矽膠膜活化液及其在核酸提取中的應用的製作方法
2023-05-08 02:11:11
專利名稱：矽膠膜活化液及其在核酸提取中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於核酸提取領域的技術，尤其涉及一種矽膠膜活化液及其應用。
背景技術：
分子生物學的研究與應用離不開核酸的提取與純化，核酸提取的效果直接 影響著後續的工作和研究，但核酸的提取與純化一直是耗時繁瑣的過程。國內 外許多學者一直在探索各種核酸提取純化的方法。
傳統的核酸製備方法常用酚/氯仿等有毒的有機溶劑抽提，這些技術適用範 圍廣，適用於大部分分子生物學研究，但是這些技術操作繁瑣且耗時，而且酚 和氯仿等有機溶劑易造成環境汙染，有損健康。這種方法目前在國內還比較普 遍，大部分學校教學經費不是很足的實驗室還在使用。
1992年X. delamballerie等開始用Chelex100螯合柱提取細菌及病毒DNA 獲得較好效果。該方法簡單快速，避免使用酚等有害物質，但是提取的DNA純 度較低，不適用於對純度要求較高的下遊的分子生物學實驗。
1992年PicardC等利用玻璃粉在高鹽下吸附DNA的特性純化DNA。此後玻 璃粉吸附法提純DNA時有報導，但是該方法操作步驟較多，提取的DNA純度較 低。
1999年R Caldarelli-Stefano等運用磁珠分別從福馬林固定、石蠟包埋 和冰凍組織中提取DNA，整個過程不到兩個小時。與傳統方法比較，磁珠法是一 種可行、簡單、敏感和快速的方法。
1997年Adriab R Geksthorpe等利用抗DNA單克隆抗體與磁珠結合的方法 從小樣本、陳舊樣本及含PCR抑制的樣本中提取核酸獲得很好的效果。但是目 前應用此方法生產的商品化DNA試劑盒還沒有。
矽膠膜吸附柱法是採用特製的矽膠膜吸附柱來選擇性吸附裂解細胞釋放的 DNA，再經過洗滌和洗脫等簡單程序，就可獲得高純度的DNA。但是直接使用矽 膠膜方法用於核酸分離存在矽膠膜不穩定、不均一以及與核酸結合能力下降等 缺點，用我們特製的活化工藝可以克服以上缺陷。
發明內容
我們採用活化矽膠膜表面基團的工藝使矽膠膜與核酸結合能力得到明顯 改善，從而達到從生物體的裂解液中分離提取核酸的目的。
直接使用矽膠膜方法用於核酸分離存在矽膠膜不穩定、不均一以及與核酸 結合能力下降等缺點，用我們特製的活化工藝可以克服以上缺陷。活化工藝採用化學方法特殊處理，活化液組成為50 — 200mM NaHCO" 1-10% (w/v) SDS， l-50mM EDTA。
本發明的目的是提供一種對矽膠膜進行處理的方法，採用活化工藝可以使 其與核酸的結合力得到增加，且使它們的結合力具有良好的均一性與穩定性， 提高其生物利用度，更有效地發揮其核酸提取的功能；而且通過該方法使矽膠 膜被包裹在活化劑內部，隔絕了與外界環境的接觸，因而性質更加穩定，擴大 了其應用範圍，以滿足不同的生產需要。
本發明的矽膠膜活化液，其特徵在於，矽膠膜活化液中含有50 — 200mM NaHC03、 1-10%SDS和l-50mM EDTA。
根據本發明的矽膠膜活化液，其特徵在於，使用該活化液處理後的矽膠膜 與核酸的結合能力增強，且活化液使矽膠膜與核酸的結合力具有良好的均一性 與穩定性。
根據本發明的的活化液，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有100 mM
NaHCO:,。
根據本發明的的活化液，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有5。/。SDS。 根據本發明的的活化液，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有25mMEDTA。 本發明包括利用矽膠膜活化液提取核酸的方法，該方法包括使用活化液活
化矽膠膜、裂解細胞、矽膠膜吸附核酸、清除矽膠膜上的雜質以及膜上的核酸
洗脫的過程。
根據本發明的方法，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有100mMNaHC03。 根據本發明的方法，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有5。/。SDS。根據權 根據本發明的方法，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有25inM EDTA。
本發明還包括一種對於核酸提取的矽膠膜進行處理的方法，該方法包括切 割矽膠膜製備吸附柱、加入矽膠膜活化液至吸附柱以及離心去除活化液的過程。 根據本發明的方法，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有100mMNaHC03。 根據本發明的方法，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有5WSDS。 根據本發明的方法，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有25mM EDTA。
本發明進一步包括一種核酸提取試劑盒，其特徵在於，該試劑盒含有矽膠 膜活化液、裂解液、洗滌液以及洗脫液。
根據本發明的試劑盒，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有100 mM NaHC03。
根據本發明的試劑盒，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有5%SDS。
根據本發明的試劑盒，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有25rnM EDTA。
圖1.不同體積的活化液對矽膠膜活化效果的影響
1. 500W
2. 60(M
3. 70(M
4. 不加活化液
圖2.不同活化時間對矽膠膜活化效果的影響
1. 0
2. 5分鐘
3. 10分鐘
4. 20分鐘
5. 40分鐘
6. 80分鐘
7. 160分鐘
8. 不加活化液
圖3.活化液對不同溫度放置的矽膠膜活化效果的影響
1. 4'C，加活化液
2. 4'C，不加活化液
3. 25°C，加活化液
4. 25°C，不加活化液
5. 37°C，加活化液
6. 37°C，不加活化液
具體實施例方式
實施例1
1. 矽膠膜活化工藝
將厚度大約為0.3mm用於空氣過濾的矽膠膜切割成適當大小後連同過濾墊 片置於塑料吸附柱CB3中，向吸附柱CB3(吸附柱放入2ml收集管中)加入500W 的矽膠膜活化液，12, 000 rpm離心30 — 60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 重新放回收集管中。(用活化液處理過的柱子最好立即使用)。
活化液組成為lOOraM NaHC03， 5% (w/v) SDS， 25raM EDTA。
2. 用活化後的矽膠膜提取質粒pcDNA
取l一3ml過夜培養的￡ coh'(含質粒pcDNA)菌液加入離心管，室溫12， 000 rpm離心1分鐘收集細菌，儘量吸除上清。向留有菌體沉澱的離心管中加入250Hl 含RNase A的GTE buffer (50 mM Glucose, 25 mM Tris-Cl， 10 mM EDTA， pH 8)， 使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉澱。向離心管中加入250W lysis solution (0.2 M Na0H, 1% SDS).，立即溫和地上下翻轉6-8次。向離心管中 加入350Ml 5 M potassium acetate solution (pH 4.8)，立即溫和地上下翻轉 6-8次，充分混勻，此時會出現白色絮狀沉澱。12,000 rpm離心10分鐘，將上 清溶液全部轉移到活化後的吸附柱CB3中(吸附柱放入2ml收集管中)。室溫 12， 000 rpm離心30 — 60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 向吸附柱中加入750W漂洗液70%乙醇，12， 000 rpm離心30 — 60秒，棄掉收 集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。重複以上操作步驟。倒掉廢液。 將吸附柱CB3重新放回收集管中，12， 000 rpm離心2分鐘，目的是將吸附柱中 殘餘的漂洗液去除。將吸附柱CB3置於一個乾淨的1.5ml離心管中，向吸附膜 的中間部位懸空滴加10(M洗脫緩衝液TE buffer (10 mM Tris-Cl， 1 mM EDTA， pH 7. 5)，室溫放置5分鐘，室溫12, 000 rpm離心1分鐘。-2(TC保存。
3. 不同體積的活化液對矽膠膜活化效果的影響
採用以上活化工藝的矽膠膜提取質粒DNA，考察不同體積的活化液(50014， 700M1)對矽膠膜活化效果的影響，實驗結果見圖l，從圖上可見不同 體積的活化液對矽膠膜活化效果的影響不大，但是經過活化處理過的矽膠膜與 未處理的膜相比，質粒提取得率明顯提高。
4. 不同活化時間對矽膠膜活化效果的影響
採用以上活化工藝的矽膠膜提取質粒DNA，考察不同活化時間(0， 5分鐘， 10分鐘，20分鐘，40分鐘，80分鐘，160分鐘)對矽膠膜活化效果的影響，活 化液體積均為500W，實驗結果見圖2，從圖上可見不同活化時間對矽膠膜活 化效果的影響不大，但是經過活化處理過的矽膠膜與未處理的膜相比，質粒提 取得率明顯提高。
5. 活化液對不同溫度放置的矽膠膜活化效果的影響
吸附柱CB3在不同溫度(4"C、 25匸和37'C)下放置七天，採用以上活化 工藝活化矽膠膜後提取質粒DNA，考察加與不加活化液對矽膠膜活化效果的影 響，實驗結果見圖3，從圖上可見提高溫度破壞了矽膠膜結合核酸的能力，經 過活化處理過的矽膠膜與未處理的膜相比，質粒提取得率明顯提高，並且膜的 穩定性和均一性有所改善。 實施例2矽膠膜活化工藝同實施例1，只是活化液組成為50mM NaHC03， 1% (w/v) SDS， ImM EDTA。
實施例3
矽膠膜活化工藝同實施例1，只是活化液組成為200mMNaHC03， 10% (w/v) SDS， 50mM EDTA。
實驗證明，使用以上實施例2和實施例3的活化液處理後的矽膠膜與核酸 的結合能力增強，且活化液使矽膠膜與核酸的結合力具有良好的均一性與穩定性。
權利要求
1.一種矽膠膜活化液，其特徵在於，矽膠膜活化液由50-200mM NaHCO3、1-10％SDS和1-50mM EDTA組成。
2. 根據權利要求1的矽膠膜活化液，其特徵在於，使用該活化液處理後的矽膠 膜與核酸的結合能力增強，且活化液使矽膠膜與核酸的結合力具有良好的均一性與穩定性。
3. 根據權利要求1或2的活化液，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有100 raMNaHCO:,。
4. 根據權利要求1或2的活化液，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有5%SDS。
5. 根據權利要求1或2的活化液，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有25慮EDTA。
6. 利用權利要求1或2的矽膠膜活化液提取核酸的方法，該方法包括使用矽膠 膜活化液活化矽膠膜、裂解細胞、矽膠膜吸附核酸、清除矽膠膜上的雜質以 及膜上的核酸洗脫的過程。
7. 根據權利要求6的方法，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有100 mMNa線。
8. 根據權利要求6的方法，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有5%SDS。
9. 根據權利要求6的方法，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有25mMEDTA。
10. —種對於核酸提取的矽膠膜進行處理的方法，該方法包括切割矽膠膜製備吸 附柱、加入權利要求1的矽膠膜活化液至吸附柱以及離心去除活化液的過程。
11. 根據權利要求10的方法，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有100 mM NaHC03。
12. 根據權利要求10的方法，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有5呢SDS。
13. 根據權利要求10的方法，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有25mMEDTA。
14. 一種核酸提取試劑盒，其特徵在於，該試劑盒含有權利要求1的矽膠膜活化 液、裂解液、洗滌液以及洗脫液。
15. 根據權利要求14的試劑盒，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有100 mM 舗CO..i。
16. 根據權利要求14的試劑盒，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有5%SDS。
17. 根據權利要求14的試劑盒，其特徵在於，所述矽膠膜活化液中含有25mM EDTA。
全文摘要
本發明屬於核酸提取領域的技術，尤其涉及一種矽膠膜活化液及其應用。本發明的目的是提供一種對矽膠膜進行處理的方法，採用活化工藝可以使其與核酸的結合力得到增加，且使它們的結合力具有良好的均一性與穩定性，提高其生物利用度，更有效地發揮其核酸提取的功能；而且通過該方法使矽膠膜被包裹在活化劑內部，隔絕了與外界環境的接觸，因而性質更加穩定，擴大了其應用範圍，以滿足不同的生產需要。
文檔編號C12N15/10GK101338312SQ20081012607
公開日2009年1月7日 申請日期2008年7月3日 優先權日2008年7月3日
發明者李曉晨 申請人:天根生化科技(北京)有限公司