配子體花粉自交不親和性基因及其應用的製作方法

2023-05-08 06:17:46

專利名稱：：配子體花粉自交不親和性基因及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明是關於顯花植物金魚草配子體自交不親和性(gametophyticself-incompatibility，GSI)位點(S位點)中一個基因的克隆，即花粉自交不親和性基因(花粉S基因)，AhSLF-S2(AntirrhinumhispanicumSLocusF-box-S2)。本發明涉及AhSLF-S2的cDNA序列。金魚草S位點編碼的AhSLF-S2與自交不親和性在花粉中的表達密切相關。本發明進一步涉及可用於金魚草S2等位基因型鑑定的部分AhSLF-S2序列及其相關的寡聚核苷酸引物。本發明的主要用途是對自交不親和金魚草及其相關植物進行花粉S基因型的快速鑑定和分離配子體花粉S基因的方法。高等植物花粉落到柱頭上後開始萌發，然後花粉管沿著雌蕊細胞間隙或表面生長，最終到達子房完成雙受精過程。由於植物很難自主控制落到其柱頭上的花粉，它們在長期進化過程中形成許多在受精前區分有利花粉的策略，有些種類花粉將被阻止萌發或生長。這類被抑制的花粉有來自不同種植物的，還有來自同種植物但與該個體基因型過於一致的(比如來自同一植株的花粉)，前者稱為種間不親和性(inter-specificincompatibility)，後者稱為種內不親和性(intra-specificincompatibility)。事實上，種間不親和性益於保持物種的穩定性，種內不親和性則可促進種內的遺傳變異。這兩種不親和性的發生涉及許多複雜的受遺傳控制的相互作用，包括細胞間的相互識別，細胞內和細胞間的信號傳導，以及許多其它相關的影響因子，其中任一過程受阻都可能導致不親和性。在種內不親和性中，最典型的代表是自交不親和性(self-incompatibility，簡稱為SI)，表現為正常可育的雌雄同花植物自花授粉不能產生種子(deNettancourt，1977)。在高等植物中，據估計有超過一半的物種表現出自交不親和性，並被認為在被子植物早期進化中起到了不可低估的作用(deNettancourt，1977)。絕大多數SI植物在遺傳上受具有復等位基因的單一位點或基因座(稱為Slocus)控制(deNettancourt，1977)。單位點SI又可根據花粉不親和表型的遺傳控制方式的不同分為兩類，一類是花粉的自交不親和表型由其攜帶的單倍體S等位基因型決定，即配子體自交不親和性(gametophyticself-incompatibility，GSI)；另一類為孢子體自交不親和性(sporophyticself-incompatibility，SSI)，即花粉表型由產生花粉的植株即二倍體孢子體S等位基因型決定。早期人們認為這兩種機制間的不同可能是由於S基因表達時間的差異造成的。SSI的S基因產物在減數分裂前合成，並均勻分布在兩種不同S基因型的單倍體花粉胞被上，而GSI的S基因產物則在減數分裂後合成，只存在於各自的花粉中(Newbiginetal，1993)。但是，現有的證據表明SSI植物的花粉自交不親和性(花粉S)基因產物為配子體表達模式，只是由於花粉S基因產物為分泌到花粉細胞外的胞被蛋白，因此一個花粉可以攜帶來自兩個不同花粉S基因產物，造成了與孢子體S基因型一致的結果(Stephensonetal，1997；Doughtyetal，1998；Schopferetal.，1999；Cuietal.，2000；Takayamaetal.，2000)。大多數SI植物表現為GSI，目前較為細緻地研究了其中的茄科，薔薇科，玄參科和罌粟科植物(Andersonetal.，1986；Franklinetal.，1995；Xueetal.，1996；Sassaetal.，1996；KaoandMcCubbin，1997)。在前三科的自交不親和植物中，不親和花粉可在柱頭表面萌發，花粉管生長的抑制發生在傳遞組織中，在此導致不親和花粉的花粉管生長的抑制，然而罌粟的不親和花粉在柱頭表面萌發後即受到抑制。通常，根據SI的遺傳、生理特性，要分離S等位基因產物就需要尋找與特異S基因共分離的雌蕊或花粉蛋白。比如，要分離植株在雌蕊中S1基因型的特異產物，就要尋找一類在所有具S1基因的植株中都有，而在所有無S1基因的植株中都沒有的雌蕊特異蛋白。1952年，Lewis在配子體自交不親和植物月見草(Oenotheraorganesis)中首次發現了與特定S等位基因相關的蛋白質。此後，研究人員從茄科等植物中發現含量豐富並與S位點遺傳連鎖的花柱糖蛋白(Slocusglycoproteins，SLG)。通過設計與這些糖蛋白N-端序列同源的寡核苷酸探針和分子雜交的方法，1986年，Anderson等從花菸草(Nicotianaalata)中第一次分離到與GSI相關的編碼S位點花柱糖蛋白的cDNA。DNA序列分析發現其蛋白產物與真菌的一類RNaseRh和T2(Kawataetal.，1988)具有同源性，且其含同樣的活性部位，因此具有RNase活性，故而稱為S—核酸酶(S-RNases)(McClureetal.，1989)。目前已有的證據證明S-RNase控制自交不親和性在花柱中的表達(花柱S基因)(Andersonetal.，1986and1989；Cornishetal.，1987；McClure，etal.，1989and1990；Aietal.，1990；Huangetal.，1994；Leeetal.，1994；Xueetal.，1996；Sassaetal.，1997；Zureketal.，1997；Mattonetal.，1997and1999；Doddsetal.，1999)。但是，目前在GSI植物中還沒有分離到花粉S基因產物。因此，本發明的目的是分離GSI植物的花粉S基因，並研究所分離的基因和發展快速鑑定金魚草花粉自交不親和表型及其分離花粉S基因的方法。本發明的另一個目的是提供一種鑑定金魚草植株之間自交親和性的方法。本發明提供了一種鑑定金魚草植株之間自交親和性的方法，該方法包括(1)選取兩個金魚草植株，提取基因組DNA；(2)按照本發明公開的金魚草S基因設計兩個PCR引物；(3)使用所設計的PCR引物對提取的金魚草基因組DNA進行PCR反應，並對該PCR產物進行測序；(4)如果該兩株金魚草之間的PCR產物的DNA序列相同，則該兩株金魚草植株之間是自交不親和的，如果該兩株金魚草之間的PCR產物的DNA序列不相同，則該兩株金魚草植株之間是自交親和的。在本發明的上述方法中，按照本發明的金魚草基因設計PCR引物以及使用所設計的引物進行PCR擴增可按照現有技術中已知的方法進行。本發明的再一個目的是提供一種用於鑑定金魚草植株之間自交親和性的PCR引物對。本發明的用於鑑定金魚草植株之間自交親和性的PCR引物對可以是本發明所公開的金魚草S基因的任何一個片段，只要上遊引物和下遊引物之間的距離在10到1970個鹼基之間；優選在50到1000個鹼基之間；最好在100到500個鹼基之間。該引物對中的每一個引物的長度可以是6個到50個鹼基，優選15到30個鹼基；最好為20個鹼基。本發明的又一個目的是提供一種改變金魚草自交不親和性的方法。本發明的改變金魚草自交不親和性的方法包括(1)將本發明的正義AhSLF-S2基因克隆到植物轉化載體中；(2)將所構建的植物轉化載體轉化可再生的金魚草組織並使本發明的基因在轉化的組織中表達；(3)將被轉化的組織培養成植株。通過該方法得到的金魚草植株具有S核酸酶系統的GSI植物中獲得該基因的特異性，使它們產生相應的花粉自交不親和性。本發明的另一種改變金魚草自交不親和性的方法包括(1)將反義AhSLF-S2基因克隆到植物轉化載體中；(2)將所構建的植物轉化載體轉化可再生的金魚草組織並使本發明的基因在轉化的組織中表達；(3)將被轉化的組織培養成植株。將反義AhSLF-S2轉入植物中可以使其或有高度同源性基因的功能喪失，變成自交親和的植物。這些構建為人產生自交不親和和自交親和特性提供了基礎，是一種利用它們在多種GSI植物乃至作物中產生雜種優勢的方法。附圖簡要說明圖1金魚草S2等位基因位點的物理結構及編碼和推測的基因。基因轉錄的方向由盒式箭頭表示。方盒表示外顯子或編碼區。預測的GENE9和GENE11分別編碼S2核酸酶和AhSLF-S2。Kb，kilobasepairs。圖2AhSLF-S2的cDNA序列(序列一)。核苷酸的位置由數字標出。圖3AhSLF-S2的胺基酸序列。胺基酸的位置由數字標出。黑線標出F-box結構域。圖4SLF基因家族的胺基酸序列比較。來自擬南芥和水稻的SLF成員分別有它們的資料庫登錄號表示。擬南芥Q64598，Q9SSK2，CAB79194，Q9SU30，AAF26066，Q9S9V1，Q9SI34，022742，AAF30317，Q9SFC7和Q9SDB2。水稻BAA95875。S2GENE11代表AhSLF-S2。不同序列中相同胺基酸由黑框標出，灰框標出保守的胺基酸。位於N端的保守F-box結構域用黑線標出。圖5AhSLF-S2的組織特異表達的Northern分析。利用AhSLF-S2特異探針對來自不同S基因型的不同組織的RNA進行雜交。左側的數字表示檢測到的轉錄本的大小。Kb，kilobases。圖6AhSLF-S2的組織特異和時空表達的RACE分析。A，來自S2S4基因型植株不同發育時期組織RNA的RACE產物的雜交結果。泳道1，2和3分別代表來自2mm長花葯期的花葯、花瓣和花託。泳道4，5和6分別代表來自花葯成熟期的花葯、花瓣和花託。B，來自S2S4基因型植株花葯成熟期的花葯(泳道1和2)和花柱(泳道3和4)RNA的RACE產物的雜交結果。C，來自S2S4(泳道1-4)和S1S5基因型植株(泳道5-8)不同發育時期花葯和花粉RNA的RACE雜交結果。泳道1和54mm花葯；泳道2和61-2cm花葯；泳道3和7，成熟花粉；泳道4和8葉片。D，RACE所用基因特異和Adaptor引物位置示意圖。G11aAATGGGCCCATGCAACGGGC。CDSIIIATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N(N＝A，G，C，orT；N-1＝A，G，orC)。箭頭表示基因轉錄的方向。雜交探針為全長cDNA。圖7金魚草S2基因型植株花粉基因型的DNA雜交分析。A，AhSLF-S2的DNA雜交結果。來自不同基因型的5μg基因組DNA分別經限制性內切酶HindIII或EcoRI酶解、凝膠電泳分離和轉膜後，以AhSLF-S2的cDNA為探針進行雜交。實心箭頭表示AhSLF-S2的雜交片段，空心箭頭表示與AhSLF-S2同源的非S位點DNA片段。數字表示雜交片段的大小。泳道1-5代表的基因型分別為S1S4、S4S5、S1S5、ScSc和S1S2。Kb，kilobasepairs。圖下標出了探針的位置。B，S2-核酸酶基因的DNA雜交結果。圖示與A相同。圖8利用PCR快速鑑定金魚草S2基因型植株的花粉基因型。A，利用基因特異引物鑑定花粉S2基因型的PCR分析結果。利用AhSLF-S2和S2-核酸酶基因特異的引物，以不同基因型的基因組DNA(50ng)為模板分別進行PCR反應(94℃1min，35X(60℃1min，72℃1min)，72℃10min)。AhSLF-S2特異引物G11e(ACAATCGACATGGCTAC)，G11f(GTTGTTGCATTCCCGTGAGGG)和G11j(ATTATTTGACATTTGGGTTATG)。S2-核酸酶基因特異引物G2338(ACAATCGACATGGCTAC)和G1280(GCTTGCCCCTTTCTCAAG)(Xueetal.，1996)。PCR產物經1％凝膠電泳分離後，EB染色顯示DNA片段。泳道1-8代表的基因型分別為S1S4、S4S5、S2S5、S1S5、S2S5、S4S5、S1S5和S2S4。箭頭標出S2基因型特異的PCR擴增產物。B，AhSLF-S2基因特異引物位置示意圖。實施例植物材料金魚草自交不親和的種間雜種的產生和不同S等位基因分離群體的獲得參見Xueetal.(1996)。用於本發明的材料為含有S2S4和S1S5的品系(Xueetal.，1996)。它們分別按常規的栽培條件種植於溫室。由於這些植物為自交不親和，因此不能通過種子繁殖。它們的保持通過扦插完成。實施例1金魚草BAC文庫的構建和篩選首先從來自S2S4植株的葉片分離植物細胞核(LiuandWhittier，1994)。然後利用HindIII將DNA部分酶解後，克隆到同樣酶切的BAC載體pBeloBAC11(Shizuyaetal.，1992)。連接產物通過電轉化的方法轉化大腸桿菌DH10B。通過插入失活Laz基因的方法篩選含有外源DNA的插入子。對近100個插入子大小的分析發現平均插入子的大小為70kbp。將35000個克隆保存於96孔平板後，利用BIOMEK2000(Beckman)的機器人將這些克隆以高密度點陣方式點到29張HYBOND膜上(每張膜上點1182個克隆)。每個克隆重複點3次。膜經處理後(Sambrooketal.，1989)，保存於4℃。為了獲得含有S位點的BAC克隆，利用S2核酸酶基因(Xueetal.，1996)為探針對金魚草BAC文庫進行了篩選(Sambrooketal.，1989)。其中一個陽性克隆經進一步的實驗證實含有全長的S2核酸酶，即S2BAC(圖一)。脈衝場電泳分析發現該克隆的插入子大小約為63kbp。為了確認S2BAC含有的序列為S位點序列，通過反向PCR(IPCR)和BAC末段測序的方法獲得了兩端約500bp的序列。通過設計片段對應的引物，在S等位基因的分離群體(Xueetal.，1996)中沒有發現兩端與S核酸酶基因有重組，表明S2BAC含有的序列全部來自S位點。實施例2S2BAC的DNA序列分析為了測定S2BAC中插入片段的全部序列，首先利用超聲波處理的方法將純化的S2BAC質粒DNA部分打斷後，分離1-2kb的組分，然後亞克隆到pBluescript載體(Strategene，USA)。第二，挑選2000個有插入片段的轉化子並製備質粒DNA(Sambrooketal.，1989)。第三，利用MEGABASE1000全自動DNA測序儀(MolecularDynamics，USA)測定每個質粒兩端的序列(每個測序反應平均獲得的序列為400bp)。第四，將獲得的序列通過電腦程式(STADENPACKAGE，http//www.sanger.ac.uk/)進行組裝後獲得S2BAC插入子的全長序列(每個核苷酸平均被測的次數為10次)。序列分析表明S2核酸酶基因位於該克隆約50kb的位置(參見圖一)。利用GENSCAN等(http//www.sanger.ac.uk/)分析發現該克隆編碼了11個預測的基因，其中包括S2核酸酶基因，說明有可能這些基因為表達基因(參見圖一)。但是，除S2核酸酶基因外，資料庫分析表明有其中三個基因(GENE4，6和8)可能編碼反轉座子，而其餘的基因都沒有在DNA資料庫中發現與已知基因同源。實施例3金魚草花葯cDNA文庫的構建收集並合併金魚草不同時期的花葯組織，提取RNA(Xueetal.，1996)。然後利用CLONTECH的SMARTTM試劑盒合成雙鏈cDNA，並將其克隆在λTripEx2載體(CLONTECH，USA)中。插入子檢測發現該cDNA文庫的插入子大小平均為1kb。進一步的實驗發現該文庫的滴度1×106。實施例4一個代表花粉自交不親和性基因AhSLF-S2cDNA克隆的分離和鑑定DNA序列分析表明S2BAC除了含有S2核酸酶基因外還含有其它的基因，這些基因可能為自交不親和基因。但是，如果為控制自交不親和性的基因，如花粉S基因，它必須表現出應有的序列多態性和配子體基因表達的模式。為了分離S位點中具有花粉S基因特徵的基因，對S2BAC中可能編碼多態性的區域進行了「掃描」。每2kb設計一對引物，對不同S等位基因型的植株進行PCR分析。結果發現了GENE2，5，10和11位於多態性區域，這些區域內的基因可能編碼花粉S基因。為了分離花粉中表達的基因，利用多態性區域來的探針對上述構建的花葯cDNA文庫進行了篩選。獲得了一個位於S2核酸酶基因下遊的GENE11的cDNA。該cDNA為1986個核苷酸(圖二)，Northern雜交分析(Sambrooketal.，1989)表明它代表了一個全長的基因(見實施例5，圖五)。金魚草RNA的分離方法按照Xueetal.(1996)進行。計算機分析表明它編碼一個376個胺基酸的蛋白質(圖三)。與DNA序列的比較發現該基因不含內含子。資料庫分析沒有發現它與已知的基因同源。但是，在已測序的擬南芥和水稻基因組中發現了多個與其同源的推測基因(圖四)。Pfam分析發現這類基因都含有一個保守的F-box結構域(圖四)。因此，它們代表一類新的F-box基因。由於該家族發現的第一個表達基因來自S位點，所以將它們命名為SLF(SLocusF-box)。將從金魚草S2位點分離的SLF稱為AhSLF-S2(AntirrhinumhispanicumSLF-S2)。結合AhSLF-S2的物理位置、表達模式和序列多態性方面(案例3和6)的證據，AhSLF-S2編碼了一個金魚草的花粉自交不親和性基因，即花粉S基因。實施例5AhSLF-S2的表達分析RNA印跡雜交發現AhSLF-S2隻在來自含有S2等位基因植株的花葯組織中表達，而在其它組織中不表達，其轉錄本的大小約為2kb(圖五)。利用等位基因特異的引物，通過RACE分析發現AhSLF-S2隻在減數分裂後的來自含有S2等位基因植株的花葯以及成熟花葯中表達(圖六)。這些結果說明AhSLF-S2為一個S2等位基因特異的配子體基因，進一步表明它編碼一個花粉S基因。實施例6金魚草S2基因型的鑑定利用AhSLF-S2引物和PCR的方法可以鑑定含S2花粉基因型的金魚草植株(圖七)。同時，也可以利用AhSLF-S2來的DNA探針完成類似的工作(圖八)。金魚草DNA的提取、酶切和印記分析按照Xueetal.(1996)完成。實施例7GSI植物花粉S基因的克隆玄參科植物金魚草和茄科以及薔薇科植物的S位點都編碼S核酸酶。根據這一相似性，它們的花粉S基因產物也應屬於同一類。因此，通過分離S位點編碼的SLF基因，可以獲得這些SI植物的花粉S基因。首先構建目標植物的基因組DNA文庫，並獲得覆蓋S位點的克隆，通過常規的分子生物學技術尋找具有SLF特徵的基因即可獲得目標植物的花粉S基因。參考文獻1.AiY，SinghA，ColemanCE，IoergerTR，Kheyr-PourA，andKaoT-h.(1990)Self-incompatibilityinPetuniainflataIsolationandcharacterizationofcDNAsencodingS-allele-associatedproteins.Sex.Plant.Reprod.，3130-1382.AndersonMA，CornishEC，MauS-L，WilliamsEG，HoggartR，AtkinsonA，BonigI，GregoB，SimpsonR，RochePJandClarkeAE.(1986)CloningofacDNAforastylarglycoproteinassociatedwithexpressionofself-incompatibilityinNicotianaalata.Nature32138-44.3.AndersonMA，McFaddenGI，BernatzkyR，AtkinsonA，OrpinT，DedmanH，TregearG，FernleyR，ClarkeAE.(1989)Sequencevariabilityofthreeallelesoftheself-incompatibilitygeneofNicotianaalata.PlantCell，1483-4914.BaiC，SenP，HofmanK，MaL，GoebelM，HarperW，ElledgeS.(1996)Skp1connectscellcycleregulatorstotheubiquitinproteolysismachinerythroughanovelmotif，theF-box.Cell，86263-2745.CornishEC，PettittJM，BonigI，ClarkeAE.(1987)Developmentallycontrolledexpressionofageneassiociatedwithself-incompatibilityinNicotianaalata.Nature，32699-1026.CraigKL，TyersM.(1999)TheF-boxanewmotifforubiquitindependentproteolysisincellcycleregulationandsignaltransduction.Prog.Biophy.Mol.Biol.，72299-3287.CuiY，BiYM，BrugiereN，ArnoldoM，RothsteinSJ.(2000)TheSlocusglycoproteinandtheSreceptorkinasearesufficientforself-pollenrejectioninBrassica.ProcNatlAcadSciUSA.973713-3717.8.deNettancourt，D.(1977)Incopatibilityinangiosperms.(BerlinSpringer-Verlag).9.DoddsPN，FergusonC，ClarkeA，andNewbiginE.(1999)Pollen-expressedS-RNasesarenotinvolvedinself-incompatibilityinLycopersiconperruvianum.Sex.Plant.Reprod.1276-8710.DoughtyJ，DixonS，HiscockSJ，WillisAC，ParkinIA，DickinsonHG.(1998)PCP-A1，adefensin-likeBrassicapollencoatproteinthatbindstheSlocusglycoprotein，istheproductofgametophyticgeneexpression.PlantCell.101333-1347.11.HuangS，LeeH-S.，KarunanandaaB，andKaoT-h.(1994)RibonucleaseactivityofPetuniainflataSproteinsisessentialforrejectionofselfpollen.PlantCell61021-102812.KaoT-h.，andMcCubblinA.(1997)Molecularandbiochemicalbasesofgametophyticself-incompatibilityinSolanaceae.Plant.Physiol.Biochem.，35171-17613.KawataY，SakiyamaFandTamaaokiH.(1988)Amino-acidsequenceofribonucleaseT2fromAspergillusoryae.Eur.J.Biochem.176683-69714.LeeH-S，HuangS，KaoT-h.(1994)S-proteinscontrolrejectionofincompatiblepolleninPetuniainflata.Nature，367560-563.15.LewisD.(1952)Serologicalreactionsofpollenincompatibilitysubstances.Proc.Roy.Soc.(L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物轉化載體轉化可再生的金魚草組織並使本發明的基因在轉化的組織中表達；(3)將被轉化的組織培養成植株。全文摘要本發明提供了一種金魚草S基因,該基因具有說明書所述的核苷酸序列。本發明還提供了使用該基因鑑定金魚草植株之間自交親和性的方法、用於鑑定金魚草植株之間自交親和性的PCR引物對、以及一種改變金魚草自交不親和性的方法。文檔編號C12N15/29GK1354254SQ0013246公開日2002年6月19日申請日期2000年11月21日優先權日2000年11月21日發明者薛勇彪,賴釗,張燕生申請人:中國科學院發育生物學研究所