具酶活性的重組羧肽酶b的生產的製作方法

2023-05-08 12:17:36 1

>摺疊特定活性(u/mg)對照1-不經胰蛋白酶處理0.00-不加蛋白0.00摺疊-CPB0.00-CPB-C0.08-ProCPB42.90-ProCPB-C20.901對照中「無胰蛋白酶」只是針對ProCPB-C而做。表IV指出具酶活性的CPB僅僅可從表達含有活性肽前體的細胞中產生，因而，活性肽對於CPB的正確摺疊是必不可少的。表IV亦指出具最佳活性的CPB通過含游離Cys290殘基的ProCPB(由質粒pλProCPB表達)摺疊和活化產生，而不能由含Cys290→Ser突變的ProCPB摺疊和活化產生。因而，Cys290顯然為最佳的摺疊和/或CPB的最高活性所必需。實施例6改進的ProCPB的摺疊I.來源於粗胞內沉澱物的ProCPB的摺疊ProCPB最佳的摺疊條件發現基本上與實施例4中確定的ProCPB-C的最佳摺疊條件一致。一個簡單的用於摺疊和活化ProCPB的方法如此進行使用粗胞內沉澱物，省略實施例2的第III部份所述的起始純化步驟。發現含ProCPB的粗胞內沉澱物(如實施例2中產生的)可以高蛋白濃度溶解於100mM甘氨酸，pH9.5和8M尿素溶液中(表V)。摺疊在優化的條件下室溫作用24小時。pH值升高到最適pH9.5(前已確定)。摺疊的ProCPB用胰蛋白酶(1∶50w/w)切割，CPB的特定活性按實施例3中所述方法測定。表V含粗胞內沉澱物的摺疊溶液中的蛋白濃度作用下CPB的特定活性表V指出具酶活性CPB可從來源於粗胞內沉澱物的ProCPB摺疊然後胰蛋白酶消化而得。而且，此CPB在所有測定的蛋白濃度下其酸活性水平相似。這個出乎意料的結果，因為摺疊前用DEAE-瓊脂糖純化的CPB(實施例2)在摺疊混合物中蛋白濃度增加時，其特定活性下降。顯然，胞內沉澱物含有幫助ProCPB摺疊的因子。II.通過摺疊來源於粗胞內沉澱物的ProCPB來擴大CPB(i)生產以42升帶有質粒pλProCPB並表達ProCPB的大腸桿菌4300中純化CPB至近乎均一。發酵和生長條件基本上與實施例2中所述一樣。粗胞內沉澱物用水洗，並以20mg/ml溶解於pH9.5，100mM甘氨酸，8M尿素溶液中，用pH9.5100mM甘氨酸稀釋至1mg/ml，加入0.1mMZnCl2，0.5mMGSH和0.1mMGSSG，生成的摺疊溶液於25℃孵育24小時。然後用HCl調其pH值為8.5，摺疊的ProCPB用胰蛋白酶(20μg/ml)於37℃消化1小時。用0.1mMPMSF滅活胰蛋白酶。(ii)純化具酶活性的CPB以20mg每ml樹脂的濃度加入到以20mMTris-HClpH8.0平衡的DEAE-瓊脂糖快速柱中(Pharmacia)。CPB以pH880mMNaCl，20mMTris-HCl洗脫。硫酸銨(0.8M)加入到DEAE洗脫液中，它可在20mMTris-HClpH8，0.8M硫酸銨平衡的苯基瓊脂糖快速柱(Pharmacia)中進一步層析分離。CPB被0.4M硫酸銨洗脫下來，濃縮，並對100mMNaCl，20mMTris-HCl，pH8透濾，然後貯於-20℃。在以上純化步驟中，42升帶質粒pλProCPB，O.D.660＝36的大腸桿菌4300按以上步驟處理，獲得1.25升特定活性為637u/mg的具酶活性CPB。所有步驟產量為60％左右。商業上豬羧肽酶B的特定活性在同樣的條件下測定為298u/mg。實施例7具酶活性CPB的特徵如實施例5和6所述生產的CPB具有與豬羧肽酶B相仿的生化和酶學特徵。依據其胺基酸組成所計算的重組CPB的消光係數為ε1％280＝19.7，商業的豬羧肽酶B的消光係數為ε1％280＝21.4(1)。重組CPB特定活性為637u/ml(馬尿醯-L-精氨酸底物)並且根據原子吸收光譜測定，每摩爾酶含1摩爾鋅原子。N-末端胺基酸序列分析揭示其為Ala-Ser-Gly-His-Ser，正如根據成熟的大鼠羧肽酶B的胺基酸序列分析(5)預計的一樣。重組CPB活性的最佳pH值用25mM如下緩衝液來確定NaOAc，pH4-6；Bis-Tris，pH6-7.5；Tris-HClpH7.5-9；和甘氨酸，pH9-12。CPB特定活性依實施例3所述方法測定。pH為8時獲得最好的CPB酶活性。CPB在55℃孵育導致50％的活力丟失而65℃則完全失活。用馬尿醯-L-精氨酸作底物來進行重組CPB的動力學分析。底物濃度高出0.5mM時便抑制CPB活力。進一步研究揭示重組體CPB被其催化產物精氨酸抑制，精氨酸是羧肽酶B的競爭性抑制劑。相應的Lineweaver-Burk曲線顯示Km值為0.38mM。重組CPB亦可被一種強二價離子螯合劑1，10-菲咯啉，因而證明Zn離子對CPB酶活性的重要性。在1mM1，10-菲咯啉存在時，可觀察到1mg/ml重組CPB50％的活力丟失。實施例8CPB將胰島素原轉變為胰島素如EP347781B1中所述的微胰島素原(Mini-Proinsulin)可用胰蛋白酶和實施例5和6中生產的重組CPB處理，使之轉變為胰島素。胰蛋白酶特異性地在其精氨酸殘基和A鏈之間切割。然後CPB特異地將精氨酸殘基從其B鏈的C-端水解下來。商業的人胰島素(Boehringer-Mannheim)可用作標準，同時胰蛋白酶和商業豬羧肽酶B切割的微胰島素原以及胰蛋白酶單獨切割的微胰島素原亦可用作標準。參考文獻1.Barrett和McDonald(1985)，《哺乳動物蛋白酶，詞彙和書目》第2卷，學院出版社，Orlando，Florida。2.Coll等(1991)，歐洲分子生物學聯合會雜誌，101-9。3.Burgos等(1991)，生物化學304082-4089。4.Titani等(1975)，美國國家科學院院報721666-1670。5.Clauser等(1988)，生物化學雜誌263(33)17837-17845。6.Yamamoto等(1992)，生物化學雜誌2672575-2581。7.Aviles等(1985)，生物化學和生物物理研究通訊13097-103。8.Yanofsky等(1981)，核酸研究96647-66689.Morinaga等(1984)，生物技術，7月636-639。10.Bradshaw等(1969)，美國國家科學院院報631389-1394。11.Folk(1970)，酶學方法19504-508。12.Gardell等(1988)，生物化學雜誌263(33)17828-17836。序列表(1)一般信息(i)申請人Bio-TechnologyGeneralCorp.(ii)發明題目具酶活性的羧肽酶B的生產(iii)序列數8(iv)通信地址(A)收信人CooperDunhamLLP(B)街道1185AvenueoftheAmericas(C)城市紐約(D)州紐約(E)國家美國(F)區號10036(v)機讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentInRelease#1.0，Version#1.30(vi)當前申請數據資料(A)申請號未知(B)提交日期1996年1月25日(C)類別(viii)委託/代理人信息(A)姓名White，JohnP.(B)登記號28,678(C)參考/檔案號0336/43847-A-PCT(ix)通訊信息(A)電話(212)278-0400(B)傳真(212)391-0525(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特徵(A)長度36個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學特徵線性(ii)分子類型cDNA(iii)前提無(iv)反義無(xi)序列描述SEQIDNO1GCGCATATGCATGCTTCCGAGGAGCACTTTGATGGC36(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特徵(A)長度285個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學特徵線性(ii)分子類型cDNA(iii)前提無(iv)反義無(ix)特徵(A)名稱/鍵CDS(B)位置1.285(xi)序列描述SEQIDNO2CATGCTTCCGAGGAGCACTTTGATGGCAACCGGGTGTACCGTGTCAGT48HisAlaSerGluGluHisPheAspGlyAsnArgValTyrArgValSer151015GTACATGGTGAAGATCACGTCAACTTAATTCAGGAGCTAGCCAACACC96ValHisGlyGluAspHisValAsnLeuIleGlnGluLeuAlaAsnThr202530AAAGAGATTGATTTCTGGAAACCAGATTCTGCTACACAAGTGAAGCCT144LysGluIleAspPheTrpLysProAspSerAlaThrGlnValLysPro354045CTCACTACAGTTGACTTTCATGTTAAAGCAGAAGATGTTGCTGATGTG192LeuThrThrValAspPheHisValLysAlaGluAspValAlaAspVal505560GAGAACTTTCTGGAGGAGAATGAAGTTCACTATGAGGTACTGATAAGC240GluAsnPheLeuGluGluAsnGluValHisTyrGluValLeuIleSer65707580AACGTGAGAAATGCTCTGGAATCCCAGTTTGATAGCCACACCCGT285AsnValArgAsnAlaLeuGluSerGlnPheAspSerHisThrArg859095(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特徵(A)長度95個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學特徵線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO3HisAlaSerGluGluHisPheAspGlyAsnArgValTyrArgValSer151015ValHisGlyGluAspHisValAsnLeuIleGlnGluLeuAlaAsnThr202530LysGluIleAspPheTrpLysProAspSerAlaThrGlnValLysPro354045LeuThrThrValAspPheHisValLysAlaGluAspValAlaAspVal505560GluAsnPheLeuGluGluAsnGluValHisTyrGluValLeuIleSer65707580AsnValArgAsnAlaLeuGluSerGlnPheAspSerHisThrArg859095(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特徵(A)長度38個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學特徵線性(ii)分子類型cDNA(iii)前提無(iv)反義無(xi)序列描述SEQIDNO4GCGCCATGGCAAGTGGACACAGCTACACCAAGTACAAC38(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特徵(A)長度927個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學特徵線性(ii)分子類型cDNA(iii)前提無(iv)反義無(ix)特徵(A)名稱/鍵CDS(B)位置1..927(xi)序列描述SEQIDNO5GCAAGTGGACACAGCTACACCAAGTACAACAACTGGGAAACGATTGAG48AlaSerGlyHisSerTyrThrLysTyrAsnAsnTrpGluThrIleGlu100105110GCGTGGATTCAACAAGTTGCCACTGATAATCCAGACCTTGTCACTCAG96AlaTrpIleGlnGlnValAlaThrAspAsnProAspLeuValThrGln115120125AGCGTCATTGGAACCACATTTGAAGGACGTAACATGTATGTCCTCAAG144SerValIleGlyThrThrPheGluGlyArgAsnMetTyrValLeuLys130135140ATTGGTAAAACTAGACCGAATAAGCCTGCCATCTTCATCGATTGTGGT192IleGlyLysThrArgProAsnLysProAlaIlePheIleAspCysGly145150155TTCCATGCAAGAGAGTGGATTTCTCCTGCATTCTGTCAGTGGTTTGTG240PheHisAlaArgGluTrpIleSerProAlaPheCysGlnTrpPheVal160165170175AGAGAGGCTGTCCGTACCTATAATCAAGAGATCCACATGAAACAGCTT288ArgGluAlaValArgThrTyrAsnGlnGluIleHisMetLysGlnLeu180185190CTAGATGAACTGGATTTCTATGTTCTGCCTGTGGTCAACATTGATGGC336LeuAspGluLeuAspPheTyrValLeuProValValAsnIleAspGly195200205TATGTCTACACCTGGACTAAGGACAGAATGTGGAGAAAAACCCGCTCT384TyrValTyrThrTrpThrLysAspArgMetTrpArgLysThrArgSer210215220ACTATGGCTGGAAGTTCCTGCTTGGGTGTAGACCCCAACAGGAATTTT432ThrMetAlaGlySerSerCysLeuGlyValAspProAsnArgAsnPhe225230235AATGCTGGCTGGTGTGAAGTGGGAGCTTCTCGGAGTCCCTGCTCTGAA480AsnAlaGlyTrpCysGluValGlyAlaSerArgSerProCysSerGlu240245250255ACTTACTGTGGACCAGCCCCAGAGTCTGAAAAAGAGACAAAGGCCCTG528ThrTyrCysGlyProAlaProGluSerGluLysGluThrLysAlaLeu260265270GCAGATTTCATCCGCAACAACCTCTCCACCATCAAGGCCTACCTGACC576AlaAspPheIleArgAsnAsnLeuSerThrIleLysAlaTyrLeuThr275280285ATCCACTCATACTCACAGATGATGCTCTACCCTTACTCCTATGACTAC624IleHisSerTyrSerGlnMetMetLeuTyrProTyrSerTyrAspTyr290295300AAACTGCCTGAGAACTATGAGGAATTGAATGCCCTGGTGAAAGGTGCG672LysLeuProGluAsnTyrGluGluLeuAsnAlaLeuValLysGlyAla305310315GCAAAGGAGCTTGCCACTCTGCATGGCACCAAGTACACATATGGCCCA720AlaLysGluLeuAlaThrLeuHisGlyThrLysTyrThrTyrGlyPro320325330335GGAGCTACAACAATCTATCCTGCTGCTGGGGGATCTGACGACTGGTCT768GlyAlaThrThrIleTyrProAlaAlaGlyGlySerAspAspTrpSer340345350TATGATCAGGGAATCAAATATTCCTTTACCTTTGAACTCCGGGATACA816TyrAspGlnGlyIleLysTyrSerPheThrPheGluLeuArgAspThr355360365GGCTTCTTTGGCTTTCTCCTTCCTGAGTCTCAGATCCGCCAGACCTGT864GlyPhePheGlyPheLeuLeuProGluSerGlnIleArgGlnThrCys370375380GAGGAGACAATGCTTGCAGTCAAGTACATTGCCAATTATGTCCGAGAA912GluGluThrMetLeuAlaValLysTyrIleAlaAsnTyrValArgGlu385390395CATCTATATTAGTGA927HisLeuTyr**400(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特徵(A)長度309個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學特徵線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO6AlaSerGlyHisSerTyrThrLysTyrAsnAsnTrpGluThrIleGlu151015AlaTrpIleGlnGlnValAlaThrAspAsnProAspLeuValThrGln202530SerValIleGlyThrThrPheGluGlyArgAsnMetTyrValLeuLys354045IleGlyLysThrArgProAsnLysProAlaIlePheIleAspCysGly505560PheHisAlaArgGluTrpIleSerProAlaPheCysGlnTrpPheVal65707580ArgGluAlaValArgThrTyrAsnGlnGluIleHisMetLysGlnLeu859095LeuAspGluLeuAspPheTyrValLeuProValValAsnIleAspGly100105110TyrValTyrThrTrpThrLysAspArgMetTrpArgLysThrArgSer115120125ThrMetAlaGlySerSerCysLeuGlyValAspProAsnArgAsnPhe130135140AsnAlaGlyTrpCysGluValGlyAlaSerArgSerProCysSerGlu145150155160ThrTyrCysGlyProAlaProGluSerGluLysGluThrLysAlaLeu165170175AlaAspPheIleArgAsnAsnLeuSerThrIleLysAlaTyrLeuThr180185190IleHisSerTyrSerGlnMetMetLeuTyrProTyrSerTyrAspTyr195200205LysLeuProGluAsnTyrGluGluLeuAsnAlaLeuValLysGlyAla210215220AlaLysGluLeuAlaThrLeuHisGlyThrLysTyrThrTyrGlyPro225230235240GlyAlaThrThrIleTyrProAlaAlaGlyGlySetAspAspTrpSer245250255TyrAspGlnGlyIleLysTyrSerPheThrPheGluLeuArgAspThr260265270GlyPhePheGlyPheLeuLeuProGluSerGlnIleArgGlnThrCys275280285GluGluThrMetLeuAlaValLysTyrIleAlaAsnTyrValArgGlu290295300HisLeuTyr**305(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學特徵線性(ii)分子類型cDNA(iii)前提無(xi)序列描述SEQIDNO7CGCGGATCCTCACTAATATAGATGTTCTCGGACATAATT39(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特徵(A)長度27個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學特徵線性(ii)分子類型cDNA(iii)前提無(xi)序列描述SEQIDNO8ATCCGCCAGACTAGTGAGGAGACAATG2權利要求1.一種生產具酶活性CPB的方法，包括(a)處理一種含編碼ProCPB的DNA的重組體細胞，使得此DNA指導ProCPB的表達；(b)從細胞中回收表達的ProCPB；(c)在允許ProCPB摺疊的條件下處理回收的ProCPB；(d)將摺疊的ProCPB酶切處理，產生具酶活性的CPB；(e)純化具酶活性的CPB。2.根據權利要求1的方法，其中回收步驟(b)包括(i)破壞重組體細胞的細胞壁或其片段，產生細胞裂解液；(ii)通過離心從裂解液中分離胞內沉澱物；(iii)將沉澱溶於5.根據權利要求1的方法，其中酶切步驟(d)包括(i)調節pH至約8.5；和(ii)用胰蛋白酶於37℃作用約60分鐘切割ProCPB。6.根據權利要求1的方法，其中純化步驟(e)包括離子交換層析。7.根據權利要求1的方法，其中純化步驟(e)包括離子交換層析和疏水層析。8.根據權利要求1的方法，其中純化步驟(e)包括離子交換層析、疏水層析和透濾。9.根據權利要求1的方法，其中ProCPB由保藏於ATCC保藏號69673的質粒pλProCPB表達。10.具酶活性CPB，不含其他來源於哺乳動物的物質。全文摘要本發明提供了一種生產具酶活性的CPB的方法,它包括將一種含有編碼ProCPB的DNA的重組體細胞處理,使得此DNA指導ProCPB的表達,再從這些細胞中回收所表達的ProCPB,然後在ProCPB可摺疊的條件下處理回收的ProCPB,將摺疊的ProCPB酶切處理產生具酶活性的CPB,並純化此具酶活性的CPB。文檔編號C07K14/62GK1177377SQ96192367公開日1998年3月25日申請日期1996年1月25日優先權日1995年1月25日發明者J·哈爾曼,N·胡爾加,S·門德羅維赫,M·高雷基申請人:生物技術通用公司