包含γδT細胞的淋巴細胞系、其組合物及生產方法

2023-05-08 04:44:36 4

包含γδT細胞的淋巴細胞系、其組合物及生產方法
【專利摘要】本發明涉及包含γδT細胞的淋巴細胞細胞系、其組合物及生產方法，以及醫學用途，即用於醫學中，即用於癌症免疫療法中。該細胞系包含表達功能性天然細胞毒性受體（NCR）的人外周血Vδ1+γδT細胞的樣品。這些Vδ1+NCR+T淋巴細胞可以直接介導白血病細胞系和慢性淋巴細胞白血病患者瘤細胞的殺傷。本發明顯示，當採用γδTCR激動劑和γc-家族細胞因子有規律地體外或離體刺激時，人Vδ1+NCR+T細胞可以從總γδ外周血淋巴細胞(PBL)分化和擴充。這種亞類令人驚訝地表達NKp30、NKp44和NKp46，以及高水平的粒酶B，其與高度增強的針對淋巴樣白血病的細胞毒性相關。
【專利說明】包含Y S T細胞的淋巴細胞系、其組合物及生產方法
[0001]本發明的【技術領域】
[0002]本發明涉及包含Y 6 T細胞的淋巴細胞系、其組合物及生產方法，以及醫學用途，即用於醫學中，也就是用於癌症免疫療法中。
[0003]背景
[0004]腫瘤在擁有高度複雜的免疫系統的宿主中形成，所述免疫系統包括能夠識別和摧毀轉化細胞的各種淋巴細胞亞類。現在廣泛接受的是，儘管淋巴細胞可以持續偵查腫瘤形成，但是癌細胞形成了逃避免疫監視的分子策略，所述分子策略在宿主免疫系統的壓力下被競爭性地選擇。這種稱作「癌症免疫編輯」的動態過程被認為構成癌症免疫療法的主要障礙。 [0005]在多種免疫逃避機制當中，最近顯示白血病和淋巴瘤原代樣品經常下調非經典的MHC (主要組織相容性複合物)蛋白ULBPl，所述ULBPl對表達反受體NKG2D的Y S T-細胞識別血液腫瘤至關重要(Lanca, T.等人，「The MHC class Ib protein ULBPlis anonredundant determinant of leukemia/lymphoma susceptibility to gammadeltaT-cell cytotoxicity」，Bloodll5:2407-2411;2010)。
[0006]y 6 T細胞是佔據1-10%健康個體外周血淋巴細胞(PBL)並且能夠靶向實驗室中所測試的大部分血液腫瘤細胞系的天然樣淋巴細胞。然而，已證實許多淋巴樣白血病原代樣品對充分活化的V Y 9V S 2T-細胞(Y 6 PBL的優勢亞類)有抗性(Lanca，T.等人，「TheMHC class Ib protein ULBPlis a nonredundant determinant of leukemia/lymphomasusceptibility to gammadelta T-cell cytotoxicity，，，Blood 115:2407-2411, 2010 ；Gomes, A.Q.等人，「Identification of a panel of ten cell surface protein antigensassociated with immunotargeting of leukemias and lymphomas by peripheralblood gammadelta T cells」，Haematologica95:1397-1404，2010)。另外，涉及體內施用V Y 9V 6 2T細胞的激活物的臨床試驗已經顯示有限的成功，客觀響應僅限於10-33%的血液瘤或實體瘤患者。由於未曾報導過客觀響應，因此甚至更適宜的是涉及過繼轉移活化/擴充的V 6 2+細胞的試驗的結果。實際上，當重複注射入患者時，單純離體擴充腫瘤在體內試圖逃避其監視的自體V 6 2+T細胞可以被判定為治療作用甚微。
[0007]癌症免疫療法依賴於細胞毒性淋巴細胞識別腫瘤細胞。Y S T細胞是在各種動物腫瘤模型中發揮至關重要作用的MHC非限制性殺傷淋巴細胞群體。儘管如此，已顯示了大比例的人血液腫瘤對用特定激動劑活化的Y 6外周血淋巴細胞(PBL)有抗性，其中所述的特定激動劑針對高度優勢的V Y 9V S 2T細胞受體(TCR)。這可能構成對當前Y 6 -T細胞介導的免疫療法的重要限制。
[0008]因此，至關重要的是研究這樣的策略，所述策略賦予Y S T細胞以額外的識別手段以探測抵抗體內存在的天然組分的腫瘤。
[0009]天然細胞毒性受體由A.Moretta和合作者在十多年前鑑定，並且顯示在天然殺傷(NK)細胞的抗腫瘤功能中發揮關鍵性協同作用。實際上，NKp30和NKp46被公認為是兩種最特異的NK細胞標記。[0010]von Li I ienfeld-Toal, Μ.，J.Nattermann 等人撰寫的文獻(2006)."Activatedgammadelta T cells express the natural cytotoxicity receptor naturalkiller p44and show cytotoxic activity against myeloma cells."Clin ExpImmunoll44(3):528-533公開了 NK受體在外周血y δ T淋巴細胞上的表達。然而，公開的Y S T細胞不同於本發明中所述的那些。與本發明相反，該文獻也揭示ΝΚρ30不在這類
YST細胞中表達。其中一些差異是:
[0011]?處理(IFN-Y，TNF-a +抗 CD3 單克隆抗體+IL-1e+IL-2+IL-15)；
[0012].Y δΤ細胞的表型(ΝΚρ30_和ΝΚρ46_ ;另外，62%的Y δ T細胞屬於V δ 2+亞型；
[0013].少於 20% 的 Y δ T 細胞是 CD56+ ；
[0014].少於20%的Y δ T細胞是CD8+ ；
[0015].ΝΚρ44的表達水平不受Y δ TCR/⑶3複合物的刺激作用調節(因此，涉及在那些細胞上誘導ΝΚρ44表達的不同分子機制)
[0016]該文獻描述了表達ΝΚρ44的外周血Y δ T細胞。ΝΚρ44是有功能的並且參與腫瘤細胞(骨髓瘤細胞)的識別和消除。然而，僅8±7%的Y δΤ細胞表達ΝΚρ44，並且大部分的(62%) Y δ T細胞屬V δ 2+亞型(它們是V δ 1-)。ΝΚρ30和ΝΚρ46不由Y δ T細胞表達，並且少於20%的這些細胞是⑶8+或⑶56+。
[0017]因此，所述的Y δ T細胞系完全不同於我們鑑定的Y δ T細胞系:通常在我們的細胞系中多於95%的Y δΤ細胞屬於νδ 1+亞型，並且高百分比的這些νδ 1+Υ δΤ細胞(一般多於30%)表達有功能的ΝΚρ44。重要地，ΝΚρ44顯示與ΝΚρ30發揮協同作用，以大大增強識別和殺傷腫瘤細胞的能力(圖5Β)。NCR之間的這種合作對獲得所需的效果(消除癌疾病)至關重要，但其並不存在於先前鑑定的ΝΚρ44+y δ T細胞中。
[0018]由Rey, J.，C.Veuillen 等人撰寫的文獻(2009)."Natural killer andgammadelta T cells in haematological malignancies: enhancing the immuneeffectors."Trends Mol Medl5 (6): 275-284 公開 NKG2D 受體在 NK 細胞上和 Y δ T 細胞上的共同表達。該文獻也宣稱Y S T細胞的擴充和活化可以產生抗腫瘤反應。然而，與本發明相反，這些Y δ細胞是ΝΚρ30-和ΝΚρ46'
[0019]文獻W000/44893 (Palmetto Richland Memorial Hos)公開一種基於施用基本上純化的Y ST淋巴細胞來治療白血病的方法。該方法包括產生淋巴細胞活化及其擴充。主要差異是:
[0020].處理(平板結合的固定化抗TCR抗體+照射的「飼養」腫瘤B細胞)；
[0021].y δ T 細胞(NKp30\ NKp44\ NKp46\ CD8)。
[0022]文獻W02011/053750(埃默裡大學)公開了一種減少患者中癌症的方法，所述方法包括步驟:分離細胞毒細胞群體如Y S T細胞；施用治療藥和所述細胞毒細胞。其與本發明的主要差異在於Y ST細胞經基因修飾而抵抗化療藥。
[0023]概述
[0024]本發明涉及外周血淋巴細胞系，所述外周血淋巴細胞系包含表達功能性天然細胞毒性受體(NCR)的νδ1+y δΤ細胞或由其組成。在一個更優選的實施方案中，所述天然細胞毒性受體包括ΝΚρ30或由其組成。
[0025]在一個更優選的實施方案中，所公開的細胞系還包含V δ 2+Y δ T細胞。[0026]在公開的細胞系的另一個更優選的實施方案中，所述天然細胞毒性受體可以還包括NKp44、NKp46或其混合物。
[0027]在公開的細胞系的另一個優選的實施方案中，該細胞系可以表達粒酶B。
[0028]所公開的主題還包括具有所述細胞系的組合物。在一個優選實施方案中，該組合物是可注射的。在一個優選實施方案中，所述可注射組合物包含由多於80% (即多於80%、85%、90%、95%)表達功能性天然細胞毒性受體的功能性V δ 1+ δ T細胞組成的細胞群體，更優選地，所述天然細胞毒性受體包括ΝΚρ30或由其組成，並且其中該組合物包含多於I億個表達功能性天然細胞毒性受體的νδ 1+ δΤ細胞。優選地，該組合物也包含可藥用物質或載體，以及更優選地，穩定劑，即如人血清白蛋白。所述細胞優選地是自體的，也就是說，源自相同生物製備物(或來自相同的供體)。更優選地，它們通過一種方法如通過公開的主題所描述的方法獲得。
[0029]所公開主題的另一個方面是包含本發明中公開的細胞系的細胞的組合物在醫學中的用途。
[0030]在一個更優選的實施方案中，本發明中公開的組合物可以用於自體或異源過繼細胞療法、腫瘤或癌症治療、腫瘤或癌症免疫療法和/或白血病治療中，或用於治療急性淋巴母細胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴細胞白血病、多發性骨髓瘤、Burkitt淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、或皮膚黑色素瘤，等等。
[0031]在一個更優選的實施方案中，本發明中公開的組合物可以用於治療病毒性感染。即，當所治療的病毒來自皰疫病毒科(Herpesviridae)或逆轉錄病毒科(Retroviridae)之
時，等等。
[0032]所公開的主題還包括產生所述細胞系的方法，所述方法括分離Y SPBL。在一個優選實施方案中，起始樣品可以是包括外周血樣品的血液或其級分，所述級分包括暗黃層細胞、單個核細胞和低密度單個核細胞。所述細胞可以使用本領域已知的技術如密度梯度離心，從起始血液樣品獲得。總Y S PBL可以採用磁標記的抗TCR Y δ +抗體藉助陽性選擇或通過耗盡/消除TCR δ (-1)細胞進行分離。Υ δ PBL可以維持在任何適合的哺乳動物細胞培養基如RPMI1640或MDM中。
[0033]所公開的主題還包括在Y STCR激動劑存在下、優選地通過有規律添加(更優選地連續添加)所述激動劑(其優選地是可溶或固定的)並且在至少一種Y C-細胞因子存在下，優選地通過有規律添加(更優選地連續添加)所述細胞因子或多種細胞因子，在適當的培養基中培育這些細胞的方法。將所述Y S TCR激動劑和Y C-細胞因子在培養時並且還在整個培養時期自始至終(優選地每3-6日)添加至所述細胞培養物，從而Y STCR激動劑和Y C-細胞因子在所述培養物中的濃度通常總是大於零。
[0034]在一個優選實施方案中，可以實施所述Y δ TCR激動劑和Y C-細胞因子的添加直到至少40%、更優選地至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、95%的細胞表達天然細胞毒性受體。在一個優選實施方案中，可以實施所述Y S TCR激動劑和Y C-細胞因子的添加直到實現多於五千萬個、多於一億個、多於兩億個有活力和有功能的表達天然細胞毒性受體的細胞，即天然細胞毒性受體包括ΝΚρ30或由其組成。
[0035]在所公開的方法的一個更優選的實施方案中，可以實施所述Y STCR激動劑和YC-細胞因子的添加直到至少40%、更優選地至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、95%、100%的細胞表達NKp30。 [0036]在所公開的方法的其他優選實施方案中，所述Y STCR激動劑可以是任何可溶性或固定化的能夠激活、刺激或觸發在全部νδ 1+Y SPBL中表達的Y STCR/⑶3受體複合體的分子或化合物，包括但不限於植物凝集素(包括植物血凝素-ΡΗΑ)、抗CD3單克隆抗體(包括0KT3mAb)、抗y δ TCR單克隆抗體或其混合物。可以使用針對V δ 1+ y δ TCR的其他激動劑抗體。術語「抗體」包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段、單鏈抗體、單鏈可變片段和重組產生的結合配偶物。更優選地，Y STCR激動劑濃度的範圍可以在0.01-1OOyg/ml之間、甚至更優選地在1-5 μ g/ml之間變動。
[0037]在所公開的方法的一個更優選的實施方案中，所述「Y C-細胞因子」意指細胞因子的常見細胞因子受體Y鏈家族，所述細胞因子優選地是白介素，即IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-21或其混合物，等等。所用的白介素可以是人或動物源的，優選地是人源的。它可以是野生型蛋白或任何具有生物活性的片段或變體，也就是說，能夠在本發明方法的條件下結合其受體並且誘導Y ST細胞的活化。更優選地，所述細胞因子可以處於可溶性形式、與另一種分子(如例如肽、多肽或生物活性蛋白)融合或與之複合。優選地，使用人重組Yc細胞因子。更優選地，白介素濃度的範圍可以在l-10000U/mL之間，甚至更優選地在100-1000U/mL之間變動。
[0038]在所公開的方法的其他優選實施方案中，所述Y δ TCR激動劑和Y C-細胞因子的有規律添加可以進行2-60日、更優選地在9-25日之間、甚至更優選地在10-15日之間，SP
11、12、13、14 日進行。
[0039]發明概述
[0040]本發明描述了包含Y δ T細胞的外周血淋巴細胞系、其組合物及生產方法，所述細胞系優選地表達ΝΚρ30、ΝΚρ44和ΝΚρ46，其用於醫學，即用於癌症免疫療法中。
[0041]本發明公開了表達天然細胞毒性受體(NCR)的νδ2(_)νδ1+Υ STOL的新亞類，所述新亞類直接介導殺傷白血病細胞系和慢性淋巴細胞白血病患者的瘤細胞。已顯示NCR+V δ I+T細胞可以在採用Y C-細胞因子和泛TCR激動劑刺激時，藉助需要功能性ΡΙ-3Κ/AKT信號傳導的過程，從總Y SPBL中分化並擴充。令人驚訝地，這種亞類穩定地表達ΝΚρ30、ΝΚρ44和ΝΚρ46，以及高水平的粒酶B，所述粒酶B以增強的針對淋巴樣白血病細胞的細胞毒性結合。特異的功能獲得和功能喪失實驗表明，ΝΚρ30和ΝΚρ44在TCR非依賴性白血病細胞識別中發揮非冗餘和協同作用，但是ΝΚρ46不是如此。因此，NCR+V δ I+T細胞構成用於人癌症過繼細胞免疫療法的誘導性和特化的殺傷淋巴細胞群體。
[0042]附圖簡述
[0043]以下圖提供說明本說明書的優選實施方案，其不應當被視為限制發明範圍。
[0044]圖la、lb、Ic-用泛T細胞促分裂原活化的Y δ PBL培養物的增強的抗白血病細胞毒性。(A) y δ外周血淋巴細胞(Y 5PBL)從健康志願者外周血經MACS分選(左小圖)，並且用HMB-PP/IL-2或PHA/IL-2刺激4_19日。通過流式細胞術針對⑶69上調(中部小圖；將新鮮分離的對照細胞中的水平加陰影表示)和CFSE稀釋物(右小圖；點線指示初始CFSE水平)評價活化。(B-C)預活化(持續14日，如A中那樣)的Y δ PBL與DDAOse-標記的白血病細胞共孵育3小時。使用流式細胞術通過膜聯蛋白-V染色評價腫瘤細胞溶解。(B)6個不同供體對Bvl73白血病細胞系的代表性結果。百分比指膜聯蛋白-V+腫瘤細胞。基礎腫瘤細胞凋亡(在不存在Y S PBL的情況下)〈5%。(C)6位不同供體與4個白血病靶細胞系的結果匯總。誤差線代表SD(n=6，*p〈0.05 ;**p〈0.01)。(D)在新鮮分離、HMB-PP/IL-2-活化和PHA/IL-2-活化的Y δ PBL中GzmBmRNA水平的實時PCR定量。這個圖中的數據是具有相似結果的2-3個獨立實驗的代表。
[0045]圖2a、2b、2c_誘導用泛T細胞促分裂原活化的Y δ PBL中的天然細胞毒性受體表達。將Y SPBL如圖1中所述那樣培養4-19日，並且通過流式細胞術分析各種NK受體的表面表達。(A)在源自6位獨立健康供體的用HMB-PP/IL-2 (灰色)或PHA/IL-2 (黑色)活化的10 H培養物中NKG2D、2B4和DNAM-1的結果。誤差線代表SD(n=6 ；p>0.05)。(B)NKp30在(A)的相同培養物中的表達。FACS圖對應於源自3位獨立供體的培養物。百分比指ΝΚρ30+ SPBL0圖7中提供同種型對照染色。(C-D)在新鮮分離、HMB-PP/IL-2-活化和PHA/IL-2-活化的 δ PBL 中 Nkp44 (C)和 Nkp46 (D)mRNA 水平的實時 PCR 定量。(E)在(A)中所述的培養物中NKp30+細胞的百分比演進，分析至多到第19日。誤差線代表SD(n=5)。(F)在總Y SPBL中或從PHA/IL-2-活化的y SPBL培養物(如B中)中經FACS分選(>99%純)的ΝΚρ30Η δ PBL中ΝΚρ30表達的誘導。細胞用PHA/IL-2刺激14日。這個圖中的數據是具有相似結果的2-4個獨立實驗的代表。 [0046]圖3a、3b_天然細胞毒性受體在正增殖的νδ I+T細胞上選擇性表達。(A)將
YS PBL用CFSE標記和如圖1中所述那樣或在不存在T細胞促分裂原的情況下(即，單獨的IL-2)培養。在培養7日之後對CFSE稀釋物和V δ 2TCR表達進行流式細胞術分析。(B)與PHA/IL-2 —起培養至多到19日的總 δ PBL當中V δ 1+或V δ 2+細胞的百分比。誤差線代表SD(n=3)。(C)PHA/IL-2-活化的 δ PBL亞類中的NKp30表達。將V δ 1+或V δ 2+細胞從外周血經FACS分選，用CFSE標記並且與PHA/IL-2 —起培養7日。百分比指每次細胞分裂內的ΝΚρ30+細胞(根據CFSE水平並且由豎直矩形指示)。(D)在PHA/IL-2刺激19日後的V S I+T細胞中ΝΚρ30、ΝΚρ44和ΝΚρ46的表達。也顯示了同種型mAb對照染色。這個圖中的數據是具有相似結果的2-3個獨立實驗的代表。
[0047]圖4a，4b_AKT依賴性Y c細胞因子和TCR信號誘導V δ I+T細胞中的ΝΚρ30表達。(A-B)在單獨或與PHA或0ΚΤ3(抗⑶3mAb)組合的IL-2或IL-15存在下7日後，在來自
Yδ PBL培養物的預設門的V δ I+T細胞上ΝΚρ30表達的流式細胞術分析。(C)阻斷性抗TCRy SmAb對PHA/IL-2活化的 δ PBL中ΝΚρ30誘導的影響。帶陰影的灰色是7-日對照培養物中的預設門的ΝΚρ30+細胞。(D)化學抑制劑LY294002和U0126對PHA/IL-2活化的、用CFSE預標記的Y SPBL中ΝΚρ30誘導的影響。這個圖中的數據是具有相似結果的2-3個獨立實驗的代表。
[0048]圖5_ΝΚρ30和ΝΚρ44介導NCR+ Y δ PBL的腫瘤細胞殺傷。(A)使用特異性單克隆抗體，在經PHA/IL-2活化並擴充的Y SPBL對Fe Y R+P815靶細胞系的4小時51Cr釋放重定向殺傷測定法(以2:1效應子:靶比率)中對ΝΚρ30，ΝΚρ44和ΝΚρ46的功能性評價。數據表述為一式三份進行的8個獨立實驗的平均值和SD (*p〈0.05，#*p〈0.001 ;ns=統計上不顯著)。(B)針對NKp30、NKp44和NKp46 (或對照IgGl同種型對照)的阻斷性抗體對Y δ PBL殺傷白血病細胞系Molt-4測定法的影響，其中所述Y SPBL經PHA/IL-2活化並擴充。在指出的情況下，還添加阻斷性抗TCR Y SmAb(TCR)。通過如圖1中所述的膜聯蛋白-V染色評估腫瘤細胞死亡。誤差線代表SD(n=3, **p〈0.01 ;***p〈0.001)。
[0049]圖6a，6b-NCR+ Y δ PBL是被賦予針對原發性淋巴細胞白血病的增強細胞毒性的穩定亞類。ΝΚρ30+和ΝΚρ30Η gamma δ PBL從14日的PHA/IL-2活化的培養物經FACS分選。(A)純化群體中ΝΚρ30表達的再分析。⑶與新鮮分離的Y SPBL相比，在ΝΚρ30Η或ΝΚρ30+gamma δΤ細胞中Nkp44 (左)mRNA水平和Nkp46 (右)mRNA水平的實時PCR定量。誤差線代表SD (n=3)。
(C)在IL-2存在下培養分選的ΝΚρ30+gamma δ PBL0 14日後分析ΝΚρ30、ΝΚρ44和ΝΚρ46表達。(D)在採用白血病細胞系Βν173的殺傷測定法(如圖1中)中使用ΝΚρ30(_)或ΝΚρ30+gamma δ T細胞，或新鮮分離的Y δ PBL0通過膜聯蛋白-V染色評價腫瘤細胞死亡(η=3, *ρ〈0.05)。
(E)在新鮮分離的ΝΚρ30Η或ΝΚρ30+gamma δ T細胞中GzmB mRNA水平的實時PCR定量。誤差線代表SD(n=3)。(F-G)在採用、δ PBL的殺傷測定法(如圖1中)中使用的5份原發性B-細胞慢性淋巴細胞白血病樣品的代表性圖(F)和數據匯總(G)，其中所述Y SPBL獲自6位不同供體並且經HMB-PP/IL-2或PHA/IL-2活化。來自HMB-PP/IL-2-活化的培養物的NCRh gamma δ PBL (灰色棒)與來自PHA/IL-2-活化的培養物的NCRw gamma δ PBL (黑色棒)比較。誤差線代表 SD (η=6, *ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;_ρ〈0.001)。
[0050]圖7-PHA/IL-2活化的Y δ PBL中針對ΝΚρ30的同種型對照染色。在來自圖1-2中所述的PBL培養物的設門TCR gamma δ +細胞中的流式細胞術IgGl染色。數據是6個獨立實驗的代表。
[0051]圖8-Vy9VS 2PBL並不偏好地易感於PHA誘導的凋亡。如圖1和圖3所述，將
YSPBL隨HMB-PP/IL-2或PHA/IL-2—起培養。在培養7日之後，通過流式細胞術分析在預設門的V δ 2+細胞內部的凋亡性膜聯蛋白-V+細胞。
[0052]圖9-用PHA/IL-2活化的Y δ PBL培養物中V δ I+T細胞富集。如圖1和圖3所述，將Y δ PBL與PHA/IL-2 —起培養19日，並且通過流式細胞術對V δ ITCR和⑶3表達進行分析。
[0053]圖10-新鮮分離的Y SPBL不表達ΝΚρ30。從兩位健康供體新鮮分離的Y δ PBL中針對ΝΚρ30和V δ ITCR表達的流式細胞術數據。數據是15位不同健康供體的代表。
[0054]圖1l-TCR加上IL-2信號誘導了增殖νδ I+T細胞中的ΝΚρ30表達。V δ I+T細胞中的ΝΚρ30表達，所述V δ I+T細胞從外周血經FACS分選，用CFSE標記並且隨同或不隨同0KT3mAb和IL-2 —起培養7日。
[0055]圖12-NCR+V δ I+PBL中增加的CD56表達。V δ I+PBL中CD56和CD27表達的流式細胞術數據，所述V δ I+PBL經PHA/IL-2活化19日並且對ΝΚρ30Η或ΝΚρ30+細胞設門。
[0056]圖13_B7h6在大部分淋巴樣白血病樣品中不過量表達。在(A)急性淋巴母細胞性白血病細胞系；(B)T細胞急性淋巴母細胞性白血病患者樣品；(C)B-細胞慢性淋巴細胞白血病患者樣品上，對B7h6表達的實時定量PCR數據。健康新鮮的PBMC作為參考顯示(短劃線)。將B7h6水平針對持家基因Gusb和Psmb6歸一化並且以任意單位表述。誤差線代表三次重複測量的SD。
[0057]圖14-PHA/IL-2活化的培養物中的Y δ PBL的表型。如圖1和圖3所述，將Y δ PBL隨PHA/IL-2 —起培養19日，並且通過流式細胞術對(A) V δ ITCR和⑶3表達；(B)⑶I Ic和⑶8表達進行分析。PHA/IL-2活化的細胞以實線描述。
[0058]圖15-ΝΚρ30+Y SPBL針對來自多種組織來源的癌細胞具有高度細胞毒性。gammaδ外周血淋巴細胞(Y δ PBL)從健康志願者外周血經MACS分選，並且用PHA/IL-2刺激2周。將ΝΚρ30+ y δ PBL進一步經FACS-分選，並且在採用以下一系列腫瘤細胞系的3小時殺傷測定法中使用:急性淋巴母細胞性白血病-ALL(RS4-11)、急性髓細胞白血病-AML(HL-60)、慢性髓性白血病-CML(K562)、慢性淋巴細胞白血病-CLL(MEC-1)、骨髓瘤(KMMl)、Burkitt淋巴瘤(RAJI)、濾泡淋巴瘤(D0HH2)、乳腺癌(MDA231)、肺癌(NC1-H520)、前列腺癌(PC3)、結腸癌(HCT116)、膀胱癌(UM-UC-3)、腎細胞癌(VMRC-RCW)、皮膚黑色素瘤(MEL-1)。通過膜聯蛋白-V染色評價腫瘤細胞死亡(n=3，*p〈0.05)。
[0059]發明詳述
[0060]公開的主題涉及了包含Y δ T細胞的外周血淋巴細胞細胞系、其組合物及生產方法以及在醫學中(即在癌症治療中)的用途。這些Y S T細胞表達V δ I+T細胞受體(TCR)和功能性天然細胞毒性受體(NCR)。NCR在V δ I+T細胞中被由Y C-細胞因子和V δ I+TCR協同提供的AKT依賴性信號所上調。
[0061]本發明公開了新的V δ I+PBL亞類，所述亞類能夠靶向對充分活化的VY 9V δ 2PBL有高度抗性的血液學腫瘤。這種VS1+群體所擁有的特化殺傷細胞功能歸因於天然細胞毒性受體的誘導表達，所述天然細胞毒性受體已經大多被視為NK特異性標記。已顯示，雖然V5 1+或V δ 2+細胞均不以組成型方式表達NCR，但這些NCR可以在V δ 1+細胞中被y。-家族細胞因子和V δ I+TCR協同提供的AKT依賴性信號所選擇性上調。還顯示ΝΚρ30和ΝΚρ44均在NCR+V δ I+PBL中有功能，並且對它們增強的淋巴細胞性白血病細胞靶向作用作出關鍵貢獻。[0062]公開的主題涉及Y c細胞因子和促有絲分裂(PHA或0ΚΤ3)刺激物的組合在可大小選擇的V δ I+PBL亞類中誘導NCR表達，其中所述V δ I+PBL亞類被賦予增加的針對血液學腫瘤的溶細胞活性。雖然PHA是非生理性的T細胞促分裂原，但是已證實通過在V δ I+PBL上交聯TCR/CD3複合物，完全模擬了它對NCR誘導的作用。因此，NCR誘導與TCR介導的
Vδ I+細胞增殖耦合，同時還需要Y c細胞因子信號。
[0063]在誘導性NCR當中，基於以下事實而言，ΝΚρ30對V δ I+T細胞的抗腫瘤活性是最重要的:表達ΝΚρ30的細胞比例(圖3D);當ΝΚρ30觸發時V δ I+T細胞的細胞毒性有更多增強(圖5Α);和當阻斷ΝΚρ30時，白血病細胞殺死顯著減少(圖5Β)。儘管如此，ΝΚρ44(而不是ΝΚρ46)也在NCR+V δ I+細胞中有功能(圖5Α)，並且似乎與ΝΚρ30協同用於增強的腫瘤靶向作用(圖5Β)。
[0064]ΝΚρ30和ΝΚρ44均已經涉及人NK細胞對病毒感染細胞的識別。對腫瘤而言，抗體介導的阻斷實驗展示在骨髓瘤和黑色素瘤細胞靶向方面的重要作用。另外，缺少NCR表達已經在臨床上與AML患者中的不良存活關聯起來了。
[0065]V δ I+T細胞是胎兒/早期生活期間的優勢Y δ T細胞亞類，此時它們已經能夠響應於病毒性感染。在成人中，V δ I+T細胞擴充已經與CMV感染、HIV-1感染和上皮源來源或造血來源的腫瘤相關。過繼轉移活化的VS δΤ細胞的一個誘人方面在於，它們可以顯示特別良好的組織歸巢能力，因為與它們的循環型V δ 2+對應物相反，V δ I+細胞是偏好組織結合的淋巴細胞(Groh，Spies, Sciencel998)。有趣地，黏膜表面處V δ I+T細胞的豐度已經被歸因於IL-15，後者誘導控制TCR基因重排的染色質修飾。
[0066]本發明描述了 NCR+V δ 1+細胞能夠靶向原發性淋巴樣白血病細胞，考慮到先前已經報導V δ Τ細胞是原發性白血病或淋巴瘤細胞的無效殺傷者，這是特別有意義的。本發明也公開了在體外PHA處理時V δ I+T細胞(在 δ PBL當中)的偏好擴充(圖3Β)。因為這不歸因於優勢V δ 2+對應物的選擇性凋亡(圖8)，所以它肯定源自接收PHA依賴性TCR信號時V δ 1+細胞的增殖優勢(圖3Α-Β)。先前觀察到V δ I+T細胞表達明顯更高水平的⑶27輔助受體(與νδ 2+細胞相比時)。在人類和小鼠中，CD27刺激增強細胞周期蛋白D2表達並且促進Y δT細胞在體外和體內增殖。
[0067]本發明描述了 νδ 1+細胞上NCR表達的有效誘導取決於TCR刺激；在TCR不存在的情況下，Y。細胞因子可以僅實現非常溫和的NCR表達上調(圖4Α-Β)。因此，TCR信號位於的NCR+V δ I+淋巴細胞的NCR介導腫瘤細胞識別上遊。 [0068]從臨床角度，本發明描述了離體誘導NCR的方法，並且描述了一種非常可行的將大量細胞擴充並注射至患者中的方式。可以通過施用低劑量IL-2(這似乎足以支持NCR表達)，潛在地在體內維持這些細胞的活化狀態。
[0069]PHA/IL-2活化的ΝΚρ30+ Y δ T細胞偏好地表達⑶Ilc和⑶8。⑶Ilc是通常在其他淋巴細胞中表達的黏附分子，並且已經顯示參與腫瘤細胞的識別。
[0070]材料和方法
[0071]人外周血Y δ T細胞的分離。外周血採自匿名健康志願者，用PBS (優選地，Invitrogen Gibco)稀釋1:1(ν/ν),並且優選地在Ficol_Paque(優選地，Histopaque-1077, Sigma)以體積比 1:3 (I 份 ficol 對 3 份稀釋的血液)在 1500rpm和 25°C時離心30分鐘。將含有單個核細胞的界面收集並(在PBS中)洗滌，並且藉助正選擇(優選地，採用FITC-標記的抗TCRy§抗體)或藉助負選擇(採用生物素標記抗體的混合物；優選地，Miltenyi Biotec),通過磁性細胞分選法分離Y δ T細胞(至高於95%的純度)。
[0072]細胞培養物。將分離的Y δ PBL以IO6個細胞/ml在37°C，5%C02於含有RPMI1640的圓底96孔平板中培養，所述RPMI1640具有2mM L-穀氨醯胺(優選地，InvitrogenGibco),補充有 10% 胎牛血清(優選地,Invitrogen Gibco)、ImM 丙酮酸鈉(InvitrogenGibco), 50mg/ml 青黴素 / 鏈黴素(優選地，Invitrogen Gibco)。在 100U/mL rhIL-2 (優選地，Roche Applied Science)存在時，在具有或沒有IOnM HMB-PP(4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯；優選地,Echelon Biosciences)和1μ g/ml植物凝集素(PHA ;優選地，Sigma-Aldrich)的情況下擴充細胞。洗滌細胞並且每5_6日更換培養基培養基。為研究 NKp30 表達的誘導，將 Y 3PBL 在 100U/mL rhIL2 (優選地,Roche Applied Science)、
Iμ g/ml 可溶性抗 CD3 抗體(優選地，eBioscience,克隆 OKT3)和 20ng/ml rhIL-15 (優選地，Biolegend)存在或不存下培養。為了 TCR阻斷，將新鮮分離的 δ PBL用CFSE標記，並且隨後與1:20稀釋於補充有I μ g/ml PHA和100U/mL rhIL2的完全培養基中的抗TCRy δ (優選地，Beckman Coulter，克隆IMMU510)孵育7日。為研究信號轉導化學抑制劑的作用，將MEK抑制劑U0126和P1-3K抑制劑LY294002 (優選地，二者均來自Calbiochem)以IOmM添加，持續2-小時孵育時間，並且隨後在含有100U/mL rhIL2和I μ g/ml PHA的培養物中維持7日。
[0073]流式細胞術細胞分選。為了基於NKp30和νδ I+TCR的表達分選Y SPBL，將源自PHA/1L-2活化的培養物中的細胞用抗ΝΚρ30 (優選地，B i ο I egend，克隆Ρ30-15)、抗
Vδ I (優選地,Thermo Fisher Scientif ic,克隆TS8.2)染色並且在FACSAria細胞分選儀(優選地，BD Biosciences)上分選。
[0074]白血病患者樣品。B-細胞慢性淋巴細胞性白血病細胞從出席、知情同意及機構審查委員會批准後(Instituto Portugues de Oncologia de Lisboa, Portugal)患者的外周血獲得。樣品通過在Ficol-Paque上密度離心進行富集，並且隨後在(如上文的)10%RPMI1640中洗滌2次。
[0075]體外腫瘤殺傷測定法。將全部腫瘤細胞系均培養於(如上文的)10%完全RPMI1640中，通過稀釋和每3-4日1:3分瓶以105至多到106個細胞/ml維持。對於細胞毒性測定，將經磁力純化的Y δ PBL在IL-2(100U/mL)和1 μ g/mL PHA或IOnM HMB-PP存在下預活化7-19日。對於受體阻斷，將Y SPBL與阻斷性抗體抗NKp30(克隆F252)、抗NKp44(克隆 KS38)、抗 NKp46 (克隆 KL247)或抗 TCR y δ (Beckman Coulter,克隆 IMMU510)孵育 2 小時。在殺傷測定法期間在培養基中維持所述阻斷性抗體。腫瘤細胞系或白血病原代樣品用CellTrace Far Red DDA0-SE 染色(I μ M ;Molecular Probes,優選地，Invitrogen),並且將每種3xl04個腫瘤細胞與RPMI中的3xl05個yδ T細胞在37°C和5%C02下於圓底96孔平板上孵育3小時。細胞隨後用膜聯蛋白V-FITC(優選地，BD Biosciences)染色並且由流式細胞術分析。對於重定向殺傷測定法，將經PHA/IL-2活化的y SPBL在標準51Cr釋放測定法期間與NCR激動劑抗NKp30 (克隆AZ20)、抗Nkp44 (克隆Z231)或抗NKp46 (克隆Bab281)孵育4小時。
[0076]流式細胞術分析。細胞用以下螢光單克隆抗體標記:抗⑶3-PerCP_Cy5.5(優選地，eBioscience，克隆 0KT3)、抗 TCRy δ-FITC(優選地，eBioscience，克隆 BL I)、抗CD69-PE (優選地，BD Pharmingen,克隆 FN50)、抗 NKG2D_PE/Cy7 (Biolegend，克隆 IDl I)、抗 2B4-APC (優選地，Biolegend,克隆 Cl.7)、抗 DNAM-l-Alexa-Fluor647(Biolegend,克隆 DXlI)、抗 NKp30-APC(優選地，Biolegend,克隆 P30-15)、抗 V δ 2TCR-PE (優選地，Biolegend,克隆 B6)、抗 NKp44_APC(優選地，Biolegend,克隆 P44-8)、抗NKp46-AlexaFluor647(優選地，Biolegend,克隆 9E2)、抗 V δ 1TCR-FITC(優選地，ThermoFisher Scientific,克隆 TS8.2)、抗 NKp30-PE (優選地，Biolegend,克隆 P30-15)、抗小鼠IgGl K -APC同種型對照(優選地，Biolegend,克隆M0PC-21)、抗小鼠IgGl κ -PE同種型對照(優選地，Biolegend,克隆 M0PC-21)、抗 CD27_APC/Cy7 (優選地，Biolegend，克隆 0323)、抗⑶56-APC (優選地，Biolegend,克隆HCD56)。通過遵循標準CFSE染色方案(優選地，CellTrace CFSE細胞增殖試劑盒， Invitrogen ;終濃度0.5mM)測量細胞增殖，通過膜聯蛋白(優選地，BD Pharmingen)染色法評估凋亡。在FACSCanto流式細胞儀(優選地，BDBiosciences)上分析細胞。
[0077]RNA分離和cDNA產生。使用RNeasy微量試劑盒，根據製造商的方案(優選地，Qiagen，希爾登，德國)提取總RNA。通過分光光度法確定濃度和純度，並且使用AgiIent2IOOBioanalyzer,以 RNA6000Nano 測定法(優選地，Agilent Technologies, PaloAlto, CA)證實完整性。使用隨機六聚物和Superscript II第一鏈合成試劑(優選地，Invitrogen),將總 RNA 逆轉錄成 cDNA。
[0078]實時定量PCR(qPCR)在ABI Prism7500FAST序列檢測系統上使用SYBR Green檢測系統(優選地，二者均來自Applied Biosystems)進行qPCR。使用Primer3v.0.4.0在線程序(http://primer3.sourceforRe.net)設計引物。對於每種轉錄物，使用校正曲線方法進行定量。使用β 2-微球蛋白(b2m)、葡糖醒酸酶β (Glucoronidase beta,Gusb)和蛋白酶體亞基β類型6(Psmb6)作為持家對照用於基因表達歸一化。使用以下引物:
[0079].b2m-正向 CTAT CCAG CGTA CTCC AAAG ATTC,反向 CTTG CTGA AAGA CAAG TCTGAATG ；
[0080].Psmb6-正向 GGCG GCTA CCTT ACTA GCTG,反向 AAAC TGCA CGGC CATG ATA ；
[0081].Gusb-正向 TGCA GCGG TGTA CTTC TG,反向 CCTT GACA GAGA TCTG GTAA TCA ；
[0082].B7-H6-正向 TCAC CAAG AGGC ATTC CGAC CT,反向 ACCA CCTC ACAT CGGT ACTCTC ；
[0083].Nkp44-正向 CCGT CAGA TTCT ATCT GGTG GT,反向 CACA CAGC TCTG GGTC TGG ；
[0084].Nkp46-正向 AAGA CCCC ACCT TTCC TGA,反向 TGCT GGCT CGCT CTCT AGT ；
[0085].Gzmb-正向 GGGG GACC CAGA GATT AAAA,反向 CCAT TGTT TCGT CCAT AGGA G。
[0086]全部樣品一式三份運行並重複3次。使用ABI SDS vl.1序列分析軟體(AppliedBiosystems)進行qPCR結果的分析。
[0087]統計分析。使用Student’s t_檢驗評估亞群之間的差異，並且在顯著時顯示為*p〈0.05 ;#p〈0.01 ;*#ρ〈0.0Olo
[0088]結果
[0089]用泛T細胞促分裂原活化的Y SPBL培養物的增強的細胞毒性。
[0090]比較了用PHA (充當強力T細胞促分裂原的植物凝集素)或特異性VY9V5 2TCR激動劑HMB-PP活化的Y δ PBL培養物(總是在IL-2存在下維持)的抗腫瘤殺傷能力(Morita, C.T., Jin, C., Sarikonda, G.和 Wang, H.2007.Nonpeptideantigens,presentation mechanisms, and immunological memory of humanVgamma2Vdelta2T cells:discriminating friend from foe through the recognition ofprenyl pyrophosphate antigens.Tmmunol Rev215:59-76)。雖然兩種方案在活化 δ PBL方面類似地有效，如通過細胞增殖和⑶69上調所評價的(圖1Α)，但是要指出的是，用PHA活化的樣品是比經HMB-PP刺激的(供體來源相同的)樣品一致更好的造血系統腫瘤細胞系殺傷者(圖1B-C)。這在測試的全部供體之間有效(圖1Β)，並且與粒酶B (淋巴細胞溶細胞機制的關鍵組分)的較高表達相關(圖1D)。注意，如先前報導，缺少粒酶B表達的新鮮分離的Y 5PBL(圖1D)顯示十分低的抗白血病細胞毒性(〈10%殺傷)。
[0091]PHA刺激的Y SPBL培養物的優越細胞毒功能是一個令人驚訝的發現，因為已顯示HMB-PP是高度優勢的V Y 9V δ 2PBL亞類的十分強力的激活物(Morita，C.T., Jin, C., Sarikonda, G.和 Wang, H.2007.Nonpeptide antigens, presentationmechani sms, and immunological memory of human Vgamma2Vdelta2Tcells:discriminating friend from foe through the recognition of prenylpyrophosphate antigens.Tmmunol Rev215:59-76)。與 HMB-PP 活化的 Y δ PBL 相比，PHA刺激的培養物顯示改進的針對各種抗性白血病細胞系的細胞毒性，如Bv-173、REH或HPB-ALL (圖1B-C)，所述抗性白血病細胞系已經顯示缺少關鍵性NKG2D配體ULBPl的表達。這些數據表明，泛T細胞促分裂原PHA能夠增加中期(1-3周) δ PBL培養物的溶細胞潛力，這可能對過繼細胞免疫療法具有巨大價值。
[0092]在用泛T細胞促分裂原活化的Y δ PBL上誘導NCR表達[0093]研究了 PHA活化的Y SPBL培養物的增強細胞毒性潛在的機制。以上數據可以由受體如NKG2D或DNAM-1或2B4的差異性表達解釋。先前顯示這些受體均參與殺傷淋巴細胞對腫瘤細胞的識別。然而，這些候選者均不在PHA-和HMB-PP活化的y δ PBL培養物之間差異性表達(圖2Α)。相反並且出乎意料地，天然細胞毒性受體NKp30 (NK細胞細胞毒性的一種重要觸發物)在PHA刺激的y δ PBL上特異性存在(圖2Β ;圖7)。另外，其他NCR家族成員，ΝΚρ44和ΝΚρ46，也在這些樣品中選擇性地表達(圖2C-D ;見下文)。
[0094]ΝΚρ30+細胞的比例隨培養時間穩定增加(圖2Ε)，表明ΝΚρ30誘導與細胞增殖之間的關聯。雖然不太可能歸因於新鮮樣品中十分低的背景(圖2Ε)，但可能的是，組成型方式表達ΝΚρ30的某個微小亞類可能在PHA刺激的Y SPBL培養物中優先被擴充。為解決這個問題，採用經FACS高度純化(>99%)的ΝΚρ30Η細胞進行實驗，所述試驗證實了在PHA+IL-2刺激時，ΝΚρ30(_)細胞能夠與未分選細胞同樣有效地獲得ΝΚρ30表達(圖2F)。另外，在這類條件下，ΝΚρ30(_)和ΝΚρ30+細胞以相似的程度增殖，這進一步反駁ΝΚρ30+細胞在這類條件下的優先擴充。這些結果表明當通過PHA/IL-2處理活化Y δ PBL時，從頭誘導ΝΚρ30表達，這與細胞增殖耦合。
[0095]NCR由增殖的V δ I+T細胞選擇性表達
[0096]考慮到HMB-PP已經證實是V Y 9V δ 2細胞的最佳激動劑，不過與HMB-PP相反，PHA處理偏好地擴充Y SPBL當中的νδ2(_)細胞(圖3Α)。這不歸因於在兩種實驗條件下νδ2+細胞凋亡的差異(圖8)。如此顯著擴充的最可能V δ 2(_)群體(圖3Α)是V δ 1+細胞，因為其他亞類在健康成人的外周血中極為罕見。當評估νδ I相比較VS2TCR的使用時，在經PHA活化的培養物中發現V δ I+細胞大幅度富集(19日後，佔全部y δ T細胞的>80%)(圖3Β ;圖9)。相反，並且如所述，經HMB-PP活化的培養物逐漸由V δ 2+細胞佔優勢(圖3Α)。
[0097]在用PHA+IL-2刺激的分離的V δ 1+或V δ 2+細胞的平行培養物中檢查ΝΚρ30表達的誘導。儘管新鮮分離的νδ 1+和νδ2+細胞均不表達ΝΚρ30(圖10)，但是在V δ 1+細胞中而不在V δ 2+細胞中強烈誘導了這種NCR(當PHA+IL-2處理時)(圖3C)。另外，通過進行CFSE稀釋，證實了 NKp30+細胞的驚人積累，伴隨V δ I+細胞的逐步分裂(圖3C)。這些數據表明PHA/IL-2培養物中V δ I+細胞的活化誘導了 ΝΚρ30表達，同時伴有細胞增殖。
[0098]在培養物中2-3周之後通常檢測到高百分比(>50%)的ΝΚρ30+細胞情況下，而ΝΚρ44(約30%)和ΝΚρ46 ?20%)在較低比例的V δ I+細胞中表達(圖3D)。另外，大部分的ΝΚρ44+或NKp46+V δ I+細胞也表達ΝΚρ30 (圖3D)。因此將ΝΚρ30視為誘導性NCR+V δ 1+亞類的提供信息最多的標記。
[0099]NCR誘導需要AKT依賴性Y c細胞因子和TCR信號
[0100]剖析了 NCR+V δ I+T細胞分化所需要的特定信號。首先，拆開活化方案的兩個組分IL-2和PHA。IL-2或其相關的Y c細胞因子IL-15單獨即足以誘導一些ΝΚρ30表達，但是與PHA/1L-2(或PHA/1L-15)組合相比較而言這種作用是輕微的(圖4A)。在另一方面，PHA單獨使用不能夠使培養物保持活力，這與Y c細胞因子在Y S T細胞存活中、尤其當活化/增殖時的關鍵作用一致。
[0101]雖然PHA已經是廣泛使用的T細胞促分裂原，但是它也是一種能夠交聯一系列表面受體(包括TCR)的非生理性化合物。因此，PHA刺激作用的分子介體可能是V δ I+TCR複合物。比較了 PHA和特異性交聯TCR複合物的⑶3 ε鏈的0KT3mAb (與IL-2或IL-15組合時)在V δ 1τ細胞中誘導ΝΚρ30表達的能力。0ΚΤ3在這些測定法中完全能夠模擬PHA (圖4八-8)，因此在增殖的￥3 1+1'細胞中誘導爾?30(圖11)。另外沖撤/幾-2培養物中的1'0^ δ阻斷作用防止ΝΚρ30誘導(圖4C)。這些數據表明，PHA處理提供了 TCR信號以誘導V δ I+PBL上的NCR表達。另外，單獨或與0KT3(或PHA)組合的細胞因子處理之間的差異凸顯出這個過程中Y。細胞因子和TCR信號之間的明顯協同作用(圖4Α-Β)。
[0102]為了進一步探索NCR誘導的分子機制，使用Y。細胞因子受體和/或TCR信號傳導下遊的關鍵信號轉導途徑的化學抑制劑。儘管阻斷JAK信號傳導在任何NCR誘導之前觸發了廣泛的細胞死亡，但是與ΡΙ-3Κ/ΑΚΤ抑制劑LY294002的共孵育特異性阻止了增殖的νδ I+T細胞中的ΝΚρ30誘導(圖4D)。AKT參與轉導Y。細胞因子信號和TCR信號，包括TCR gamma δ信號。相反，MAPK/Erk抑制劑U0126對增殖的νδ I+T細胞中的ΝΚρ30誘導沒有可檢測的影響(圖4D)。重要地，LY294002的選擇性影響將NCR誘導與細胞增殖作用拆分開了，因此證實了 νδ I+T細胞增殖是誘導ΝΚρ30表達必需的(圖3C ;圖11)，但不是足夠的(圖4D)。綜上，這些數據表明AKT依賴性Y。細胞因子和TCR信號協同作用以誘導V δΤ細胞中的ΝΚρ30表達。
[0103]有功能的ΝΚρ30和ΝΚρ44通過V δ I+PBL觸發腫瘤細胞殺傷。
[0104]採用功能獲得實驗和功能喪失實驗來評價NCR調節作用對V δ 1+富集(>80% ；圖9Α)的PBL培養物的影響，所述PBL培養物以與圖3D中相似的水平表達NCR。首先，通過使用反向Ab依賴性細胞毒性測定法，顯示出NKp30或NKp44的交聯(而不是NKp46的交聯)產生高度明顯的P815腫瘤細胞靶溶解增加(圖5A)。這些數據證實了誘導的NKp30和NKp44是有功能的並且介導腫瘤細胞殺傷。為了評估它們是否在靶向白血病細胞中發揮非冗餘作用，使用NCR特異性mAb進行受體阻斷實驗。當阻斷NKp30和NKp44時觀察到腫瘤細胞溶解的顯著增加(圖5B)。如從圖5A中的結果所預期，NKp46阻斷不影響腫瘤細胞殺傷。有趣地，還清楚地觀察到NKp30和NKp44之間的協同效應。應當指出，在殺傷測定法期間，TCRy δ阻斷在任何情形下(單獨或與抗NCR mAb組合)均是中性事件(圖5B)。這些數據暗示，NCR+V δ I+PBL對白血病細胞的靶向是一個大多通過ΝΚρ30和ΝΚρ44的協同功能所介導的TCR非依賴性事件。
[0105]NCR+V δ I+PBL是靶向耐藥性原發性淋巴細胞性白血病的特化殺傷細胞。
[0106]為了充分表徵NCR+V δ I+PBL的抗腫瘤潛力，將ΝΚρ30+細胞經FACS分選成高純度099%)(圖6Α)並且進行一系列功能測定。如預期(圖3D)，分選的ΝΚρ30+細胞也表達ΝΚρ44和ΝΚρ46 (圖6Β)，而且，當僅用IL-2培養2周時，這三種NCR在純化細胞的表面上大體上穩定(圖6C)。這些數據證實了穩定NCR+V δ Τ細胞亞類的便利擴充。
[0107]當評估ΝΚρ30+細胞的細胞毒功能時，觀察到對耐藥性白血病細胞系Βν173(連同其他)的靶向作用增加(與ΝΚρ30(_)對應物相比)(圖6D)。這與粒酶B的更高表達相關(圖6Ε)。另外，ΝΚρ30表達也與⑶56表達的較高程度相關(圖12)，所述⑶56表達先前已經與人淋巴細胞(包括V δ 2+Τ細胞)的細胞毒性關聯。
[0108]最後，採用從慢性淋巴細胞性白血病患者獲得的原代樣品，進行功能性殺傷測定。重要地，HMB-PP/IL-2活化的Y SPBL不表達NCR(圖2B)。將它們的抗腫瘤溶細胞活性與分離自經PHA/IL-2活化的Y SPBL培養物的NCR+細胞比較。觀察到從6位不同供體獲得的NCR+ gamma δ PBL在消除原代B-CLL細胞方面一致地更高效(圖6F-G)。[0109]本發明當然不以任何方式限於所述的實施方案，並本領域技術人員能預見到其修改的許多可能性，而不背離如所附權利要求書中所定義的本發明基本構思。
[0110]以下權利要求闡述本發明的具體實施方案。
【權利要求】
1.一種淋巴細胞細胞系，其中包含表達功能性天然細胞毒性受體的vsrY St細胞。
2.根據權利要求1所述的細胞系，其由表達功能性天然細胞毒性受體的VS1+Y ST細胞組成。
3.根據前述權利要求中任一項所述的細胞系，其中還包含VS 2+Y S T細胞。
4.根據前述權利要求中任一項所述的細胞系，其中所述天然細胞毒性受體包括NKp30。
5.根據前述權利要求中任一項所述的細胞系，其中所述淋巴細胞來自外周血樣品。
6.根據前述權利要求中任一項所述的細胞系，其中所述天然細胞毒性受體包括NKp44。
7.根據前述權利要求中任一項所述的細胞系，其中所述天然細胞毒性受體包括NKp46。
8.根據前述權利要求中任一項所述的細胞系，其中包含表達粒酶B的細胞。
9.組合物，其中包含根據前述權利要求中任一項所述的細胞系的細胞。
10.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述組合物是可注射用的。
11.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其用於醫學中。
12.根據前述權利要求所述的組合物，其用於自體或異源過繼細胞療法、腫瘤或癌症治療、腫瘤或癌症免疫療法和/或白血病治療中。
13.根據權利要求11所述的組合物，其用於治療急性淋巴母細胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴細胞白血病、多發性骨髓瘤、Burkitt氏淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌或皮膚黑色素瘤。
14.根據權利要求11所述的組合物，其用於治療病毒性感染。
15.根據前述權利要求所述的組合物，其中所述病毒來自皰疹病毒科(Herpesviridae)或逆轉錄病毒科(Retroviridae)。
16.生產權利要求1-8中任一項所述的細胞系的方法，所述方法包括分離YS PBL和在適當的培養基中培育這些細胞，同時添加Y S TCR激動劑和至少一種Y。-家族細胞因子。
17.根據權利要求16所述的方法，其中實施所述YS TCR激動劑和Y。-細胞因子的有規律添加，直至至少40%的細胞表達天然細胞毒性受體。
18.根據前述權利要求所述的方法，其中實施所述YS TCR激動劑和Y。-細胞因子的有規律添加，直至至少40%的細胞表達NKp30。
19.權利要求16-18中任一項所述的方法，其中YS TCR激動劑是植物凝集素PHA、抗⑶3單克隆抗體、抗Y S TCR單克隆抗體或其混合物。
20.根據前述權利要求所述的方法，其中YS TCR激動劑濃度的範圍是0.01-1OOiig/ml 。
21.權利要求16-20中任一項所述的方法，其中所述￥。-細胞因子是11-2、11-4、11-9、IL-12、IL-15、IL-21 或其混合物。
22.根據前述權利要求所述的方法，其中Y。-細胞因子濃度的範圍是l-10000U/mL。
23.根據前述權利要求所述的方法，其中Y。-細胞因子濃度的範圍是100-1000U/mL。
24.根據權利要求16-23所述的方法，其中添加所述YS TCR激動劑和Y。-細胞因子的時間範圍是2-60日。
25.根據前述權利要求所述的方法，其中添加所述Yδ TCR激動劑和Yc-細胞因子的時間範圍是9_25日。
26.根據前述權利要求所述的方法，其中添加所述Yδ TCR激動劑和Yc-細胞因子的時間範圍是10-15日。
【文檔編號】C12N9/64GK103635573SQ201280024189
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年5月21日 優先權日:2011年5月19日
【發明者】B·M·德卡瓦洛埃斯爾瓦桑託斯, D·瓦加斯考雷拉 申請人:分子醫學研究所