹽的腸溶片。
但是，上述骨吸收抑制劑還沒有成功地足以提高已經患有骨質疏鬆症患者的骨質量，因此，開發非常有效的骨質重建激活劑一直是長期企盼的需要。
一篇近來的義大利報導公開了一種聯合給予阿侖特羅和骨化三醇的方法[Clinical Drug Investigation(臨床藥物研究)(1988)3月，15(3)，235-244]。在此報導中，阿侖特羅和骨化三醇不是作為一種複合片給藥，只是單獨給藥。例如，阿侖特羅一天給藥一次，而骨化三醇一天給藥兩次，在每次給藥之間有一定的時間間隔。而且，阿侖特羅必須在餐前給藥，原因是當餐後給藥時吸收不好，導致藥效顯著下降。考慮到大多數骨質疏鬆症患者是老年人，而且它們中的大多數還每天服用多種藥物，因此，由於上述藥物具有相當複雜的給藥特點，患者經常忘記服用一種或兩種計劃服用的藥物也是情有可原，所以上述給藥的效果還存在疑問。
阿侖特羅還引起上消化道黏膜的局部刺激，這常常導致食道中為數不多的副作用，例如食道炎、食道潰瘍、食道糜爛。因此，對於患者來說，當服用一種含有阿侖特羅的藥物時，必須飲用足夠量的水，以便使他們正服用的藥物可以儘可能快地經過食道並使食道刺激保持在最低水平。而且對於藥物依從性較低的患者，這已經成為一種負擔。
在1997年1月加拿大溫哥華舉行的「日本和美國青光眼協會」會議中，宣布開發複合藥劑的最終目的是提高藥物的依從性。在1998年2月4日在芝加哥舉行的「關於逆轉錄病毒和機會致病菌感染的第5次會議」中，展示了Combivir(一種含有藥物機理彼此不同的拉米夫定和齊多夫定的複合藥劑)具有96％的療效，與當拉米夫定和齊多夫定作為一種獨立的藥物分別單獨給藥時所獲得的72％的療效相比，有所提高。並且推測這種治療效果提高的原因是患者對複合藥劑藥物依從性的提高。
在關於製備含有骨化三醇和阿侖特羅的複合藥片治療骨質疏鬆症方面還沒有進行過研究，相反，有許多研究思路集中在阿侖特羅作為一種治療劑治療由維生素D攝入引起的血鈣過多的效果上。因此，非常需要開發具有先進的配製技術的用於治療骨質疏鬆症的複合藥劑，它不僅能將例如血鈣過多(當單獨給予骨化三醇引起)的副作用降至最小，而且還能用小劑量預防/治療骨質疏鬆症，並且通過改善相當複雜的給藥途徑和防止食道副作用的發生，提高了藥物的依從性，此藥物的依從性在常規的藥物中通常是較低的。
本發明的總結本發明涉及一種用於治療代謝性骨疾病的藥物組合物及其製備方法，特別涉及一種用於治療代謝性疾病的改良的藥物組合物及其製備方法，其中所述的組合物被製成一種複合藥劑，該藥劑含有(a)骨化三醇，它能夠減少脊柱骨折率和增加骨密度；(b)阿侖特羅，一種骨吸收抑制劑，作為以能夠產生最大治療作用的最佳混合比例混合的活性成分，以及(c)適量的其他添加劑，例如阿侖特羅的吸收增強劑。因此，所得的藥物組合物可以減少由骨化三醇引起的血鈣過多，由於骨化三醇的存在可以補償由阿侖特羅引起的對骨質重建活性的抑制，可以提高通常與由於給藥困難和通常的食道中的副作用伴隨的藥物的依從性。因此，有效地預防了骨質疏鬆症的發生。
附圖的簡要說明附

圖1顯示了卵巢摘除術後給予阿侖特羅和骨化三醇兩個月後脛骨骨小梁的顯微鏡視像(x40)，阿侖特羅和骨化三醇或者單獨給藥或者作為兩種成份聯合給藥。
附圖2的圖顯示了通過使用圖像分析儀觀察到的骨小梁區域。
附圖3的圖顯示了通過使用Technicon自動分析儀觀察到的鈣的濃度。
附圖4的圖顯示了通過使用鈣試劑盒(Youngdong藥物有限公司，韓國)觀察到的尿中鈣/肌酸酐的濃度。
附圖5的圖顯示了通過一個使用RIA方法的試劑盒觀察到的血清中骨鈣蛋白的濃度。
附圖6的圖顯示了通過使用Technicon自動分析儀觀察到的鹼性磷酸酶的活性。
附圖7的圖顯示了通過使用Technicon自動分析儀觀察到的尿中I型膠原端肽(NTx)的濃度，I型膠原端肽(NTx)被用作骨吸收率的一個指數。
對於附圖1-7來說，A-F代表進行如下治療的Sprague-Dawley白色大鼠的實驗組。A沒有治療B單用賦形劑治療C單用骨化三醇(0.1μg/kg)治療D單用阿侖特羅(1.0mg/kg)治療E複合治療1[骨化三醇(0.1μg/kg)+阿侖特羅(0.5mg/kg)]F複合治療2[骨化三醇(0.1μg/kg)+阿侖特羅(1.0mg/kg)]G複合治療3[骨化三醇(0.1μg/kg)+阿侖特羅(2.0mg/kg)]附圖8的圖顯示了觀察兩周的用一種含有骨化三醇和阿侖特羅的複合藥劑口服治療的Sprague-Dawley白色大鼠的體重變化。
附圖9的圖顯示了觀察兩周的用一種含有骨化三醇和阿侖特羅的複合藥劑口服治療的Sprague-Dawley白色大鼠的飲食攝入。
對於附圖8-9來說，1-8代表進行如下治療的Sprague-Dawley白色大鼠的實驗組。1骨化三醇(125μg/kg)+阿侖特羅(1250mg/kg)2骨化三醇(100μg/kg)+阿侖特羅(1000mg/kg)3骨化三醇(75μg/kg)+阿侖特羅(700mg/kg)4骨化三醇(50μg/kg)+阿侖特羅(500mg/kg)5骨化三醇(25μg/kg)+阿侖特羅(250mg/kg)6骨化三醇(5μg/kg)+阿侖特羅(50mg/kg)7骨化三醇(1μg/kg)+阿侖特羅(10mg/kg)8骨化三醇(0.2μg/kg)+阿侖特羅(2.0mg/kg)附圖10的顯微鏡視像(H E x100)顯示了用一種含有100μg/kg骨化三醇和1000mg/kg阿侖特羅的複合藥劑口服治療的Sprague-Dawley白色大鼠的脾組織發現物的結果。
附圖11的圖顯示了觀察7周的用一種含有骨化三醇和阿侖特羅的複合藥劑口服治療的Sprague-Dawley白色大鼠的體重變化。
附圖12的圖顯示了觀察7周的用一種含有骨化三醇和阿侖特羅的複合藥劑口服治療的Sprague-Dawley白色大鼠的飲食攝入。
對於附圖11-12來說，1-4代表進行如下治療的試驗Sprague-Dawley白色大鼠的組。1骨化三醇(25μg/kg)+阿侖特羅(250mg/kg)2骨化三醇(5μg/kg)+阿侖特羅(50mg/kg)3骨化三醇(1μg/kg)+阿侖特羅(10mg/kg)4骨化三醇(0.2μg/kg)+阿侖特羅(2mg/kg)本發明的詳細描述本發明涉及一種用於治療代謝性骨疾病的藥物組合物，其特徵是含有骨化三醇和阿侖特羅作為兩種活性成分，其中所述的組合物中每1重量份的骨化三醇含有1,000-50,000重量份的阿侖特羅。
本發明還涉及一種製備上述含有骨化三醇和阿侖特羅作為活性成分的藥物組合物的方法，該方法包括a)一種獲得骨化三醇顆粒的方法；通過向骨化三醇和乙醇的混合物中添加甘露糖醇，然後向上述的混合物中添加乙醇、抗氧化劑和粘合劑，將上述混合物粉碎成14-35目大小並乾燥上述的粉碎混合物完成；b)一種獲得阿侖特羅顆粒的方法；
通過混合甘露糖醇、吸收增強劑和阿侖特羅，然後向上述的混合物中添加乙醇和粘合劑，將上述混合物粉碎成14-35目大小並乾燥上述的粉碎混合物完成；c)一種製備藥片的方法；通過按1∶1重量份的混合比例混合從步驟a)中獲得的骨化三醇顆粒和從步驟b)中獲得的阿侖特羅顆粒，然後向上述的混合物中添加一種崩解劑和一種潤滑劑並將所得的混合物壓片完成。
通過下列的實施例對本發明進行更為詳細地說明，但是這些實施例不應該被認為是對本發明範圍的限制。
本發明涉及一種含有以最佳的混合比例混合的骨化三醇和阿侖特羅作為兩種活性成分的藥物組合物的製備方法，此藥物組合物中的前一種成分已知在減少脊柱骨折和增加骨密度方面有效，而在加入了吸收增強劑之後，後一種成分在抑制骨吸收方面有效。
下面對上述兩種活性成分進行進一步闡述。
首先，骨化三醇，用1，25-(OH)2-D3表示的活性維生素D3衍生物之一，它與鈣在腸道的運輸有關，而且已知它能夠激活腸道內的鈣的吸收，而且它能夠減少甲狀旁腺激素的分泌，因此減輕了患有骨質疏鬆症的絕經婦女的骨丟失[Aloia J.F.，Am J Med(美國醫學雜誌)(1988)，84，401-8]。另外，還已知骨化三醇能夠激活骨鈣蛋白的產生，骨鈣蛋白是一種涉及與成骨細胞有關的骨礦化的骨特異性蛋白[Price P.A.，Calcif Tissue Int(1990)4月，46(4)，270-9]。但是，骨化三醇作為一種藥劑，還存在一個問題，那就是當單獨使用時經常引起血鈣過多，並因此為了克服這種缺點進行了許多這方面的研究。
其次，用4-氨基-羥基亞丁基-1，1-二膦酸鹽表示的阿侖特羅是一種被開發用作治療質疏鬆症治療劑的二膦酸鹽，而且已知它能夠通過抑制破骨細胞的活性預防骨丟失，並因此有助於提高骨密度。事實上，臨床研究表明可以增加大約2-3％的骨密度。例如，一個對來自16個不同國家的994名絕經後婦女進行的臨床研究表明脊柱骨和下肢骨的礦物質密度逐漸增加。而且，在用阿侖特羅藥物治療的組中新的脊柱骨折的發生率，與安慰組相比，下降了大約48％。
一般地，骨的礦物質密度與骨密度緊密相關，因此當礦物質的密度變高時，骨折的發生率急劇下降。當阿侖特羅以10mg/日的量持續給藥3年(10mg/日的阿侖特羅被認為具有最好的治療效果[Liberman，N.Engl.J.Med.(新英格蘭醫學雜誌)(1995)，333，1437-1443]，脊柱骨和下肢骨的礦物質密度分別增加8.2％和7.2％，但是在相同的給藥時間內，安慰組中的礦物質密度下降了0.7％。但是，阿侖特羅卻顯示出對正常骨代謝周期的負面影響，這種負面影響是通過降低骨質重建率導致的。因此，需要一種必需能夠解決這個問題的複合藥劑。
由於阿侖特羅能夠預防血鈣過多，已知血鈣過多是由骨化三醇引起的最嚴重的副作用，因此，我們假設聯合給予阿侖特羅和骨化三醇將能夠解決血鈣過多，並且還可以給予最佳劑量的骨化三醇，由於骨化三醇的安全界限狹窄，其每日劑量一直被限制。而且，阿侖特羅對骨質重建的拮抗活性還將由於骨化三醇的存在而得到補償。
作為一種開發用於治療絕經後婦女的最有效的複合藥劑的方法，首先，在本發明中誘導實驗動物患有骨質疏鬆症，然後將它們置於給予不同濃度的骨化三醇和阿侖特羅的混合物的大量試驗中，這些不同濃度的骨化三醇和阿侖特羅的混合物是由於骨化三醇和阿侖特羅的混合比例不同所產生的，並且其最佳混合比例最後被定在不僅能在不減慢骨質重建率的情況下有效地預防骨質疏鬆症，而且還可以將血液中的鈣濃度控制在正常水平的比例。此結果表明藥劑中兩種成分之間的最佳濃度比例為1重量份的骨化三醇含有1,000-50,000重量份的阿侖特羅。如果上述藥劑中1重量份的骨化三醇所含的阿侖特羅的數量小於1,000重量份，所得的血漿鈣濃度將會增加，並且當給予此藥劑時，將會冒很高的引起血鈣過多的危險。另一方面，上述藥劑中1重量份的骨化三醇所含的阿侖特羅的數量大於50,000重量份時，它將會對正常的骨代謝周期產生負面影響，這種負面影響是由降低骨質重建率所致的。
按照本發明的藥劑可以製備成不同的劑型，例如裸片、腸溶片、顆粒劑、腸溶顆粒劑、膠囊和腸溶膠囊。而且，每個劑量單位中建議使用的每種成分的範圍為骨化三醇為0.1-5.0μg，阿侖特羅為1-50mg。
進行一系列顯示製備藥劑效力的試驗後，選擇添加劑。然後將適量的所選添加劑分別加入上述兩種活性成分中的每一種活性成分中，以製備兩種初步的製劑，然後將它們混合在一起最後形成一種複合藥劑。如此獲得的複合藥劑，與那些主要由於給藥困難以及在食道中的副作用而導致具有較低的藥物依從性的常規藥物相比，顯示出改進很多的藥物依從性，因此，它有效地預防了骨質疏鬆症的發生。
本發明所用製備方法的特徵如下。
方法A在本發明中，將甘露糖醇加入骨化三醇和乙醇的混合物中，並混合，然後將乙醇、抗氧化劑和一種粘合劑加入此混合物中，並混合，然後將所得混合物粉碎成14-35目大小並在30-50℃下乾燥，得到骨化三醇顆粒。如果混合物的大小小於14目，所得的骨化三醇顆粒變得不均勻，而如果混合物的大小大於35目，產率變低並且壓片的操作性變差。
方法B在一個與上述方法A分開的獨立步驟中，將阿侖特羅、甘露糖醇和一種吸收增強劑混合在一起，並添加乙醇和一種粘合劑。然後，將所得的混合物粉碎成14-35目大小並在30-50℃下乾燥，得到阿侖特羅顆粒。如果混合物的大小小於14目，所得的阿侖特羅顆粒變得不均勻，而如果混合物的大小大於35目，產率變低並且壓片的操作性變差。
方法C
將分別從方法A和B中獲得的骨化三醇顆粒和阿侖特羅顆粒混合在一起，添加崩解劑和潤滑劑，並將所得的混合物壓片以最終得到本發明的複合藥劑。
下面描述本發明中所使用的添加劑。
首先，在上述方法A和B中使用甘露糖醇作為一種賦形劑，在方法A和B中所使用的甘露糖醇的量分別限制在佔最終藥物組合物中所含甘露糖醇總量的50-60重量％和40-60重量％。
限制甘露糖醇數量的理由如下。骨化三醇和阿侖特羅之間的可混性試驗表明兩種成分的混合物導致骨化三醇的穩定性下降。但是，在一個相容性試驗中，當骨化三醇在與阿侖特羅混合之前先於其他的賦形劑混合時，骨化三醇在所得的混合物中保持穩定。因此，為了避免骨化三醇和阿侖特羅直接接觸，本發明的發明人首先用甘露糖醇將骨化三醇和阿侖特羅分別稀釋以產生它們的顆粒，然後將它們混合。關於在製備上述顆粒中所用甘露糖醇的數量，我們發現甘露糖醇的數量對於保持上述顆粒的均勻性是很重要的。當分別使用50％總甘露糖醇製備骨化三醇顆粒和阿侖特羅顆粒時，可以觀察到所得顆粒在比容上存在差別，而且隨後(在將上述顆粒混合併壓片後)獲得的藥片在上述成分的數量上是不均勻的。因此，進行了大量試驗以發現甘露糖醇的一個最佳數量，在此數量下可以產生均勻顆粒並且使每一種所給成分均含有相同的數量；結果發現使用大約50-60％的總甘露糖醇製備骨化三醇顆粒是適宜的，並且優選52％。同時，製備阿侖特羅顆粒建議使用大約40-60％的總甘露糖醇，並且優選48％。然後，在上述兩種顆粒混合前，對他們進行調整以使其具有相同的數量。
在本發明中可以使用的賦形劑的實例包括白糖、纖維素和乳糖以及甘露糖醇，優選右旋甘露糖醇。這些賦形劑建議使用10-98重量％，優選70-97重量％。如果所加甘露糖醇的數量不在上述範圍內，之後壓片的可操作性變差。
本發明中可以使用的抗氧化劑是一種或多種選自丁基化羥基甲苯(BHT)、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、DL-α-生育酚和卵磷脂的抗氧化劑，優選丁基化羥基甲苯(BHT)和丁基化羥基苯甲醚(BHA)。這些抗氧化劑可以使用佔總組合物重量的0.001-10重量％，優選0.01-1.0重量％。如果抗氧化劑的量不在上述範圍內，之後將會出現骨化三醇穩定性方面的問題。
粘合劑可以選自吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素和羧甲基纖微素鈉。這種作為添加劑的粘合劑的建議使用量為佔總組合物重量的0.1-20重量％，優選1-10重量％％。如果粘合劑的數量不在上述範圍內，由於不均勻的顆粒分布，之後壓片的可操作性將變差。
崩解劑可以選自交聯羧甲基纖維素鈉、低級取代的羥丙基纖維素、和羧甲基纖維素鈣。這種作為添加劑的崩解劑的建議使用量為佔總組合物重量的0.1-20重量％，優選1-10重量％。如果崩解劑的數量不在上述範圍內，之後將會出現藥片崩解方面的問題。
潤滑劑的實例包括硬脂酸鈣、硬脂酸鎂和滑石。它的建議使用量為佔總組合物重量的0.1-20重量％，優選1-10重量％。如果崩解劑的數量不在上述範圍內，之後將會出現壓片可操作性方面的問題以及活性成分測定方面的問題。
十二烷基硫酸鈉可以作為一種吸收增強劑使用，它的建議使用量為佔總組合物重量的0.01-10重量％，優選0.1-1重量％。
另外，用於緩釋的添加劑可以選自羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素和乙基纖維素。
按照本發明的藥物成分，可以通過用一種腸溶包衣溶液包覆製成腸溶片，而且，還可以通過將一定的藥物組合物裝入常規的膠囊製成膠囊。此腸溶包衣溶液由腸溶包衣成分、增塑劑和溶劑組成。腸內吸收劑的實例是羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、甲基丙烯酸聚合物和鄰苯二甲酸醋酸纖維素，增塑劑的實例包括檸檬酸三乙酯、聚乙二醇和丙二醇。本發明中所用的溶劑是兩種或多種選自二氯甲烷、乙醇、丙酮和蒸餾水的溶劑。
如此製備的藥劑，在治療代謝性骨疾病例如骨質疏鬆症、佩吉特病、脊柱炎、骨軟化症、腎衰竭患者的腎性骨營養不良、甲狀旁腺機能低下和甲狀旁腺功能亢進方面，已經顯示出的良好的治療效果。
通過下列的實施例對本發明進行進一步說明。但是，這些實施例無論如何不應該被認為是對本發明範圍的限制。參考實施例在不僅能有效地預防骨質疏鬆症的發展，而且能使血漿鈣濃度以及鈣的尿排洩量保持在一個正常水平，同時又不抑制骨質重建率的情況下，計算出最佳濃度比。1)骨質疏鬆症的誘導從Daehan Biolink有限公司(漢城，韓國)中購買十二周齡的成熟雌性Sprgue-Dawley白色大鼠，並在漢城大學藥物學院動物試驗室的一間乾淨房間中飼養。通過用普通的飼料(Purina，chow diet)餵養，使這些白色大鼠適應一周，並將它們分為6個不同的組，其中每組由具有相似體重分布的10隻白色大鼠組成，對它們中的所有白色大鼠實行卵巢切除術(ovariostereses)。可以允許這些白色大鼠自由地飲水，在22℃、50％溼度、12h暗/明周期的標準條件下進食。2)藥物治療卵巢切除術後，這些白色大鼠靜養2天，然後在2月的時間內，每周5天早晨口服給予一種藥物，此藥物含有一定劑量的單一的骨化三醇或阿侖特羅或它們的組合，它們分別獨立地溶於0.5mL精製棕櫚油和生理鹽水中。每組中給予藥物的劑量顯示於表1中，對照組僅僅給予相同數量的實驗組中所用的棕櫚油和生理鹽水。
表1.
3)收集樣本和預處理在開始上述藥物給藥2個月後，通過使用一個代謝籠收集白色大鼠24h的尿樣，將其離心，然後在-70℃下貯存。將試驗白色大鼠禁食過夜，將其斷頭，並收集它們的血樣。然後通過離心那些血樣獲得白色大鼠的血清，然後收集血清，並在-70℃下貯存。通過分離術分離脛骨，並用pH7.4的4％福馬林固定。4)統計學數據和評價每個試驗的結果用均值±標準差表示，其顯著性通過P＜0.05水平下的ANOVA、Duncan多範圍檢驗確定。實驗例1骨組織形態測定為了對上述參考實施例中固定的脛骨進行脫鈣作用，將每個脛骨置於10％硝酸溶液中6小時，然後經過濃度範圍在80％至100％的10種不同濃度的乙醇溶液進行脫水。然後，分別在二甲苯和石蠟中將它包埋2次，用一種切骨微鋸將脛骨近端切成4cm厚的骨片，並用蘇木精-伊紅染色。
在40倍放大率的顯微鏡下觀察上述脛骨近端，應用定量圖象分析系統測定骨小梁的面積後，計算標準面積2×106μm2內的骨小梁面積與此標準面積的比率。骨組織形態測定的結果如下。
人的骨皮質每年更新大約2-3％；相比而言，骨小梁的更新速度較快，每年為25％。因此骨小梁的發育速度可用作一種辨別骨健康狀況的直接而精確的方法，而且它已經廣泛地應用於動物試驗中。在本試驗中，在卵巢摘除術後，將阿侖特羅和骨化三醇單獨給藥或者聯合給藥2個月，脛骨骨小梁顯微鏡觀察結果顯示骨小梁的面積與正常組相比明顯減少(見附圖1)。應用圖像分析儀的實驗組的觀察結果顯示在單用阿侖特羅治療的組、用一種複合藥物治療的組1、2和3中，骨小梁的面積顯著增加，而在單用骨化三醇治療的組中沒有增加(見附圖2)。例如就骨小梁的面積而言，用一種含有阿侖特羅和骨化三醇的複合藥物治療的組顯示了與單用阿侖特羅治療的組相同的結果，而且在分別用一種複合藥物治療的組1、2和3之間沒有差異。實驗實施例2生化試驗所用的試劑是從上述參考實施例中所獲得的那些。1)血清鈣濃度的測定應用Technicon自動分析儀測定血清鈣濃度，結果顯示如下。
單用骨化三醇治療的組中的血清鈣濃度顯著升高，而單用阿侖特羅治療的組中的血清鈣濃度明顯下降。這是因為骨化三醇增加了鈣在腸中的吸收，而阿侖特羅通過減少甲狀旁腺激素抑制了骨吸收，然後阻止骨中鈣釋放至血流中，並抑制骨化三醇[1，25-(OH)2-D3]在腎中的合成，因此減少了腸中鈣的吸收。因此，用複合藥物給藥的組1、2和3中血清鈣的濃度保持在單用骨化三醇組和單用阿侖特羅組的濃度的中間水平，此與所期望的一致(見附圖3)。2)尿中鈣排洩的測定為了研究藥物對血清鈣濃度和所得尿鈣排洩之間關係的影響，用一種鈣試劑盒(Yeongdong藥物有限公司，韓國)測定24小時尿樣的鈣/肌酸濃度比，結果顯示於附圖4中。按照附圖4，用骨化三醇給藥時鈣排洩明顯升高，而用阿侖特羅給藥時未觀察到差異。在用含有骨化三醇和阿侖特羅二者的複合藥物的組1和組3中，鈣排洩量升高，而組2的鈣排洩量保持在與對照組類似的水平上(附圖4)。3)骨質重建指數的測定用Technicon自動分析儀測定血清鹼性磷酸酶的活性水平，並應用RIA方法，用一種試劑盒(OSCA test，Brahams，柏林，德國)測定骨鈣蛋白的濃度。
測定血清骨鈣蛋白的濃度和鹼性磷酸酶的活性，作為骨質重建率的指數。當單用骨化三醇給藥時骨鈣蛋白濃度和鹼性磷酸酶的活性均有輕度升高，而用阿侖特羅給藥時，它們下降，儘管下降水平不明顯(附圖5和6)。在用複合藥物治療的所有組中的骨鈣蛋白濃度未觀察到變化。在用複合藥物治療的組3中鹼性磷酸酶的活性明顯降低，但組1和組2中鹼性磷酸酶的活性沒有顯著的變化，因此提示組1和組2中骨質重建率沒有下降。4)骨吸收指數的測定通過應用一種試劑盒(Osteomark，Ostex，USA)測定24小時尿樣N-端肽(NTx)的濃度，計算尿中NTx/肌酸的比值。N-端肽是I型膠原的副產品。結果顯示由給藥引起的骨吸收的比率沒有明顯的變化(見附圖7)。
從上面實驗例1和2中，複合給藥(0.1μg/kg骨化三醇+1.0mg/kg阿侖特羅)的組2顯示作為一種複合藥劑，它具有最佳的濃度比，這是因為在沒有抑制骨質重建率的情況下，有效地阻止骨質疏鬆症的進展，而且血清鈣濃度和尿鈣排洩保持在正常的水平。因此如在下面實驗實施例3和4所述，按照1998年4月29日發布的韓國食品藥品管理局98-56中所述的標準急性毒性試驗和亞急性毒性試驗，對所得複合藥劑的安全性進行評價，其安全性均得到證實。實驗實施例3含有骨化三醇和阿侖特羅的複合藥劑的急性毒性試驗測定經口服給予實驗動物的含有骨化三醇和阿侖特羅的單劑量複合藥劑的毒性，以評價上述複合藥劑的安全性。在此試驗中，將上述複合藥劑給予Sprague-Dawley白色大鼠，通過LD50、一般狀況、體重和飲食攝入量研究其急性口服毒性，並通過屍體解剖做進一步的測定。餵養條件在由義大利Techniplast公司設計的、位於附屬於韓國Choong-Ang大學藥理學系的動物護理中心的SPF房間中，在23±2℃、相對溼度60±2％、每小時通風13-15次、每天照明12小時(上午7時-下午7時)的條件下，飼養180隻4-5周齡的Sprague-Dawley白色大鼠(90隻雄性和90隻雌性)。將上面的試驗白色大鼠置於籠中，讓其自由地攝入用X線照射消毒的固體飼料(Hanil FeedGreenpia有限公司，韓國)和飲料(高溫消毒的自來水)。樣品試劑的製備稱取貯存於-20℃冰箱內避光容器中的骨化三醇1.0mg，並將其加入一個褐色燒瓶中。當需要時，通過加入一種溶劑(100％乙醇∶MCT＝5∶95)新近製備1.0μg/mL和10μg/mL的溶液，並與已經懸浮了阿侖特羅一鈉的0.5％的CMC-Na水溶液混合。藥量的確定根據人的給藥量，將骨化三醇和阿侖特羅給藥量之間的混合比例確定為0.5μg∶5mg。根據LD50值將動物按比例分為8個不同的組，按照表2所示測定全部9個組，其中包括1個對照組。在確定容積總數為1ml後，進行口服給藥。根據人的體重和白色大鼠的給藥量之間的關係，將骨化三醇和阿侖特羅的最小劑量分別定為0.2μg/kg和2.0mg/kg。
表2.
實驗項目1)LD50的測定為了測定雄性和雌性白色大鼠的LD50值，將實驗動物分為8個藥物治療組和一個對照組，每個組中有10個白色大鼠，並對其進行口服給藥。然後計算給藥後2周內死亡的動物數，應用Brehrens-Karber法計算藥物的LD50值。
用含有骨化三醇和阿侖特羅的複合藥物給藥的白色大鼠的LD50如下。
雄性和雌性白色大鼠的死亡率顯示在下面表3中，這些白色大鼠是用含有骨化三醇和阿侖特羅(1μg/kg∶10mg/kg)的複合藥物單次口服給藥的。
表3.
按照Brehrens-Karber方法計算骨化三醇和阿侖特羅的複合藥物的LD50值。結果顯示雄鼠骨化三醇的LD50為77.5μg/kg，阿侖特羅的LD50為775mg/kg，雌鼠骨化三醇的LD50為75.0μg/kg，阿侖特羅的LD50為750mg/kg。2)正常狀態的觀察對全部試驗白色大鼠每天均進行觀察，觀察期為2周。在給藥後的最初6小時每30分鐘觀察1次，然後從第2天起每天在預定的時間觀察1次。下面是正常狀態下白色大鼠的觀察結果。
在給藥後的最初6小時，給藥大於LD50的雌性白色大鼠組表現出一種特別的行為，即它們用腿搔抓它們的頭，這種行為原來是因為食管胃刺激引起的症狀。然後，那些白色大鼠在給藥後的1小時內表現出抽搐和呼吸困難。在給藥後的2小時內自發病下降，輕度的活動屈曲，保持昏睡狀態，並有呼吸緊張。幾乎所有的骨化三醇和阿侖特羅給藥量分別不少於100μg/kg和1000mg/kg的白色大鼠在給藥後的24小時內死亡。在給藥量為75μg/kg骨化三醇和750mg/kg阿侖特羅的白色大鼠組中，60％的雌鼠和50％的雄鼠死亡，而在給藥量為50μg/kg骨化三醇和500mg/kg阿侖特羅的白色大鼠組中，所有白色大鼠均存活。在給藥量為50μg/kg骨化三醇和500mg/kg阿侖特羅的白色大鼠組中，每10個中有3個表現出上述食管胃刺激症狀，但它們在恢復期的第一天即恢復過來。3)體重和食物攝入量的測定在給藥前和給藥後兩周時間內每天的預定時間測定所有實驗白色大鼠的體重和食物攝入量。結果顯示除了死亡的白色大鼠，在雄鼠和雌鼠的食物攝入量和體重均無顯著性的變化(附圖8-9)。4)屍體解剖從死亡的白色大鼠以及存活白色大鼠用乙醚麻醉處死後獲得肉眼結果。用10％中性福馬林固定裸眼發現的異常器官或組織，然後將它們做成標準組織樣本。然後用蘇木精和伊紅染色而獲得組織結果，所得結果如下。
除了脾臟凝血(hemostasis)外，用含有不少於75μg/kg的骨化三醇和750mg/kg的阿侖特羅的複合藥物治療的白色大鼠屍體解剖沒有異常的發現物。對對照白色大鼠和用含骨化三醇和阿侖特羅的複合藥物治療後14天恢復期完成後的存活白色大鼠進行屍體解剖，除了脾臟輕度腫大外，沒有異常的發現物。用100μg/kg骨化三醇和1000mg/kg阿侖特羅治療後發現死亡的白色大鼠的組織解剖顯示，存在嚴重的脾臟凝血和出血(附圖10)。實驗例4含有骨化三醇和阿侖特羅的複合藥劑的亞急性毒性試驗將5周重複劑量的含有骨化三醇和阿侖特羅的複合藥劑對實驗白色大鼠進行口服給藥，進行亞急性毒性試驗，以評價上述複合藥劑的安全性。在5周重複口服給藥期和2周恢復期，每天對實驗白色大鼠檢測一次。為了評價複合藥劑的亞急性毒性，在用所給的藥物治療後進行諸如正常狀態、體重變化、飲食攝入量、眼科檢查、聽力檢測、尿液試驗、血液學試驗、血液生化試驗和病理學試驗等檢查。實驗動物和餵養條件在實驗例3急性毒性試驗中上述的相同條件下餵養Sprague-Dawley白色大鼠，除了在完成試驗前的頭一天將它們放置於代謝籠中。每個實驗組由20個雄鼠和20個雌鼠組成，並對它們治療5周。在2周的恢復期後，從每個組中選擇10個雄鼠和10個雌鼠進行檢查。樣品藥劑的製備和藥量的測定按照實驗例3急性毒性試驗中所述的相同方法製備樣品藥劑。按照人的給藥量、已經報導的LD50值和已知的在臨床治療和預防骨質疏鬆症中有效的給藥量，測定骨化三醇和阿侖特羅藥量的混合比例為0.5μg∶5mg。通過azetropy 5選擇5個組，其中4個不同的治療組和1個對照組，如表4中所示。
表4.
實驗項目1)死亡檢查沒有觀察到死亡，接受含骨化三醇和阿侖特羅的複合藥物治療的雄鼠和雌鼠均全部存活，不論是在給藥完成時，還是恢復期完成時均存活。2)正常狀態的觀察觀察白色大鼠的正常狀態，(a)在治療期每天3次給藥前、給藥後的即刻以及給藥後2小時；(b)在假期每天2次給藥前、給藥後的即刻，以及(c)在恢復期每天1次。
直到給藥後的第3天才觀察到食管胃刺激症狀和昏睡狀態，但這些症狀在第5天後均消失。其它實驗組的所有動物的正常狀態沒有似乎與給藥相關的特別的變化。3)體重和水攝入量的變化在給藥期和恢復期的每3天測定1次體重。測定7天的累計水攝入量，每周1次；通過這樣估計每個白色大鼠每天的攝入量。結果顯示直到治療期和恢復期結束，在用含骨化三醇和阿侖特羅的複合藥劑治療的所有實驗組中，在體重(附圖11)和水攝入量(附圖10)上沒有明顯變化。4)眼科學屍體解剖在檢查期間對所有實驗白色大鼠進行眼科學屍體解剖，並在試驗的第5周僅對每個組中的5個雄鼠和5個雌鼠進行檢查。當觀察眼外部狀態時，用阿託品滴眼，檢查眼的前房、眼的中間傳導體和眼底。當在第5周沒有觀察到任何與所用藥物有關的變化時，則省略隨後恢復期的檢查。結果顯示在治療期和恢復期結束後，在用骨化三醇和阿侖特羅的複合藥劑治療的所有實驗組中沒有任何明顯的眼科學變化。5)聽力檢測在治療期的第5周對每個實驗組中的10個雄鼠和10個雌鼠，通過Gaidan Boizuru機(大約600Hz)進行Outreflex檢查。當在第5周沒有觀察到任何與所用藥物有關的變化時，則省略隨後恢復期的檢查。結果顯示在治療期和恢復期結束後，在用骨化三醇和阿侖特羅的複合藥劑治療的所有實驗組中沒有任何明顯的聽力改變。6)尿液檢測在治療期的第5周和恢復期的第2周，從每個實驗組中選擇10個雄鼠和10個雌鼠，令其禁食，但允許飲水，然後在禁食4小時後收集它們的尿樣。然後讓它們自由地攝食和飲水，並在自由進食20小時後收集它們的尿樣。分析首份4小時所採集尿樣的白細胞、亞硝酸鹽、尿膽原、pH值、蛋白、酮體、尿糖、潛血、比重、尿膽紅素(AMES尿檢試紙，N-Nultistix SG-LJapan Bayer，Samkong有限公司)、顏色和尿沉澱。20小時獲得的尿樣用於檢測Na、K和Cl(總量測定)。結果顯示在治療期和恢復期結束後，在用骨化三醇和阿侖特羅的複合藥劑治療的所有實驗組中沒有任何有意義的尿液方面的變化，而且它們均在正常值範圍內。7)血液檢測在處死白色大鼠前將它們禁食過夜大約16小時，然後用乙醚麻醉後，沿正中線解剖它們。從腹動脈採集血樣，並將它們貯存在含有抗凝劑(7.5％EDTA-2K)的真空試管中(Bechon Dickinson VacutainerSystems，歐洲英格蘭)。然後分析血樣的紅細胞(RBC)計數(電阻中變化的檢測法)、血紅蛋白量(氰化正鐵血紅蛋白法)、紅細胞壓積(估計RBC計數和平均紅細胞體積)、細胞平均體積、細胞平均血紅蛋白(從血紅蛋白量和紅細胞壓積估計)、血小板計數(電阻中變化的檢測法)(異常自動分析儀Cell-Dyne 3000，Abbot Co.)、網織紅細胞(Brecher法)和白細胞分類計數(May-Giemsa法)。在此，將3.8％枸櫞酸鈉處理的血樣離心(在3,000rpm下離心10分鐘)所得血漿，通過凝血酶原時間(Quick法)，估計上述檢測，所得結果如下。治療期結束時在用骨化三醇和阿侖特羅的複合藥劑治療的所有實驗組中沒有觀察到任何有意義的變化。恢復期結束時在用骨化三醇和阿侖特羅的複合藥劑治療的所有實驗組中沒有觀察到任何有意義的變化。8)血生化檢測按照血液檢測中相同的方法從腹靜脈中採集血樣，並用肝素處理。將血樣離心(在3,000rpm下離心10分鐘)獲得血清，然後分析GPT和GOT(異常UV比率法，異常自動分析儀，CH16，Texas國際公司)、ALP(Bessey-Lowry法)、總膽固醇(CEH-COD-POD法)、總膽紅素、血糖(己糖激酶PD法)、尿素氮(Urea-GL PC法)、無機亞磷(六價鉬酸法)和總蛋白(Biuret法)(異常UV比率法，異常自動分析儀，Monach儀器研究室)。可從Stanbio Laboratory Inc.(Texas，USA)購得上述試驗所用的試劑，其結果如下。治療期結束時用25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅治療的雄性白色大鼠與用5μg/kg骨化三醇和50mg/kg阿侖特羅治療的雄性白色大鼠的GPT活性輕度升高。所有實驗白色大鼠的GPT活性均升高。但是，沒有任何有意義的劑量-依賴性的變化，而且甚至用溶劑治療的對照組的GTP活性水平相對較高，因此提示這種GTP活性的輕度升高與採集血樣時造成的輕度溶血有關。所有雄性和雌性實驗白色大鼠的血糖均輕度升高，但在量上沒有觀察到有意義的依賴性。用溶劑治療的對照組也輕度升高，並且尿液中沒有檢測到尿糖，因此提示血糖輕度升高與飲食無關，而是壓力引起的一過性升高。因此，可從上面的結果得出除了GOT活性和血糖水平的輕度升高外，在實驗組和對照組中均沒有任何與藥物治療相關的有意義的劑量依賴性的改變。恢復期結束時用25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅治療的雄性白色大鼠與用5μg/kg骨化三醇和50mg/kg阿侖特羅治療的雄性白色大鼠的GPT活性在恢復期結束時正常。所有實驗白色大鼠的GOT活性比治療期結束時降低。但是，沒有任何有意義的劑量-依賴性的變化，而且甚至用溶劑治療的對照組的GTP活性水平相對較高，因此提示這種GTP活性的輕度升高與採集血樣時造成的輕度溶血有關。因此，可從上面的結果得出除了與治療期結束時相比，GOT活性和血糖水平輕度升高外，在實驗組和對照組中均沒有任何與藥物治療相關的有意義的劑量依賴性的改變。9)屍體解剖從死亡白色大鼠和所有存活白色大鼠用乙醚麻醉處死後獲得肉眼觀察資料。用10％中性福馬林固定通過肉眼發現的異常器官或組織，然後將它們製備成標準組織樣品。然後用蘇木精染色以獲得組織結果，所得結果如下。在治療期結束時用25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅的複合藥物治療的白色大鼠的屍體解剖顯示，存在脾臟的顯著增生，但用低於上述劑量治療的白色大鼠沒有任何異常的結果。除了脾臟以外，其它組織結果均未表現出與藥物有關的顯著變化。恢復期結束時用25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅的複合藥物治療的白色大鼠的屍體解剖顯示，存在脾臟的顯著增生，但用低於上述劑量治療的白色大鼠沒有任何異常的結果。除了脾臟以外，其它組織結果均未表現出與藥物有關的顯著變化。10)病理檢查一採集好血樣，就通過驅血法將所有實驗白色大鼠處死。通過裸眼觀察所有器官的異常後，切除腦、下丘腦、甲狀腺包括甲狀旁腺、唾液腺(頜下腺和舌下腺)、胸腺、心臟、肺包括支氣管、肝臟、脾臟、腎臟、睪丸、腎上腺、卵巢、前列腺、精囊、子宮和胸骨，並分別稱重。在屍體解剖當天讓實驗白色大鼠禁食，並分別將上述每個器官的相對重量估算為體重的100g。同樣，將脊髓、坐骨神經、胸主動脈、氣管、舌、食管、胃、十二指腸、空腸、迴腸、盲腸、結腸、直腸、胰腺和腸繫膜的異常部分切除，並用含磷酸鹽緩衝劑的10％福馬林固定，用Bouin’s溶液固定腦和脊髓(胸骨和股骨)，並用石蠟包埋。用蘇木精和伊紅將所有實驗組和溶劑對照組的治療期和恢復期白色大鼠的所有組織和器官的標本進行染色，並在顯微鏡下進行觀察。結果顯示沒有任何明顯的與治療藥物有關的變化。實驗例3-4的結論將含有骨化三醇和阿侖特羅的複合藥物口服給予雄性和雌性Sprague-Dawley白色大鼠，骨化三醇和阿侖特羅的混合比為1∶10000，在5周的急性或亞急性毒性試驗期間，或者給藥一次，或者重複給藥。其結果如下。
首先，上述複合藥物的急性毒性試驗的結果如下。
用Brehrens-Karber法計算骨化三醇和阿侖特羅複合藥物的口服給藥的LD50值。結果顯示雄性白色大鼠骨化三醇的LD50為77.5μg/kg，阿侖特羅的LD50為775mg/kg，而雌性白色大鼠骨化三醇的LD50為75.0μg/kg，阿侖特羅的LD50為750mg/kg。當用50μg/kg骨化三醇和500mg/kg阿侖特羅的複合藥物口服治療一次時，所有實驗白色大鼠均存活，並且除了食管胃刺激症狀和昏睡外，沒有觀察到正常狀態的任何異常改變。體重、飲食攝入量和尿檢結果均顯示正常。
口服不少於75μg/kg的骨化三醇和不少於750mg/kg的阿侖特羅的複合藥物而處死的白色大鼠，其屍體解剖顯示，存在嚴重的脾臟凝血和出血，但沒有觀察到其它與藥物治療有關的特殊損害。
其次，上述複合藥物的亞急性毒性試驗的結果如下。在重複藥物治療結束時用25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅的複合藥物重複口服治療5周後，所有實驗白色大鼠均存活，並且其正常狀態、飲食攝入量、眼科檢查、聽力檢查、血液檢查和血液生化檢查均沒有觀察到任何異常改變。
上述白色大鼠屍體解剖顯示，除了脾臟肥大外，其每個器官的重量沒有異常發現，但也觀察到中等水平的局限性肺間隔和輕度脾臟、肝臟、腎臟凝血，以及食管胃黏膜水腫和炎細胞浸潤。但是，在用骨化三醇低於5μg/kg和阿侖特羅低於50mg/kg的低劑量複合藥物治療的實驗組中，以及對照組中，也可觀察到這些損害。因此認為這些損害與治療藥物不相關。在腦、骨髓、性腺和消化腺中沒有任何異常發現。在恢復期結束時用25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅的複合藥物重複口服給藥5周後，在2周恢復期結束時，所有實驗白色大鼠均存活，而且其正常狀態、飲食攝入量、眼科檢查、聽力檢查、血液檢查和血液生化檢查均沒有觀察到任何異常改變。
上述白色大鼠屍體解剖顯示，除了脾臟肥大外，其每個器官的重量沒有異常發現，但也觀察到中等水平的局限性肺間隔和脾臟、肝臟、腎臟中輕度的止血，以及食管胃黏膜水腫和炎細胞浸潤。但是，在用骨化三醇低於5μg/kg和阿侖特羅低於50mg/kg的低劑量的複合藥物治療的實驗組中，以及對照組中，均可觀察到這些損害。因此認為這些損害與治療藥物不相關。觀察到的輕度食管胃炎症不是一種特殊的改變，而被認為是在評價所給治療藥物的毒性試驗中齧齒動物表現的一種可逆的損傷。在腦、骨髓、性腺和消化腺中沒有任何異常發現。
如上所述，將具有混合比例為1∶10000的骨化三醇和阿侖特羅的複合藥物單次口服給藥，其結果顯示骨化三醇和阿侖特羅的LD50分別大於75μg/kg和750mg/kg。因此證明這種藥物是一種毒性低的藥物。用含有25μg/kg骨化三醇和250mg/kg阿侖特羅的複合藥物重複口服給藥5周，在恢復期以及治療期結束時，也沒有造成任何顯著的亞急性毒性，並且考慮到推測的人的劑量(按照人平均體重60kg)僅相當於白色大鼠給藥劑量(即0.5μg/kg骨化三醇和5mg/kg阿侖特羅)的1/3000，因此認為本發明的含有骨化三醇和阿侖特羅的複合藥物是安全的。實驗例5對具有不同的骨化三醇和阿侖特羅混合比例的含有骨化三醇和阿侖特羅的複合藥物進行的試驗1)一種骨化三醇和阿侖特羅的混合物與添加劑例如一種賦形劑的可混性。以某種顯示於下列表5和6中的比例，將賦形劑加入上述骨化三醇和阿侖特羅的混合物(5μg∶50mg)中。
2)然後向1)中所得的混合物中加入5％的水，並在40℃下儲存14天。
通過HPLC(高效液體色譜)對上述混合物的穩定性進行測定，結果顯示於下列表5和6中。
表5.
表6.
上面表5和6結果表明甘露糖醇作為一種賦形劑，聚乙烯吡咯酮作為一種粘合劑，硬脂酸鈣或硬脂酸鎂作為一種潤滑劑，分別在其指定的領域中具有優良的性能。起先，作為抗氧化劑的丁基化羥基甲苯和丁基化羥基苯甲醚，被認為影響骨化三醇的穩定性，但是另外的實驗證實它們只是在分析水平影響骨化三醇，並且考慮到它們僅僅是微量，不會引起任何問題。結果，被加入藥劑中的添加劑選擇如下甘露糖醇作為一種賦形劑，聚乙烯吡咯酮作為一種粘合劑，硬脂酸鈣作為一種潤滑劑，丁基化羥基甲苯和丁基化羥基苯甲醚作為抗氧化劑，十二烷基硫酸鈉作為一種吸收增強劑。製劑實施例將按照本發明的藥劑製備成裸片、腸溶片、顆粒劑、腸溶顆粒劑、膠囊和腸溶膠囊的形式。製劑實施例1-3裸片的製備按照下面表7中所示的組成和含量製備裸片。
首先，將D-甘露糖醇加入由骨化三醇和乙醇組成的混合物中，然後加入乙醇、抗氧化劑和粘合劑。
與製備骨化三醇的步驟分開，將其他成分阿侖特羅、甘露糖醇、吸收增強劑混合，然後向其中加入乙醇和粘合劑。然後，將骨化三醇和阿侖特羅混合，並加入崩解劑和潤滑劑，然後壓片。
表7.
製劑實施例4-6腸溶片的製備除了用腸溶包衣溶液包覆製劑實施例1-3中製備的裸片外，按照與上述製劑實施例1-3中相同的方法製備腸溶片，其組份和含量顯示在下表8中。
表8.
製劑實施例7-9顆粒劑的製備如下列表9所示製備顆粒劑。
首先，將D-甘露糖醇加入一種由骨化三醇和乙醇組成的混合物中，然後加入乙醇、抗氧化劑和一種粘合劑。然後用一種常規的粉碎機將整個混合物粉碎成14-35目大小並在40℃下乾燥以獲得骨化三醇顆粒。
與製備骨化三醇的步驟分開，將其它成分阿侖特羅、甘露糖醇、吸收增強劑混合，然後向上述混合物中再加入乙醇和一種粘合劑。然後用一種常規的粉碎機粉碎成14-35目大小並在40℃下乾燥以獲得阿侖特羅顆粒。然後，將骨化三醇顆粒和阿侖特羅顆粒混合，並加入一種崩解劑和一種潤滑劑，然後壓片。
表9.
製劑實施例10-12腸溶顆粒劑的製備除了用腸溶包衣溶液包覆製劑實施例7-9中製備的顆粒外，按照與上述製劑實施例7-9中相同的方法製備腸溶片，其組份和含量顯示在下表10中。
表10.
製劑實施例13-15膠囊的製備如下列表11所示製備膠囊。
首先，將D-甘露糖醇加入由骨化三醇和乙醇組成的混合物中，然後加入乙醇、抗氧化劑和粘合劑。然後用一種常規的粉碎機將整個混合物粉碎成14-35目大小並在40℃下乾燥以獲得骨化三醇顆粒。
與製備骨化三醇的步驟分開，將其它成分阿侖特羅、甘露糖醇、吸收增強劑混合，然後向上述混合物中再加入乙醇和粘合劑。然後用一種常規的粉碎機粉碎成14-35目大小並在40℃下乾燥以獲得阿侖特羅顆粒。然後，將骨化三醇顆粒和阿侖特羅顆粒混合，並加入一種崩解劑和一種潤滑劑，然後裝入膠囊。
表11.
製劑實施例16-18腸溶膠囊的製備除了用腸溶包衣溶液包覆組份外，按照與上述製劑實施例13-15中相同的方法製備腸溶顆粒劑並最後裝入膠囊，其組份和含量顯示在下表12中。
表12.
實驗例6腸溶片的穩定性試驗將按照製劑實施例5製備的腸溶片，在一種加速條件下(40℃，相對溼度75％)貯存兩個月，並對片劑的穩定性進行檢驗三次，結果顯示於下表13中。
在片劑穩定性的評價中，性質通過裸視觀察評價，通過HPLC驗證。骨化三醇和阿侖特羅的含量也通過HPLC測定。
表13.
顯示於表13的結果表明在室溫和加速條件下，該藥片在持續兩個月的穩定性試驗中均保持穩定。
權利要求
1.一種含有骨化三醇和阿侖特羅作為活性成分的用於治療代謝性骨疾病的藥物組合物，其中所述的組合物中每1重量份的骨化三醇含有1,000-50,000重量份的阿侖特羅。
2.按照權利要求1的用於治療代謝性骨疾病的藥物組合物，其中所述的代謝性骨疾病包括骨質疏鬆症、佩吉特病、脊柱炎、骨軟化症、腎性骨營養不良、甲狀旁腺機能亢進和甲狀旁腺功能減退。
3.按照權利要求1的用於治療代謝性骨疾病的藥物組合物，其中所述的組合物可以製備成裸片、腸溶片、顆粒劑、腸溶顆粒劑、膠囊和腸溶膠囊的形式。
4.按照權利要求1的用於治療代謝性骨疾病的藥物組合物，其中所述的組合物每劑量單位含有0.1-5.0μg骨化三醇和1-50mg阿侖特羅。
5.按照權利要求1的用於治療代謝性骨疾病的藥物組合物，其中作為一種吸收增強劑使用的添加劑為十二烷基硫酸鈉，它佔藥物組合物總重量的0.01～10重量％。
6.一種含有骨化三醇和阿侖特羅作為活性成分的用於治療代謝性骨疾病的藥物組合物的製備方法，其中所述的方法包括a)一種通過一系列步驟獲得骨化三醇顆粒的方法，該步驟由向骨化三醇和乙醇的混合物中添加甘露糖醇；向上述的混合物中添加乙醇、抗氧化劑和一種粘合劑；將上述混合物粉碎成14-35目大小並乾燥上述的粉碎混合物組成；b)一種通過一系列步驟獲得阿侖特羅顆粒的方法，該步驟由將甘露g糖醇、一種吸收增強劑和阿侖特羅混合；向上述的混合物中添加乙醇和一種粘合劑；將上述混合物粉碎成14-35目大小並乾燥上述的粉碎混合物組成；c)一種按1∶1重量份的混合比例混合從步驟a)中獲得的骨化三醇顆粒和從步驟b)中獲得的阿侖特羅顆粒，然後向上述的混合物中添加一種崩解劑和一種潤滑劑，最後將所得的混合物壓片的方法。
7.按照權利要求6的用於治療代謝性骨疾病藥物組合物的製備方法，其中所述的藥物組合物中每1重量份的骨化三醇含有1,000-50,000重量份的阿侖特羅。
8.按照權利要求6的用於治療代謝性骨疾病藥物組合物的製備方法，其中所述的骨化三醇和所述的阿侖特羅用甘露糖醇作為一種賦形劑，比例分別為50-60∶40-60，以使甘露糖醇佔藥物組合物總重量的10-98重量％。
全文摘要
本發明涉及一種用於治療代謝性骨疾病的藥物組合物及其製備方法，特別涉及一種用於治療代謝性疾病的改良的藥物組合物及其製備方法，其中所述的組合物被製成一種複合藥劑，該藥劑含有作為兩種主要活性成分的以能夠產生最大協同治療作用的最佳混合比例混合的骨化三醇(它能夠減少脊柱骨折率和增加骨密度)和阿侖特羅(一種骨吸收抑制劑)，以及適量的其他添加劑，例如一種阿侖特羅的吸收增強劑。因此，按照本發明的藥物組合物，可以抑制當單獨給予骨化三醇時引起的血鈣過多，由於骨化三醇的存在可以補償由阿侖特羅引起的對骨質重建活性的抑制，並且可以改善與通常的給藥困難以及食道中的副作用有關的藥物依從性。因此，有效地預防了骨質疏鬆症的發生。
文檔編號A61K47/10GK1420777SQ00815823
公開日2003年5月28日 申請日期2000年10月20日 優先權日1999年10月20日
發明者姜勝安, 李京姬, 郭忠實, 金昌種, 李龍五 申請人:柳柳產業株式會社