固相多肽合成生長激素促分泌素五肽的方法

2023-05-08 19:14:11 1

專利名稱：固相多肽合成生長激素促分泌素五肽的方法
技術領域：
本發明涉及生長激素促分泌素的生產方法，尤其涉及固相多肽合成生長激素促分泌素的新生產工藝。
背景技術：
中文名生長激素促分泌素、生長激素促分泌素五肽。英文名Growth Hormone Secretagogue，GHS0
結構式
Gly-Ser-Trp-Phe-Arg-OH
分子式及分子量=C31H41N9O7,651.73。
臨床用途它能刺激天然的或內源性生長激素釋放能力。該五肽可以用來治療需要刺激生長激素產生或分泌的疾病，例如用於天然生長激素缺乏的人或用於食用或產毛動物，以刺激生長激素，從而得到更大、更高產的動物。
中國專利申請號96199388. X公開了一種生長激素促分泌素及其製備方法，該專利提供的產品的結構式與本發明不同該專利不是多肽類產品，本發明是由五個胺基酸級成的五肽，因此，所述專利提供的方法，難以用於本發明的產品的製備。發明內容
本發明需要解決的技術問題是公開一種固相多肽合成生長激素促分泌素五肽的方法，以滿足有關領域發展的需要。
本發明的方法包括如下步驟
以2-氯-三苯氯甲基樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護基團的胺基酸，其間依次脫去Fmoc-保護基團，用HBTU及HOBT為縮合劑進行接肽反應，得保護的五肽樹脂後，同步進行脫側鏈保護基團及切肽，收集切肽後的生長激素促分泌素粗品， 並經C18高效液相柱進行分離純化，再經冷凍乾燥後，製得生長激素促分泌素精品。
具體的，本發明的方法，包括如下步驟
(I)Fmoc-Arg(Pbf)-樹脂的製備
取2-氯-三苯氯甲基樹脂，用DCM浸泡，使樹脂溶脹，抽乾，加入溶於DMF的 Fmoc-Arg(Pbf) -OH及DIPEA，於32 38 °C反應I 2小時，優選1. 5小時，再加甲醇繼續32 37 °C反應25 35分鐘，優選30分鐘，抽乾，樹脂依次用甲醇、DMF洗滌，獲得 Fmoc-Arg (Pbf)-樹脂；
所說的三苯氯甲基樹脂顆粒為85-95目，取代度為0. 8 1. 2mmol/g ；
DMF 中，Fmoc-Arg(Pbf)-OH 的含量為 O. 08 O. 12g/ml ；
DIPEA與2-氯-三苯氯甲基樹脂的摩爾比為1: 5 7;
Fmoc-Arg (Pbf)-OH與2-氯-三苯氯甲基樹脂的摩爾比為I O. 9 1.1 ;
其中，Fmoc-Arg(Pbf)-OH為保護的胺基酸；
(2) Fmoc-Phe-Arg (Pbf)-樹脂的製備
在步驟(I)的Fmoc-Arg (Pbf)-樹脂中，加入重量濃度為20 30%，優選25%的 PIP的DMF溶液，30 32°C脫帽反應25 35分鐘，優選30分鐘，抽乾，依次用甲醇、DMF洗滌，抽乾，加入用DMF溶解的Fmoc-Phe-0H、HBTU、H0BT和DIPEA的混合物，36_39°C縮合反應 65 75分鐘，優選70分鐘，抽乾，用乙醇和DMF洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Phe-Arg (Pbf)-樹
DMF 溶液中，Fmoc-Phe-OH 的含量為 O. 08 O. 12g/ml ；
各個組分的用量，以2-氯-三苯氯甲基樹脂為基準，為
重量濃度為20 30%的PIP的DMF溶液2_氯-三苯氯甲基樹脂=6 8 1， 重量比；
Fmoc-Phe-OH 2_氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1. 7 1，摩爾比；
HBTU 2-氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
HOBT 2-氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
DIPEA 2_氯-三苯氯甲基樹脂=1. 6 2. O 1，摩爾比；
其中，Fmoc-Phe-OH為保護的胺基酸；
(3) Fmoc-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂的製備
在步驟(2)的Fmoc-Phe-Arg (Pbf)-樹脂中，加入重量濃度為20 30 %，優選25 % 的PIP的DMF溶液，30 32°C脫帽反應25 35分鐘，優選30分鐘，抽乾，用甲醇、DMF洗滌，抽乾，加入用DMF溶解的Fmoc-Trp-OH、HBTU, HOBT, DIPEA的混合物，36 39°C縮合反應65 75分鐘，優選70分鐘，抽乾，用DMF洗滌，抽乾，分別用乙醇和DMF洗滌，抽乾，獲得 Fmoc-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂；
DMF 溶液中，Fmoc-Trp-OH 的含量為 O. 08 O. 12g/ml ；
各個組分的用量，以2-氯-三苯氯甲基樹脂為基準，為
重量濃度為20 30%的PIP的DMF溶液2_氯-三苯氯甲基樹脂=6 8 1， 重量比；
Fmoc-Trp-OH 2_氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1. 7 1，摩爾比；
HBTU 2-氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
HOBT 2-氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
DIPEA 2_氯-三苯氯甲基樹脂=1. 6 2. O 1，摩爾比；
其中，Fmoc-Trp-OH為保護的胺基酸；
(4) Fmoc-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂的製備
在步驟(3)的Fmoc-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂中，加入重量濃度為20 30%，優選 25%的PIP的DMF溶液，30-32°C脫帽反應25 35分鐘，優選30分鐘，抽乾，用甲醇、DMF洗滌，抽乾，加入用DMF溶解的Fmoc-Ser (tBu) -OH、HBTU, HOBT、DIPEA的混合物，36 39°C縮合反應65 75分鐘，優選70分鐘，抽乾，用DMF洗滌，抽乾，分別用乙醇和DMF洗滌，抽乾， 獲得 Fmoc-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂；
DMF 溶液中，Fmoc-Ser (tBu) -OH 的含量為 O. 08 O. 12g/ml ；
各個組分的用量，以2-氯-三苯氯甲基樹脂為基準，為
重量濃度為20 30%的PIP的DMF溶液2_氯-三苯氯甲基樹脂=6 8 1，重量比；
Fmoc-Phe-OH 2_氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1. 7 1，摩爾比；
HBTU 2-氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
HOBT 2-氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
DIPEA 2_氯-三苯氯甲基樹脂=1. 6 2. O 1，摩爾比；
其中，Fmoc-Ser (tBu) -OH為保護的胺基酸；
(5) Boc-Gly-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂的製備
在步驟⑷的Fmoc-Ser (tBu)-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂中，加入重量濃度為20 30%,優選25%的PIP的DMF溶液，進30-32°C脫帽反應25 35分鐘，優選30分鐘，抽乾， 用甲醇、DMF洗滌，抽乾，加入用DMF溶解的Boc-Gly-0H、HBTU、H0BT、DIPEA的混合物，36 39 °C縮合反應65 75分鐘，優選70分鐘，抽乾，分別用DMF、甲醇洗滌，抽乾，獲得Boc-Gly -Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂；
DMF 溶液中，Boc-Gly-OH 的含量為 O. 08 O. 12g/ml ；
各個組分的用量，以2-氯-三苯氯甲基樹脂為基準，為
重量濃度為20 30%的PIP的DMF溶液2_氯-三苯氯甲基樹脂=6 8 1， 重量比；
Boc-Gly-OH 2_氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1. 7 1，摩爾比;
HBTU 2-氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
HOBT 2-氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
DIPEA 2_氯-三苯氯甲基樹脂=1. 6 2. O 1，摩爾比；
其中，Boc-Gly-OH為保護的胺基酸；
(6) Gly-Ser-Trp-Phe-Arg 的製備
在步驟(5)的Boc-Gly-Ser (tBu)-Trp-Phe-Arg(Pbf)-樹脂中，加入預冷至 5 7°C的切肽試劑，32 35 V反應2. O 3. O小時，減壓除溶劑後，加入乙醚沉澱，收集沉澱物，用乙醚洗，P2O5真空乾燥，獲得切肽後的生長激素促分泌素粗品；
所述的切肽試劑由如下體積比的組分組成
TFA/TIS/Ph0H/3-Map/H20 = 900/40ml/25ml/25/10ml ；
(7)將粗品溶於釋醋酸中，過濾，濾液經C18高效液相柱純化，柱直徑為210mm，柱長為245mm，流速為920ml/min ;檢測波長為280nm ;流動相0. 15mol/L磷酸三乙胺乙腈 (81 19，體積比)；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合併後去鹽，再除盡乙腈、凍幹，獲得成品。總收率為38.4%。
本發明的方法的有益效果是工藝穩定，副產物少，產品質量穩定，生產成本較低， 三廢汙染較少。
具體實施方式
實施例1
實施例和前述過程中所採用的原料列表如下
權利要求
1.固相多肽合成生長激素促分泌素五肽的方法，其特徵在於，包括如下步驟以2-氯-三苯氯甲基樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護基團的胺基酸，其間依次脫去Fmoc-保護基團，用HBTU及HOBT為縮合劑進行接肽反應，得保護的五肽樹脂後，同步進行脫側鏈保護基團及切肽，收集切肽後的生長激素促分泌素粗品，並經C18高效液相柱進行分離純化，再經冷凍乾燥後，製得生長激素促分泌素精品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述以2-氯-三苯氯甲基樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護基團的胺基酸，其間依次脫去Fmoc-保護基團，用HBTU及HOBT為縮合劑進行接肽反應，得保護的五肽樹脂後，同步進行脫側鏈保護基團及切肽，收集切肽後的生長激素促分泌素粗品的方法，包括如下步驟(1)Fmoc-Arg(Pbf)-樹脂的製備取2-氯-三苯氯甲基樹脂，用DCM浸泡，使樹脂溶脹，抽乾，加入溶於DMF的Fmoc-Arg (Pbf)-OH及DIPEA，反應，再加甲醇繼續32 37°C反應25 35分鐘，優選30分鐘，抽乾，樹脂依次用甲醇、DMF洗漆，獲得Fmoc-Arg (Pbf)-樹脂；(2)Fmoc-Phe-Arg (Pbf)-樹脂的製備在步驟(I)的Fmoc-Arg (Pbf)-樹脂中，加入重量濃度為20 30% PIP的DMF溶液，脫帽反應，抽乾，依次用甲醇、DMF洗滌，抽乾，加入用DMF溶解的Fmoc-Phe-OH、HBTU, HOBT和DIPEA的混合物，縮合反應，抽乾，用DMF洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Phe-Arg (Pbf)-樹脂；(3)Fmoc-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂的製備在步驟(2)的Fmoc-Phe-Arg(Pbf)-樹脂中，加入重量濃度為20 30% PIP的DMF溶液，脫帽反應，抽乾，用甲醇、DMF洗滌，抽乾，加入用DMF溶解的Fmoc-Trp-OH、HBTU, HOBT,DIPEA的混合物，縮合反應，抽乾，用DMF洗滌，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂；(4)Fmoc-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂的製備在步驟(3)的Fmoc-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂中，加入重量濃度為20 30% PIP的DMF溶液，脫帽反應，抽乾，用甲醇、DMF洗滌，抽乾，加入用DMF溶解的Fmoc-Ser (tBu) _0H、HBTU、HOBT、DIPEA的混合物，縮合反應，抽乾，用DMF洗滌，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得 Fmoc-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂；(5)Boc-Gly-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂的製備在步驟(4)的Fmoc-Ser (tBu)-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂中，加入重量濃度為20 30%PIP的DMF溶液，脫帽反應，抽乾，用甲醇、DMF洗滌，抽乾，加入用DMF溶解的Boc-Gly-OH、HBTU, HOBT, DIPEA的混合物，縮合反應，抽乾，用DMF洗滌，抽乾，獲得Boc-Gly-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂；(6)Gly-Ser-Trp-Phe-Arg 的製備在步驟(5)的Boc-Gly-Ser (tBu)-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂中，加入切肽試劑,反應,減壓除溶劑後，加入乙醚沉澱，收集沉澱物，用乙醚洗，P2O5真空乾燥，獲得切肽後的生長激素促分泌素粗品。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟(I)中，取2-氯-三苯氯甲基樹脂，用DCM浸泡，使樹脂溶脹，抽乾，加入溶於DMF的Fmoc-Arg (Pbf) -OH及DIPEA，於32 38°C反應I 2小時，再加甲醇繼續32 37°C反應25 35分鐘，優選30分鐘，抽乾，樹脂依次用甲醇、DMF洗滌，獲得Fmoc-Arg (Pbf)-樹脂；所說的三苯氯甲基樹脂顆粒為85-95目，取代度為0. 8 1. 2mmol/g ；DMF 中，Fmoc-Arg (Pbf)-OH 的含量為 O. 08 O. 12g/ml ；DIPEA與2-氯-三苯氯甲基樹脂的摩爾比為1: 5 7;Fmoc-Arg(Pbf)-OH與2-氯-三苯氯甲基樹脂的摩爾比為1: O. 9 1.1。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟(2) (5)中，30 32°C脫帽反應25 35分鐘，36 39 °C縮合反應65 75分鐘。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟(2) (5)中，各個組分的用量，以2-氯-三苯氯甲基樹脂為基準，為重量濃度為20 30% PIP的DMF溶液2-氯-三苯氯甲基樹脂=6 8 1，重量比；保護的胺基酸2-氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1.7 1，摩爾比；HBTU 2-氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1. 7 I，摩爾比；HOBT 2-氯-三苯氯甲基樹脂=1. 2 1. 7 I，摩爾比；DIPEA 2-氯-三苯氯甲基樹脂=1. 6 2. O I，摩爾比。
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，在步驟(5)的Boc-Gly-Ser(tBu)-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹脂中，加入預冷至5 7 °C的切肽試劑，32 35 °C反應2. O 3.O小時，所述的切肽試劑由如下體積比的組分組成TFA/TIS/Ph0H/3-Map/H20 =900/40ml/25ml/25/10ml。
7.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，經C18高效液相柱進行分離純化，再經冷凍乾燥後，製得生長激素促分泌素精品的方法，包括如下步驟將所述粗品溶於釋醋酸中，過濾，濾液經C18高效液相柱純化，柱直徑為210mm，柱長為245mm，流速為920ml/min ;檢測波長為:280nm;流動相:0. 15mol/L磷酸三乙胺乙腈(81 19，體積比);用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合併後去鹽，再除盡乙腈、凍幹，獲得成品。
全文摘要
本發明公開了一種固相多肽合成生長激素促分泌素五肽的方法，包括如下步驟以2-氯-三苯氯甲基樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護基團的胺基酸，其間依次脫去Fmoc-保護基團，用HBTU及HOBT為縮合劑進行接肽反應，得保護的五肽樹脂後，同步進行脫側鏈保護基團及切肽，收集切肽後的生長激素促分泌素粗品，並經C18高效液相柱進行分離純化，再經冷凍乾燥後，製得生長激素促分泌素精品。本發明的方法的有益效果是工藝穩定，副產物少，產品質量穩定，生產成本較低，三廢汙染較少。
文檔編號C07K7/06GK103012556SQ201110281279
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月21日 優先權日2011年9月21日
發明者周逸明, 崔頎, 蔡華成 申請人:上海蘇豪逸明製藥有限公司, 周逸明, 崔頎