一株新型廣譜抗臨床和植物致病真菌的芽孢桿菌及其應用的製作方法
2023-05-08 01:33:31 1
專利名稱：一株新型廣譜抗臨床和植物致病真菌的芽孢桿菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種新型廣譜抑制臨床和植物致病真菌的細菌菌株Bacillus sp.AH-E-1及其應用。更具體地說,是涉及一種具有廣譜抗真菌功能的新型生防細菌和益生菌。
背景技術：
人類真菌感染一般分為兩大類:淺部真菌感染和深部真菌感染。淺部真菌感染通常是由各種皮膚癬菌引起，主要侵犯皮膚、毛髮、指甲等；而深部感染通常由白色念珠菌、新生隱球菌、粗球孢子菌等引起，主要侵犯內臟器官和深部組織，危害性很大，常可危及生命。近年來，隨著廣譜抗菌藥物和免疫抑制藥的大量使用，以及腫瘤化療、器官移植和愛滋病的出現，產生免疫抑制的個體不斷增多，使真菌感染的發病率呈上升趨勢，耐藥現象增多，真菌感染日益引起人們關注。據世界衛生組織(WHO) 2004年統計估計，全球每年的系統性真菌感染人數為33.5萬。其中最常見的是系統性念珠菌病，約佔所有此類感染的70%左右，而其引起的死亡率又高達40%左右。同樣，真菌病害也一直是危害植物生長、影響作物產量的主要病害，如何有效地防治真菌病害一直是育種學家們努力攻克的難題。據統計，抗真菌藥物在全球抗感染藥市場中排列第三位，總銷售額約為40億-42億美元，來自輝瑞公司的一份資料顯示，近20年來，深部真菌感染呈持續增多趨勢。面對臨床的迫切需要，抗真菌藥的進步似乎差強人意。目前，臨床上應用的抗真菌藥仍然以化學藥物為主，如氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、卡泊芬淨、特比萘芬等，而我國真菌感染的廣譜治療依賴於兩性黴素及其脂質體、5-氟胞嘧啶、氟康唑和伊曲康哇。但嚴重的毒性作用如腎臟損害限制了兩性黴素的使用，5-氟胞嘧啶亦存在毒副作用及耐藥問題，氟康唑和伊曲康唑儘管相對安全些，但在應用中亦出現耐藥現象及天然耐藥菌株，另外，氟康唑雖為WHO推薦的深度真菌感染首選用藥，對白色念珠菌和新生隱球菌效果最好，但對克柔念珠菌和光滑念珠菌效果差，對曲菌無效。新研發的卡泊芬淨、米卡芬淨等作用於細胞壁的新型抗生素具有高選擇性、安全性高、耐藥少見等明顯優勢，是念珠菌感染和麴黴感染的首選治療方案，但由於其價格昂貴，專利保護期很長，因此也限制了其在我國臨床中的應用，另外，該藥對隱球菌無效。因此，我國迫切需要研製一種具有自主智慧財產權的、高效、廣譜、低毒安全的新型抗真菌藥物。芽胞桿菌是一類好氧、能產芽胞的革蘭氏陽性杆狀細菌，在自然界中分布非常廣泛，生理特性豐富多樣，是土壤和植物微生態的優勢種群。由於它能產生脂肽抗生素、細胞壁降解酶類、細菌素和其它抗菌蛋白及揮發性抗菌物質，對某些植物病原真菌或細菌、甚至某些動物病原菌、病毒、支原體、腫瘤細胞均表現出一定的抑制作用，再加上這類細菌通過發酵可以大規模獲得，產生的芽孢對高熱、極酸、紫外線具有很強的耐受力，因此，近幾年來成為國內外的研究熱點，已報導的能抑制真菌生長的芽孢桿菌主要包括枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、蘇雲金芽孢 桿菌(B.thuriniensis)、臘狀芽孢桿菌(B.cereus)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、多粘芽孢桿菌(B.polymyxa)、解澱粉芽孢桿菌(B.amyloloquefaci)等。然而，這些芽孢桿菌主要針對植物絲狀致病真菌具有明顯的效果，對於人類淺部真菌和深部真菌病原體，卻未見抗真菌效果研究和報導。
發明內容
本發明的目的是提供一株可以廣譜抑制臨床和植物致病真菌的新型細菌菌株Bacillus sp.AH-E-1,其分類屬於芽孢桿菌。本發明的目的是提供製備Bacillus sp.AH-E-1抗真菌物質的方法，其特徵在於:發酵培養基為土豆液體培養基，培養基組成為(g/U:鮮土豆，500g ;葡萄糖,20g ;pH自然。本發明公開了 Bacillus sp.AH-E-1抑制的臨床致病真菌種類，它至少包括以下20種絲狀真菌和酵母菌:黃麴黴、煙麴黴、須癬毛癬菌、裴氏著色真菌、構巢麴黴、黑麴黴、卡氏分枝孢子菌、申克孢子絲菌、緊密著色真菌、紅色毛癬菌、犬小孢子菌、總狀毛黴、雜色麴黴、疣狀著色真菌、熱 帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑假絲酵母、克柔念珠菌、近平念珠菌、新生隱珠菌。本發明公開了 Bacillus sp.AH_E_1抑制的植物致病真菌的種類，它至少包括以下13種絲狀真菌:葡萄球座菌、花生莖點黴、馬爾可夫葉點黴、稻瘟病菌、葡枝根黴、蘋果黑腐皮殼菌、彎孢菌、棉花炭疽、禾穀鐮孢、葡萄座腔菌、辣椒疫黴、茄鏈格孢、禾穀絲核菌。本發明所述的細菌菌株Bacillus 8口.麼11-￡-1,其特徵在於:1^(3；[11118 sp.AH-E-1產生的抗真菌物質具有較好的熱穩定性，在100°c下作用5分鐘後仍保持明顯的抑真菌活性。本發明所述的細菌菌株Bacillus sp.AH_E_1,其特徵在於:pH值(2_11)不影響Bacillus sp.AH-E-1產生的抗真菌物質活性。本發明具有以下優點:抑真菌譜廣；抑菌效果明顯；發酵培養基簡單。
圖1為Bacillus sp.AH-E-1在光學顯微鏡下得形態圖。(A)菌體；⑶芽孢。圖2 為 Bacillus sp.AH-E-1 的 16S rDNA 的系統發育樹。圖3為Bacillus sp.AH-E-1與不同真菌28 °C下共培養5_7天後的菌絲形態(X400)。(A)對照組:構巢麴黴(A1)，犬小孢子菌(A2)，煙麴黴(A3)，緊密著色真菌(A4)，紅色毛癬菌(A5)；(B)實驗組:構巢麴黴(B1)，犬小孢子菌(B2)，煙曲霧(B3)，緊密著色真菌(B4)，紅色毛癬菌(B5)。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明所涉及的廣譜抑真菌新型細菌菌株Bacillussp.AH-E-1做進一步描述。實施例1:細菌的鑑定分別採用形態學方法、傳統生理生化方法和16s rRNA基因測序方法對Bacillussp.AH-E-1進行鑑定。
(I)形態學觀察將Bacillus sp.AH-E-1在營養瓊脂平板上劃線，37°C培養24小時後觀察菌落形態，可以看到:菌落圓形，白色，表面乾燥，邊緣不光滑。挑取單菌落染色後，鏡檢觀察菌體形態，可以看到(圖1):菌株為革蘭氏陽性，具芽孢，芽孢為橢圓或柱型，不明顯膨大，芽孢近中生，菌體兩端圓。(2)生理生化鑑定以蠟樣芽孢桿菌(CGMCC1.229)、枯草芽孢桿菌(CGMCC1.892)、短小芽孢桿菌(CGMCC1.894)、解澱粉芽孢桿菌(CGMCC 1.1099)、蘇雲金芽孢桿菌(CGMCC 1.785)、地衣芽孢桿菌(CGMCC 1.813)為對照，參考《伯傑氏細菌系統分類手冊》和《一般細菌常用鑑定方法》進一步做生理生化鑑定。結果表明，Bacillus sp.AH-E-1的生理生化反應不同於其它標準株(表I)。利用Biolog儀器對其進一步鑑定，結果表明，該菌為未知菌。表I芽孢桿菌屬生理生化鑑定結果
權利要求
1.株可以廣譜抑制臨床和植物致病真菌的新型細菌菌株Bacillus sp.AH-E-1，其分類屬於芽孢桿菌。
2.一種採用權利要求1所述菌株製備抗真菌物質的方法，其特徵在於:發酵培養基為土豆液體培養基，培養基組成為(g/L):鮮土豆,500g ;葡萄糖,20g ;pH自然。
3.根據權利要求1所述的細菌菌株，其特徵在於:抑制的臨床致病真菌至少包括以下20種絲狀真菌和酵母菌:黃麴黴、煙麴黴、須癬毛癬菌、裴氏著色真菌、構巢麴黴、黑麴黴、卡氏分枝孢子菌、申克孢子絲菌、緊密著色真菌、紅色毛癬菌、犬小孢子菌、總狀毛黴、雜色麴黴、疣狀著色真菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑假絲酵母、克柔念珠菌、近平念珠菌、新生隱珠菌。
4.根據權利要求1所述的細菌菌株，其特徵在於:抑制的植物致病真菌至少包括以下13種絲狀真菌:葡萄球座菌、花生莖點黴、馬爾可夫葉點黴、稻瘟病菌、葡枝根黴、蘋果黑腐皮殼菌、彎孢菌、棉花炭疽、禾穀鐮孢、葡萄座腔菌、辣椒疫黴、茄鏈格孢、禾穀絲核菌。
5.根據權利要求1所述的細菌菌株Bacillus8卩.六11-￡-1,其特徵在於:1^(3；[11118sp.AH-E-1產生的抗真菌物質具有較好的熱穩定性，在100°C下作用5分鐘後仍保持明顯的抑真菌活性。
6.根據權利要求1所述的細菌菌株BaciIIussp.AH-E-1，其特徵在於:pH值(2_11)不影響其產生的抗真菌物質 活性。
全文摘要
本發明涉及一種廣譜抑制臨床和植物致病真菌的新型細菌菌株Bacillus sp.AH-E-1及其應用。其主要內容包括(1)Bacillus sp.AH-E-1為一新發現的芽孢桿菌菌株或亞種；(2)Bacillus sp.AH-E-1在適宜條件下進行發酵生產抗真菌物質；(3)Bacillus sp.AH-E-1可以明顯抑制黃麴黴、煙麴黴、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、光滑念珠菌、新生隱珠菌等20種臨床致病真菌；(4)Bacillus sp.AH-E-1可以明顯抑制葡萄球座菌、稻瘟病菌、葡枝根黴等13種植物致病真菌。本發明提供了一種優良的新型抗真菌物質生產菌株，具有抑真菌譜廣、作用效果明顯等優點。
文檔編號C12N1/20GK103087939SQ20111034926
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月8日 優先權日2011年11月8日
發明者金敏, 李君文, 陳娜, 邱志剛, 諶志強, 陳照立, 王新為 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所