一種人源抗人IgE的抗體Fab片段、編碼基因及用途的製作方法
2023-05-08 07:01:11 1
專利名稱：一種人源抗人IgE的抗體Fab片段、編碼基因及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種人源抗人IgE的抗體Fab片段、編碼基因及用途，具體涉及應用天然人源免疫球蛋白基因文庫篩選抗人IgE的人源抗體Fab片段、編碼基因及用途。
背景技術：
近年來，免疫球蛋白E(IgE)介導的過敏性疾病的發病率逐年上升，並且極大地危害著人們的健康。2005年8月，世界變態反應組織(WAO)於首個過敏性疾病日公布了全球 30多個國家的調查結果，顯示在這些國家總共12億人口中，22% O. 5億人)患有免疫球蛋白E(IgE)介導的過敏性疾病，如食物過敏、藥物過敏、過敏性鼻炎、哮喘等。Marone等人於1966年首次從過敏性疾病患者血清中分離出IgE，世界衛生組織(WHO)於1968年確認其為一種新的免疫球蛋白。所述的IgE是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四聚體，其重鏈恆定區與其高親和力受體Fc ε RI的結合是過敏性疾發生的始動因素；IgE與其高親和力受體 Fc ε RI的結合部位是重鏈恆定區的第3段(C ε 3)和第4段(C ε 4)，恆定區的第2段(C ε 2) 對於結合常數及熱力學參數等沒有明顯影響；因此，IgE與Fc ε RI的相互作用等同於IgE C3-C4與Fc ε RI的相互作用。IgE與肥大細胞或嗜鹼性粒細胞表面的Fc ε RI結合後，可激活肥大細胞或嗜鹼性粒細胞，使其脫顆粒，從而釋放組胺等過敏介質最終導致過敏性疾病的發生。目前，臨床治療常用的抗過敏療法以脫敏療法為主，抗炎和緩解症狀是其主要目的，但是上述療法有時會有嚴重的副反應。隨著科技的不斷進步，用於治療過敏性疾病的抗體藥物(抗IgE、抗L-4、抗⑶23等)不斷發展。2003年6月，人源化的抗IgE抗體藥物索雷爾(omalizumab)被美國食品和藥物管理局(FDA)批准上市，用於治療過敏性哮喘；但由於該藥物是對鼠的抗體進行人源化，所以有時會有嚴重的不良反應，美國FDA只建議12歲以上的患者使用。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的缺陷和不足，提供一種人源抗人IgE的抗體 Fab片段、編碼基因及用途。本發明所述的人源Fab抗體選自天然人源免疫球蛋白基因文庫，為以重組 IgEC3-C4蛋白篩選天然人源免疫球蛋白基因文庫，並經過ELISA測序分析等從庫中篩選到抗人IgE的人源抗體Fab片段，經大量的表達純化及進一步的鑑定，證實所述的人源抗人 IgE的抗體Fab片段能特異性識別人IgE，並與其有較高的親和力，同時可抑制IgE介導的肥大細胞脫顆粒和組胺釋放。本發明與現有人源化的抗IgE抗體藥物索雷爾(omalizumab)相比，構建的基因文庫是以人的外周血淋巴細胞cDNA為模板，所得抗體的基因完全為人來源，即所得抗體為完全人源的抗體，沒有人鼠嵌合抗體的人抗鼠抗體反應，可長期而安全的用於治療。
具體而言，本發明提供了下述能編碼識別人IgE的人源Fab片段及其編碼基因，然而產生本發明的基因序列的方法不受特別的限制。本發明所述的人源抗人IgE的抗體Fab片段的編碼基因，包括輕鏈V區和重鏈V 區；所述輕鏈V區的基因含有序列1的核苷酸序列，所述重鏈V區的基因含有序列17的核苷酸序列；所述的輕鏈V區含有序列2的胺基酸序列；所述的輕鏈 V 區由互補決定區(complementarity-determining region, CDR)禾口框架區FR (framework region, FR)構成；所述CDR含有序列6、10和14的胺基酸序列；所述的FR含有序列4、8、12和16的胺基酸序列；所述的重鏈V區含有序列18的胺基酸序列；所述的重鏈V區由互補決定區⑶R和框架區FR構成；所述⑶R含有序列22、沈和 30的胺基酸序列；所述的FR含有序列20、24、觀和32的胺基酸序列。本發明中，所述的人源抗人IgE的抗體Fab片段通過下述方法製得通過構建天然人源免疫球蛋白基因文庫並通過克隆印跡法、ELISA、測序分析從所構建的天然人源免疫球蛋白基因文庫中篩選，得到抗人IgE的人源抗體Fab片段，進行表達純化及與IgE C3-C4的親和力測定；通過體外抑制IgE介導的肥大細胞脫顆粒和組胺釋放實驗，證實抗人IgE的人源抗體可抑制肥大細胞脫顆粒和組胺釋放。本發明中，含有編碼本發明的抗人IgE人源抗體Fab片段基因的質粒載體構成了本發明的一個部分。本發明提供了一種表達載體，該表達載體優選為一種質粒，其含有編碼所述的重鏈V區的DNA和所述的輕鏈V區的DNA，它能插入編碼本發明的抗人IgE人源抗體Fab片段的基因。本發明的質粒不受特別限制，優選pFab-Hi s2。表達本發明的抗人IgE人源抗體Fab片段的宿主細胞構成了本發明的一個部分。本發明提供了一種大腸桿菌JM109感受態細胞為宿主細胞，它能表達本發明的抗人IgE人源抗體Fab片段。本發明的宿主細胞不受特別的限制，可為大腸桿菌、酵母或真核細胞等。本發明通過構建抗人IgE人源免疫球蛋白基因文庫並經過克隆印跡法、ELISA、測序分析、體外肥大細胞脫顆粒和組胺抑制實驗等從所述天然人源免疫球蛋白基因文庫中篩選得到具有抗人IgE人源抗體Fab片段，命名為Lib8，而後進行了大量的表達純化及進一步的鑑定。在本發明的實施中，篩選能表達抗人IgE人源抗體Fab片段的質粒載體的方法不受特別的限制，可通過例如免疫印跡、ELISA等進行選擇。本發明的實施中，純化抗人IgE人源抗體Fab片段的方法不受特別的限制，但首選是通過表達蛋白上攜帶的6 XHis Tag經Ni-NTA柱純化。本發明所製備的單克隆抗體鑑定的方法不受特別限制，如聚丙烯醯胺凝膠電泳、 Western blotting 等。本發明的另一個目的在於提供含有上述的Fab片段為活性成分的藥物組合物。本發明的進一步目的是提供上述人源Fab抗體的用途。所述的抗體Fab片段可用於製備由IgE引起的變態反應疾病的抗體藥物。
與鼠源抗人IgE抗體相比較，本發明的抗人IgE人源抗體Fab片段的編碼基因全部為人源，避免了人源化的鼠單克隆抗IgE抗體用於人體治療時產生的人抗鼠抗體反應 (HAMA)以及超敏反應等副作用，同時，本發明的抗人IgE的人源抗體Fab在體外實驗中能有效抑制由IgE引起的肥大細胞脫顆粒及組胺釋放，可在將來用於由IgE引起的變態反應疾病的治療方面具有重要的應用價值。本發明的人源抗人IgE的抗體Fab片段，為全人源並無Fc段，可發揮抑制IgE介導的過敏反應的作用，同時不會激活補體和引起人體免疫反應等病理損害，可用於製備由IgE 弓I起的變態反應疾病的抗體藥物。
圖 1 質粒載體 pFabl_His2。圖2重組IgE C3-C4蛋白的表達。圖3重組IgE C3-C4蛋白的斑點印跡試驗結果。圖4抗人IgE的人源抗體Fab的陽性克隆重鏈可變區⑶R、FR劃分。圖5抗人IgE的人源抗體Fab的陽性克隆輕鏈可變區⑶R、FR劃分。圖6大量表達後純化抗人IgE的人源抗體Fab的陽性克隆電泳結果。圖7抗人IgE的人源抗體Fab的陽性克隆的Western反應結果。圖8抗人IgE的人源抗體Fab的肥大細胞的組胺釋放抑制試驗結果。
具體實施例方式下面通過實施例更具體的說明本發明。實施例1構建天然人源免疫球蛋白基因文庫取300名健康人的外周抗凝血(每人5ml)，以Ficol 1-Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden)分離淋巴細胞，以試劑盒 ^!IAGEN GmbH, Hilden, Germany)提取總 RNA ；將總 RNA用 Gene-Amp RNA PCR試劑盒(Perkin-Elmer Cetus,Norwalk,Conn)以 01igo(dT)16 逆轉錄成cDNA，並以人IgG輕重鏈可變區保守序列的上、下遊引物(Invitrogen)(如表1 所示)進行免疫球蛋白Y、κ、λ鏈基因的PCR擴增；PCR產物經試劑盒OiIAGEN GmbH, Hilden, Germany)提純後，分別以 AscI 和 NheI (NEW ENGLAND BioLabs)雙酶切 κ 鏈和 λ 鏈產物。酶切後的κ鏈和λ鏈產物與人免疫球蛋白Fab表達載體pFab-His2(如圖1所示)連接，隨後電轉入大腸桿菌JM109(Takara，中國大連)中，構成輕鏈庫。分別以SfiI和 NotI(NEWENGLAND BioLabs)對輕鏈庫及Y鏈PCR產物進行酶切修飾，連接反應後，電轉導入大腸桿菌JM109中，構成9X107的非依賴性克隆滴度的抗體庫。表1人IgG輕重鏈可變區保守序列的上下遊引物序列
權利要求
1.一種人源抗人IgE的抗體Fab片段，包括輕鏈V區和重鏈V區，其特徵在於，所述輕鏈V區的基因含有序列1的核苷酸序列，所述重鏈V區的基因含有序列17的核苷酸序列。
2.按權利要求1所述的人源抗人IgE的抗體Fab片段，其特徵在於，所述的輕鏈V區含有序列2的胺基酸序列。
3.按權利要求1或2所述的人源抗人IgE的抗體Fab片段，其特徵在於，所述的輕鏈V 區由互補決定區和框架區構成；所述互補決定區含有序列6、10和14的胺基酸序列，所述的框架區含有序列4、8、12和16的胺基酸序列。
4.按權利要求1所述的人源抗人IgE的抗體Fab片段，其特徵在於，所述的重鏈V區含有序列18的胺基酸序列。
5.按權利要求1或4所述的人源抗人IgE的抗體Fab片段，其特徵在於，所述的重鏈V 區由互補決定區和框架區構成；所述的互補決定區含有序列22 J6和30的胺基酸序列，所述的框架區含有序列20、24、觀和32的胺基酸序列。
6.一種表達載體，其特徵在於，含有編碼權利要求2所述的輕鏈V區的DNA和編碼權利要求4所述的重鏈V區的DNA。
7.按權利要求6，其中所述的表達載體為一種質粒，選自pFab-His2。
8.一種含權利要求6所述的表達載體的宿主細胞。
9.基於權利要求8，所述的宿主細胞為大腸桿菌、酵母或真核細胞。
10.基於權利要求9，所述的宿主細胞為大腸桿菌JM109。
11.一種藥物組合物，其特徵在於，含有權利要求1的Fab片段。
12.權利要求1所述的人源抗人IgE的抗體Fab片段的製備方法，其特徵在於，其包括步驟通過構建天然人源免疫球蛋白基因文庫並通過克隆印跡法、ELISA、測序分析從所構建的天然人源免疫球蛋白基因文庫中篩選，得到抗人IgE的人源抗體Fab片段，進行表達純化及與IgE C3-C4的親和力測定；通過體外抑制IgE介導的肥大細胞脫顆粒和組胺釋放實驗， 證實抗人IgE的人源抗體可抑制肥大細胞脫顆粒和組胺釋放。
13.權利要求1所述的人源抗人IgE的抗體Fab片段在製備由IgE引起的變態反應疾病的抗體藥物中的用途。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，涉及一種人源抗人IgE的抗體Fab片段、編碼基因及用途。本發明以重組IgE C3-C4蛋白篩選天然人源免疫球蛋白基因文庫，並經過ELISA測序分析等從庫中篩選到抗人IgE的人源抗體Fab片段，經大量的表達純化及進一步的鑑定，證實所述的人源抗人IgE的抗體Fab片段能特異性識別人IgE，並與其有較高的親和力，同時可抑制IgE介導的肥大細胞脫顆粒和組胺釋放。本發明的人源抗人IgE的抗體Fab片段，為全人源並無Fc段，發揮抑制IgE介導的過敏反應的作用，同時不會激活補體和引起人體免疫反應等病理損害，可用於製備由IgE引起的變態反應疾病的抗體藥物。
文檔編號C12N15/63GK102399289SQ20111032588
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者付永鋒, 曹伯良, 楊彬, 程訓佳, 蔡俊龍 申請人:復旦大學