鹽生杜氏藻(6－4)光裂合酶及其編碼序列的製作方法
2023-05-08 06:40:36
專利名稱：鹽生杜氏藻(6－4)光裂合酶及其編碼序列的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物學領域，具體地說，本發明涉及新的編碼鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)耐鹽相關蛋白-(6-4)光裂合酶的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和製備。具體地說，本發明的多肽是一種新的耐鹽相關蛋白。
背景技術：
目前，世界人口不斷增加，而可耕種土地卻不斷減少。然而，地球上還有許多因鹽鹼化而無法有效利用的土地資源。為了有效地利用這些鹽鹼化的土地資源，人們一直在尋找既適應生長而具有較高經濟價值的植物品種。然而，迄今為止沒有十分合適的植物品種。
另一種開發耐鹽鹼植物的方法是對已有的植物品種，尤其是具有較高經濟價值的植物品種進行改良。然而，傳統的植物改良方法費時、費力、並且缺乏針對性。
為了有效地、針對性地改善植物品種的耐鹽性，本領域迫切需要開發與耐鹽性有關的基因和蛋白。
此外，隨著世界工業的迅猛發展，大量溫室氣體的釋放導致全球變暖，特別是氯氟烴(氟利昂，chlorofluorocarbons，CFCs)等化學物質的大量使用，大氣平流層臭氧濃度日益下降，地面太陽輻射(特別是UV-B，280-320nm)的增強。近地表太陽UV-B輻射強度的增加對生活在地球生物圈中的各種生物以及它們的生存環境的質量都將產生深刻的影響。UV-B輻射對人類、動物的直接影響主要體現在眼和皮膚這些易受太陽照射的部位。而對植物則主要是光合作用系統的傷害，因此太陽UV-B輻射對植物的危害大於對人體健康的影響。為了有效和針對性地提高生物體的抗紫外線特性，迫切需要開發抗紫外線相關的基因與蛋白。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種新的鹽生杜氏藻耐鹽相關蛋白(6-4)光裂合酶以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途，尤其是在提高植物耐鹽性方面的用途。
鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)屬綠藻門、綠藻綱、團藻目、多毛藻科、杜氏藻屬，主要生長於高鹽度水體中。細胞形態通常為卵圓形，當外界滲透壓發生變化時，其形態可變為球形至紡錘形。它具有兩條等長的鞭毛和一個杯狀葉綠體，在葉綠體的外緣可積累大量的β-胡蘿蔔素小滴，是細胞呈橙紅色。細胞無細胞壁，具有由糖蛋白形成的包被。鹽生杜氏藻與衣藻(Chlamydomonas)具有較近的親緣關係。本發明人通過多年對鹽生杜氏藻的研究，發現了鹽生杜氏藻中與耐鹽性有關的蛋白-(6-4)光裂合酶，在此基礎上完成了本發明。
在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的(6-4)光裂合酶(或簡稱為「光裂合酶」)，該酶源自鹽生杜氏藻的，它包含具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該酶選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(6-4)光裂合酶功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，該酶是具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼分離的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％相同性(a)編碼上述鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-1800位的序列；(b)具有SEQ IDNO1中1-1803位的序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了製備鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶。
在本發明的第五方面，提供了與上述的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶特異性結合的抗體。還提供了可用於檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續的15-1803個核苷酸。
在本發明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶活性的化合物，以及抑制鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的表達的化合物。還提供了篩選和/或製備這些化合物的方法。
在本發明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在(6-4)光裂合酶的方法，它包括將樣品與(6-4)光裂合酶的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在(6-4)光裂合酶。
在本發明的第八方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。例如本發明多肽可被用於篩選促進鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶活性的激動劑，或者篩選抑制鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶活性的拮抗劑、或者被用於肽指紋圖譜鑑定。本發明的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的編碼序列或其片段，可被作為引物用於PCR擴增反應，或者作為探針用於雜交反應，或者用於製造基因晶片或微陣列。
在本發明的第九方面，提供了一種產生轉基因植物的方法，該方法可改善植物耐鹽性和/或抗紫外性，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有(6-4)光裂合酶DNA編碼序列，所述的(6-4)光裂合酶選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(6-4)光裂合酶功能的由(a)衍生的多肽。
(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使(6-4)光裂合酶DNA編碼序列轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入(6-4)光裂合酶DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖1是GST-(6-4)光裂合酶融合蛋白的表達電泳圖。其中泳道M是蛋白質分子量標準，泳道1是JM109同條件IPTG誘導4小時；泳道2為pGEX-4T-1的轉化菌同條件誘導4小時；泳道3為pGEX-4T-1/6-4轉化菌無誘導；泳道4為pGEX-4T-1/6-4轉化菌誘導2小時；泳道5為pGEX-4T-1/6-4轉化菌誘導4小時。
具體實施例方式
在本發明中，術語「(6-4)光裂合酶[(6-4)Photolyase-Like Protein]」、「(6-4)光裂合酶多肽」或「耐鹽相關蛋白(6-4)光裂合酶」可互換使用，都指具有鹽生杜氏藻耐鹽相關蛋白(6-4)光裂合酶胺基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的耐鹽相關蛋白(6-4)光裂合酶。
在本發明中，「光裂合酶」指「(6-4)光裂合酶」，除非特別指出。
(6-4)光裂合酶催化的反應如下
如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，「分離的(6-4)光裂合酶或多肽」是指(6-4)光裂合酶基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化(6-4)光裂合酶。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
在本發明中，術語「鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶」指具有鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的可溶性片段。通常，該片段具有鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶或多肽的類似物。這些類似物與天然鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，「鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶保守性變異多肽」指與SEQ IDNO2的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。
表1
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼(6-4)光裂合酶的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或(6-4)光裂合酶編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的(6-4)光裂合酶。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法。對於轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得耐鹽性提高的植物。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶或多肽有多方面的用途。例如用於篩選促進或對抗(6-4)光裂合酶功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶篩選多肽庫可用於尋找有價值的能抑制或刺激鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。較佳地，指那些能與鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的分子，也包括那些並不影響鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備。本發明的各類抗體可以利用鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的抗體可用於檢測樣品中的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶。例如通過定量檢測鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶，並利用(6-4)光裂合酶與鹽濃度的相關性，可以確定鹽生杜氏藻生產環境中鹽濃度。
多克隆抗體的生產可用鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。
本發明還涉及定量和定位檢測鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶水平的測試方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶水平，可用於解釋鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶在耐鹽性方面重要性。
一種檢測檢測樣品中是否存在(6-4)光裂合酶的方法是利用(6-4)光裂合酶的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與(6-4)光裂合酶特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在(6-4)光裂合酶。
本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析。用(6-4)光裂合酶特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測(6-4)光裂合酶的轉錄產物。
在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示胺基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從鹽生杜氏藻cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1803個鹼基，其開放讀框位於1-1800位，編碼全長為600個胺基酸的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶(SEQ ID NO2)。(6-4)光裂合酶為改善植物的耐鹽性和耐紫外性提供了新的途徑，因而具有巨大的應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的克隆1.鹽生杜氏藻的採集(Collection)鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)購自武漢水生生物研究所藻種庫。
2.Poly A+RNA的分離(Poly A+RNA isolation)用Trizol試劑(Gibco，NY，USA)提取鹽生杜氏藻的總RNA。用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量。使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)提供的試劑盒操作說明書抽取鹽生杜氏藻的mRNA。
3.鹽生杜氏藻cDNA文庫的構建(Cloning of Full-length cDNA)使用Smart cDNA Library Construction Kit(ClonTech)提供的試劑盒說明書，以λTriplEX2為載體，構建鹽生杜氏藻的cDNA噬菌體文庫。
4.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)通過對大量不同物種(包括如擬南芥、果蠅、非洲爪蟾等)的(6-4)光裂合酶進行比較，確定了部分胺基酸保守序列。據此設計引物，採用RACE方法(Gibco試劑盒，NY，USA)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)使用引物，以Poly A+RNA為模板，進行RT-PCR擴增以寡核苷酸5′ATGGCAAGGGAGGCAGGAGTGGA 3′(SEQ ID NO3)為正向引物；寡核苷酸5′GAGGGACATCGGTGGCTGTGAAT 3′(SEQ ID NO4)為反向引物，以Poly A+RNA為模板，進行RT-PCR擴增，擴增條件為94℃5分鐘，隨後94℃30秒、55℃30秒、72℃ 1分鐘進行35個循環，最後以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，獲得的片段長度約為0.5kb，回收片段連接到購買的T-easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，採用終止螢光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序，測得一個506bp序列。
將該序列及其編碼蛋白質序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+Swissprot+Superdate+PIR資料庫進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與擬南芥的(6-4)光裂合酶基因有較高的同源性，證實了引物的正確。
(2).RACE根據以上序列分析設計5』RACE引物5』GGTGCCTCTTTGAAGCCCATCTCCT 3』(SEQ ID NO5)；3』RACE引物5』ATTCACAGCCACCGATGTCCCTC 3』(SEQ ID NO6)；使用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)，按照操作手冊進行，得到鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的5』和3』端序列。
(3).PCR擴增得到(6-4)光裂合酶基因編碼區(過程同(1))。
在拼接得到全長(包括完整的開放讀框)的基礎上，進一步設計引物以寡核苷酸CGCGGATCCATGCTGAGGTGCGCA(SEQ ID NO7)為正向引物；寡核苷酸CCGCTCGAGTTACTGGCACCTTTTCTT(SEQ ID NO8)為反向引物，以用常規方法抽提的鹽生杜氏藻總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，然後按常規方法以PCR擴增產物進行克隆、測序。結果驗證了鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶蛋白的全長編碼序列的正確性。
鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因全長序列如SEQ ID NO1所示，其中讀框位置是1-1800位。
atgctgaggt gcgcacaacc taagtatgca cctttgaagc gccaggcctt caaccagaaa60ttgaataggc ttgtggcagc agcccgcacc cctagcaaat catcttcaac atcaaggatg120gcctcaacat caagtggaca gcaaggccgc tctatcttgt ggtttagaaa gggcctgcgg180ctccacgaca accctgctct cagagatgcc tgcacagggt ctgctgctgt gttccctatc240ttcatcattg atccgtactt ccttcaaaaa tccaataaca aggttggtgt aaaccgctat300cagttccttt tggagagctt gagcgacctg aattcgagcc tgactagtct tggctcccaa360ctcctggttt tgagaggtac cccagaggag gtgataccaa gagttctgcg cgactggagc420atcaagaagc tctgctatga gattgacacg gagccatacg ctaaggcccg agatgctcgt480gtagatgaca tggcaaggga ggcaggagtg gaggtcaaaa agcactggag ccacacacta540tatgatacag acatgctagt gcgagaaaac aaagggaagg caccactgac catgcaggcg600tttgagaagt tggtagaccg tgttggccac cccctcaccg ctctgcctgc ccccacggct660cgccttcctc cggttgatgt cagcctgcca ggcatcaagg acgcagaagt gggagtcccc720acgtggcagg agatgggctt caaagaggca cccacagcta tcttcaaggg cggagagacg780gaggccctga agaggctgga acattacatg aaagacacaa agtgggyggc ctcgtttgag840aagccttcca ccgacccctc agccttcaca gagccctcca ccactgcgct gtccccatac900ctcaagtttg gatgcctgtc tgcacgcttc tttcaccaaa ggctgctgga tgtgtaccgc960cttcacccca agcattcaca gccaccgatg tccctccgag ggcagctgct gtggcgagag1020ttcttctata cattgggctc acacacccca aactttgacc gcatagcagg caaccccatc1080tgccgacaga ttacttggga cacaaaccca gccctgctca aggcttggcg agatggggcc1140actggttatc catggattga tgctgcgatg acccaactga gggaatgggg ctggatgcac1200cacctggcac gccactctgt ggcttgcttc ctcaccaggg gggacctgta cctgagctgg1260
gagtctggca aggaggtgtt cgaggagttg ctcctggatg cagactattt cattaatgca1320gcaaactgga tgtggctgag tgccagcgcg ttctttgcac aatactttag agtgtacagc1380cctgttgtgt ttggcaagaa gtatgacaag gagggcgcct acatccggaa gttcttgcca1440gtgctgaagg acatgcccgc aaagtacatc tatgagccat ggactgcgcc gaaagaagtc1500cagcagcgcg ccaactgtat cataggccgg gactaccctg ctcccattgt ggaccatgca1560gttgcaagca aagaatgcat agccagaatg ggagctgcgt acaaagccac aaacaccggg1620ggcagtgcag gcaaagcctc ccctgcaaaa gcggcctctt ctggtgacgc cggcacttct1680gcatcagcag gagcgccatc ttcgtccaag aagaccacag gcaagcgggc agcatctgca1740gaccaaggtg gcaagcgtca aaagactctg gaggagtcga tgacgaagaa aaggtgccag1800taa 1803(SEQ ID NO1)鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因編碼一個由600個胺基酸構成(6-4)光裂合酶，其序列如SEQ ID NO2所示。
MLRCAQPKYA PLKSQAFNQK LNRLVAAART PSKSSSTSRM ASTSSGQQGR SILWFRKGLR60LHDNPALRDA CTGSAAVFPI FIIDPYFLQK SNNKVGVNRY QFLLESLSDL NSSLTSLGSQ120LLVLRGTPEE VIPRVLRDWS IKKLCYEIDT EPYAKARDAR VDDMAREAGV EVKKHWSHTL180YDTDMLVREN KGKAPLTMQA FEKLVDRVGH PLTALPAPTA RLPPVDVSLP GIKDAEVGVP240TWQEMGFKEA PTAIFKGGET EALKRLEHYM KDTKWVASFE KPSTDPSAFT EPSTTALSPY300LKFGCLSARF FHQRLLDVYR LHPKHSQPPM SLRGQLLWRE FFYTLGSHTP NFDRIAGNPI360CRQITWDTNP ALLKAWRDGA TGYPWIDAAM TQLREWGWMH RLARHSVACF LTRGDLYLSW420ESGKEVFEEL LLDADYFINA ANWMWLSASA FFAQYFRVYS PVVFGKKYDK EGAYIRKFLP480VLKDMPAKYI YEPWTAPKEV QQRANCIIGR DYPAPIVDHA VASKECIARM GAAYKATNTG540GSAGKASPAK AASSGDAGTS ASAGAPSSSK KTTGKRAASA DQGGKRQKTL EESMTKKRCQ600實施例2鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶蛋白的結構和功能將鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因全長序列及其編碼蛋白用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank cdstranslations+PDB+SwissProt+PIR資料庫進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現在核酸資料庫中沒有明顯的相似序列。只是在1243bp到1332bp這90個核苷酸序列總能擊中光裂合酶/藍光受體家族的成員。在胺基酸水平上，它與擬南芥(Arabidopsis thaliana)的(6-4)光裂合酶mRNA全編碼序列(GenBankAccession No.X66412)有52％的相同性，它與非洲爪蟾(Xenopus laevis)的(6-4)光裂合酶蛋白(GenBank Accession No.BAA97126)有53％的相同性。
將鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶蛋白的胺基酸在blocks資料庫(http//www.blocks.fhcrc.org)中檢索結構域，發現在胺基酸序列中存在(6-4)光裂合酶蛋白的所有模塊，對應模塊號為IPB002081A、IPB002081B、IPBO02081C、IPBO02081D、IPBO02081E、IPBO02081F，分布如下
IPB006050A 54-64IPB006050B 145-158IPB006050C 282-309IPB006050D 386-434IPB006050E 457-481在該胺基酸序列中存在(6-4)光裂合酶蛋白功能模塊，因此可預見其具有(6-4)光裂合酶蛋白的相應功能。
實施例3鹽生杜氏藻cDNA文庫大規模測序和表達譜晶片的構建(High ThroughputSequencing of cDNA Library and Construction of Expression Microarray)對所得的鹽生杜氏藻cDNA文庫中的克隆進行序列測定，用所測得的靶序列構建表達譜晶片。將測序所得的克隆子溶解於3×SSC溶液中，使用Cartesian公司的Cartesian 7500點樣儀及TeleChem公司的矽烷化玻片，按公司提供的使用說明書操作。點樣後玻片經水合、乾燥、UV交連，再分別用SDS、水處理10分鐘，晾乾備用。
實施例4鹽生杜氏藻表達譜晶片的篩選(Screening of the Expression Microarry)使用0.5mol/l、1.5mol/l、4.5mol/l濃度的NaCl溶液分別處理鹽生杜氏藻2小時後，提取不同鹽濃度處理後的鹽生杜氏藻mRNA，分別用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP標記，與表達譜晶片雜交，用General Scanning公司的ScanArray 3000掃描晶片，用Axon公司的Genepix 3.01軟體分析螢光信號強度。
表達譜晶片雜交結果顯示，有若干基因的表達量與鹽生杜氏藻的生長鹽濃度呈高度相關。其中，(6-4)光裂合酶基因為其中一條。其具體數據分為三組第一組為cy5(4M)、cy3(1.5M)標記的；第二組為cy5(4M)、cy3(0.5M)標記的；第三組為cy5(1.5M)、cy3(0.5M)標記的。三組標記螢光信號強度的自然對數1n(cy5/cy3)的平均值為0.4，這說明隨著鹽濃度的變化，該基因的表達差異在1.5倍左右。
綜上所述，(6-4)光裂合酶為一未見報導的新型耐鹽相關蛋白。
實施例5鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因表達載體的構建根據鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的全長編碼序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物(對應於SEQ ID NO1中最前20bp和最後20bp)，經PCR擴增後，將鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因cDNA克隆至中間載體pBluescript(購自Stratagene公司)，進一步克隆到雙元表達載體pBI 121(購自Clontech公司)，在保證閱讀框的前提下鑑定好的表達載體，在將其轉入農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中，獲得陽性克隆，用於轉化模式植物菸草。
實施例6利用葉盤法轉化菸草按如下步驟轉化菸草(1)用無菌牙籤挑取YEB選擇平板上的實施例5中製備的農桿菌陽性克隆，接種於2M LYEB液體(Sm+，Kan+)，28℃，200rpm振蕩培養24-36小時；(2)室溫下4,000g離心10分鐘；(3)棄上清，菌體用1/2 MS液體培養基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600在0.5左右；(4)取生長兩周左右的菸草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1cm2見方的小葉片；(5)將葉片放入製備好的菌液中，浸泡2-5分鐘，在無菌濾紙上吸乾菌液；(6)把經侵染的葉片放於MS培養基上，28℃暗培養48小時；(7)將葉片轉到愈傷培養基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+羧卞青黴素250mg/L)上，25-28℃光照下培養，7-15天可見愈傷組織的形成；(8)約20天後可見分化芽長出，帶芽長大後，切下，置於生根培養基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L)上進行生根培養，2-7天左右生根；待根系發達後，將植株取出，用無菌水洗淨附著的固體培養基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯後再取下玻璃罩，溫室中培養。
初步結果表明，轉入鹽生杜氏藻藻烯醇酶基因的菸草的耐鹽性略高於對照菸草。
實施例7鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因表達載體的構建根據鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的全長編碼序列，設計擴增出完整編碼讀框的引物，正向引物為
CGCGGATCCATGCTGAGGTGCGCA(SEQ ID NO7)反向引物為CCGCTCGAGTTACTGGCACCTTTTCTT(SEQ ID NO8)並在正反引物上分別引入BamH I以及Xho I限制性酶切位點。鹽生杜氏藻藻烯醇酶基因的全長基因經PCR擴增後和酶切後，將鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶cDNA克隆至中間載體(pBluescript)，進一步克隆到原核表達載體pEGX-4T-1(購自ANERSHAM PHARMACIA公司)，在保證閱讀框正確的前提下鑑定表達載體，在將其轉入大腸桿菌(JM109)感受態細胞中，形成表達載體pEGX-4T-1/6-4，挑選克隆子，提取質粒進行BamHI、Xhol雙酶切驗證。
實施例8鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的功能鑑定(1)融合蛋白的誘導表達及SDS-PAGE檢測對實施例7中獲得的轉化帶pEGX-4T-1/6-4的大腸桿菌，按1％體積接種到新的含氨苄的LB培養基中，37攝氏度劇烈震蕩培養3～5h，至其OD600為0.6時，加IPTG至終濃度為1mmol/l，再培養1～4h，每隔1h分別取樣1ml離心，40μl無菌水重懸，加入等體積樣品緩衝液，沸水煮5min，冷卻後取20微升進行8％的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，並同時設置大腸桿菌JM109空白對照和pGEX-4T-1轉化菌對照。
融合蛋白的誘導表達及SDS-PAGE檢測用IPTG誘導無轉化的大腸桿菌JM109、轉化了載體pGEX-4T-1和轉化了載體pGEX-4T-1/6-4的大腸桿菌，它們與無誘導的含質粒pGEX-4T-1/6-4的大腸桿菌的總蛋白的SDS-PAGE電泳結果如圖。其中含質粒pGEX-4T-1/6-4的大腸桿菌經過IPTG誘導後，其細胞裂解物在對應於約90KDa處有一明顯的GST-(6-4)光裂合酶條帶，分子量與預測值相符(圖1)。
(2)鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的功能鑑定各挑取對照菌(含質粒pGEX-4T-1)和陽性菌(含質粒pGEX-4T-1/6-4的大腸桿菌)的單菌落，分別在2ml含抗生素(Amp)的LB液體培養基中37攝氏度培養過夜。吸取10ul培養物加到2ml新鮮的LB(含Amp)中37攝氏度繼續培養3～4小時後，再加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續培養2～3小時。在2個無菌的1.5ml的離心管中加入1ml無菌的LB培養基，分別吸取10ul培養物稀釋到管中，振蕩混勻。吸取100ul的稀釋液塗布在含Amp的LB固體培養基上，每個樣品塗布3個培養皿，分別取1個作為對照。將剩餘的4個培養皿，放置在紫外光下照射(打開培養皿的蓋子)，時間為30秒。照射完畢後，立即蓋上蓋子，每個樣品取出1個用牛皮紙包嚴，不要透光，暗處37攝氏度培養過夜。剩餘的2個和對照一起放到光下，37攝氏度培養過夜。計算菌落數，根據對照計算存活菌落數及存活率。
結果使得含有(6-4)光裂合酶基因表達載體的菌種具有比不含此質粒的菌種在紫外線下具有更高的存活率(約提高50％)，這表明分離出的(6-4)光裂合酶具有修復DNA的活性。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110四川川大光耀生物工程有限公司120鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶及其編碼序列1300372141608170PatentIn version 3.121012111803212DNA213鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)4001atgctgaggt gcgcacaacc taagtatgca cctttgaagc gccaggcctt caaccagaaa60ttgaataggc ttgtggcagc agcccgcacc cctagcaaat catcttcaac atcaaggatg120gcctcaacat caagtggaca gcaaggccgc tctatcttgt ggtttagaaa gggcctgcgg180ctccacgaca accctgctct cagagatgcc tgcacagggt ctgctgctgt gttccctatc240ttcatcattg atccgtactt ccttcaaaaa tccaataaca aggttggtgt aaaccgctat300cagttccttt tggagagctt gagcgacctg aattcgagcc tgactagtct tggctcccaa360ctcctggttt tgagaggtac cccagaggag gtgataccaa gagttctgcg cgactggagc420atcaagaagc tctgctatga gattgacacg gagccatacg ctaaggcccg agatgctcgt480gtagatgaca tggcaaggga ggcaggagtg gaggtcaaaa agcactggag ccacacacta540tatgatacag acatgctagt gcgagaaaac aaagggaagg caccactgac catgcaggcg600tttgagaagt tggtagaccg tgttggccac cccctcaccg ctctgcctgc ccccacggct660cgccttcctc cggttgatgt cagcctgcca ggcatcaagg acgcagaagt gggagtcccc720acgtggcagg agatgggctt caaagaggca cccacagcta tcttcaaggg cggagagacg780gaggccctga agaggctgga acattacatg aaagacacaa agtgggyggc ctcgtttgag840aagccttcca ccgacccctc agccttcaca gagccctcca ccactgcgct gtccccatac900ctcaagtttg gatgcctgtc tgcacgcttc tttcaccaaa ggctgctgga tgtgtaccgc960
cttcacccca agcattcaca gccaccgatg tccctccgag ggcagctgct gtggcgagag 1020ttcttctata cattgggctc acacacccca aactttgacc gcatagcagg caaccccatc 1080tgccgacaga ttacttggga cacaaaccca gccctgctca aggcttggcg agatggggcc 1140actggttatc catggattga tgctgcgatg acccaactga gggaatgggg ctggatgcac 1200cacctggcac gccactctgt ggcttgcttc ctcaccaggg gggacctgta cctgagctgg 1260gagtctggca aggaggtgtt cgaggagttg ctcctggatg cagactattt cattaatgca 1320gcaaactgga tgtggctgag tgccagcgcg ttctttgcac aatactttag agtgtacagc 1380cctgttgtgt ttggcaagaa gtatgacaag gagggcgcct acatccggaa gttcttgcca 1440gtgctgaagg acatgcccgc aaagtacatc tatgagccat ggactgcgcc gaaagaagtc 1500cagcagcgcg ccaactgtat cataggccgg gactaccctg ctcccattgt ggaccatgca 1560gttgcaagca aagaatgcat agccagaatg ggagctgcgt acaaagccac aaacaccggg 1620ggcagtgcag gcaaagcctc ccctgcaaaa gcggcctctt ctggtgacgc cggcacttct 1680gcatcagcag gagcgccatc ttcgtccaag aagaccacag gcaagcgggc agcatctgca 1740gaccaaggtg gcaagcgtca aaagactctg gaggagtcga tgacgaagaa aaggtgccag 1800taa 18032102211600212PRT213鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)4002Met Leu Arg Cys Ala Gln Pro Lys Tyr Ala Pro Leu Lys Ser Gln Ala1 5 10 15Phe Asn Gln Lys Leu Asn Arg Leu Val Ala Ala Ala Arg Thr Pro Ser20 25 30Lys Ser Ser Ser Thr Ser Arg Met Ala Ser Thr Ser Ser Gly Gln Gln35 40 45
Gly Arg Ser Ile Leu Trp Phe Arg Lys Gly Leu Arg Leu His Asp Asn50 55 60Pro Ala Leu Arg Asp Ala Cys Thr Gly Ser Ala Ala Val Phe Pro Ile65 70 75 80Phe Ile Ile Asp Pro Tyr Phe Leu Gln Lys Ser Asn Asn Lys Val Gly85 90 95Val Asn Arg Tyr Gln Phe Leu Leu Glu Ser Leu Ser Asp Leu Asn Ser100105 110Ser Leu Thr Ser Leu Gly Ser Gln Leu Leu Val Leu Arg Gly Thr Pro115120 125Glu Glu Val Ile Pro Arg Val Leu Arg Asp Trp Ser Ile Lys Lys Leu130135 140Cys Tyr Glu Ile Asp Thr Glu Pro Tyr Ala Lys Ala Arg Asp Ala Arg145150 155 160Val Asp Asp Met Ala Arg Glu Ala Gly Val Glu Val Lys Lys His Trp165170 175Ser His Thr Leu Tyr Asp Thr Asp Met Leu Val Arg Glu Asn Lys Gly180185 190Lys Ala Pro Leu Thr Met Gln Ala Phe Glu Lys Leu Val Asp Arg Val195200 205Gly His Pro Leu Thr Ala Leu Pro Ala Pro Thr Ala Arg Leu Pro Pro210215 220Val Asp Val Ser Leu Pro Gly Ile Lys Asp Ala Glu Val Gly Val Pro225230 235 240
Thr Trp Gln Glu Met Gly Phe Lys Glu Ala Pro Thr Ala Ile Phe Lys245 250 255Gly Gly Glu Thr Glu Ala Leu Lys Arg Leu Glu His Tyr Met Lys Asp260 265 270Thr Lys Trp Val Ala Ser Phe Glu Lys Pro Ser Thr Asp Pro Ser Ala275 280 285Phe Thr Glu Pro Ser Thr Thr Ala Leu Ser Pro Tyr Leu Lys Phe Gly290 295 300Cys Leu Ser Ala Arg Phe Phe His Gln Arg Leu Leu Asp Val Tyr Arg305 310 315 320Leu His Pro Lys His Ser Gln Pro Pro Met Ser Leu Arg Gly Gln Leu325 330 335Leu Trp Arg Glu Phe Phe Tyr Thr Leu Gly Ser His Thr Pro Asn Phe340 345 350Asp Arg Ile Ala Gly Asn Pro Ile Cys Arg Gln Ile Thr Trp Asp Thr355 360 365Asn Pro Ala Leu Leu Lys Ala Trp Arg Asp Gly Ala Thr Gly Tyr Pro370 375 380Trp Ile Asp Ala Ala Met Thr Gln Leu Arg Glu Trp Gly Trp Met His385 390 395 400Arg Leu Ala Arg His Ser Val Ala Cys Phe Leu Thr Arg Gly Asp Leu405 410 415Tyr Leu Ser Trp Glu Ser Gly Lys Glu Val Phe Glu Glu Leu Leu Leu420 425 430
Asp Ala Asp Tyr Phe Ile Asn Ala Ala Asn Trp Met Trp Leu Ser Ala435440 445Ser Ala Phe Phe Ala Gln Tyr Phe Arg Val Tyr Ser Pro Val Val Phe450455 460Gly Lys Lys Tyr Asp Lys Glu Gly Ala Tyr Ile Arg Lys Phe Leu Pro465470 475 480Val Leu Lys Asp Met Pro Ala Lys Tyr Ile Tyr Glu Pro Trp Thr Ala485490 495Pro Lys Glu Val Gln Gln Arg Ala Asn Cys Ile Ile Gly Arg Asp Tyr500505 510Pro Ala Pro Ile Val Asp His Ala Val Ala Ser Lys Glu Cys Ile Ala515520 525Arg Met Gly Ala Ala Tyr Lys Ala Thr Asn Thr Gly Gly Ser Ala Gly530535 540Lys Ala Ser Pro Ala Lys Ala Ala Ser Ser Gly Asp Ala Gly Thr Ser545550 555 560Ala Ser Ala Gly Ala Pro Ser Ser Ser Lys Lys Thr Thr Gly Lys Arg565570 575Ala Ala Ser Ala Asp Gln Gly Gly Lys Arg Gln Lys Thr Leu Glu Glu580585 590Ser Met Thr Lys Lys Arg Cys Gln595600210321123212DNA213人工序列
220
221misc_feature223引物4003atggcaaggg aggcaggagt gga23210421123212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4004gagggacatc ggtggctgtg aat23210521125212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4005ggtgcctctt tgaagcccat ctcct 25210621123212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4006attcacagcc accgatgtcc ctc23
210721124212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4007cgcggatcca tgctgaggtg cgca 24210821127212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4008ccgctcgagt tactggcacc ttttctt2權利要求
1.一種分離的鹽生杜氏藻光裂合酶，其特徵在於，該酶選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有光裂合酶功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權利要求1所述的酶，其特徵在於，該光裂合酶是具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求1所述的鹽生杜氏藻光裂合酶的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示胺基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-1800位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1803位的序列。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出鹽生杜氏藻光裂合酶。
9.一種改善植物耐鹽性的方法，其特徵在於，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有光裂合酶DNA編碼序列，所述的光裂合酶選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有光裂合酶功能的由(a)衍生的多肽。(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使光裂合酶DNA編碼序列轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入光裂合酶DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，該光裂合酶是具有SEQ IDNO2胺基酸序列的多肽。
全文摘要
本發明提供了一種新的耐鹽相關蛋白－鹽生杜氏藻(6－4)光裂合酶，編碼(6－4)光裂合酶的多核苷酸和經重組技術產生這種(6－4)光裂合酶的方法。本發明還公開了編碼這種(6－4)光裂合酶的多核苷酸的用途。本發明還公開了此(6－4)光裂合酶用於改善植物耐鹽性和抗紫外性的方法。
文檔編號A01H1/06GK1624120SQ20031010902
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月3日 優先權日2003年12月3日
發明者曹毅, 蔣彥, 楊滔, 曾昌耀 申請人:四川川大光耀生物工程有限公司