2型糖尿病大鼠模型的製備方法

2023-05-08 11:22:31

專利名稱：：2型糖尿病大鼠模型的製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種動物模型的製備方法，具體涉及一種2型糖尿病大鼠模型的製備方法。本發明製備的2型糖尿病大鼠模型可以用於分析2型糖尿病病理及進行2型糖尿病藥物的篩選。
背景技術：
：糖尿病是一種古老而年輕的疾病，早在公元前，我國的《黃帝內經》就對其病因病症及治療原則做了詳細的論述。隨著社會的發展、物質的豐富，絕大多數人的能量攝入由長期的相對不足，在短期內快速轉變為相對過剩，而人類在長期能量供應不足的繁衍過程中所形成的以節約能量為主要使命的節約基因(thrifygenotype)卻難於在短期內發生變化，仍然起著固有的作用，致使糖尿病的發病率直線上升，向當今年醫學提出了產峻的挑戰。糖尿病與心血管疾病的流行趨勢相當，是現代疾病中的第二殺手，在各種疾病的死亡率中僅次於癌症。據國際糖尿病聯盟UDF)統計，目前全世界有患糖尿病危險的人超過3億，到2025年，糖尿病患病人數將從現在的1.94億升至3.33億，發展中國家的糖尿病人數將超過世界總糖尿病人數的75%。現在，2型糖尿病(T2DM)已經佔到糖尿病患者的90%以上。T2DM患者體內產生胰島素的能力並非完全喪失，有的患者體內胰島素甚至產生過多，但胰島素的作用效果卻大打折扣，因此患者體內的胰島素是一種相對缺乏。T2DM的病理特徵包括外周組織胰島素抵抗以及胰腺P細胞分泌胰島素的損傷，其表型包括高空腹血糖、高胰島素血症、糖耐量低減、肝糖原合成不足及糖異生途徑異常活躍等。一般認為，T2DM的發病除了遺傳因素外，也與環境因素的誘導密切相關。但是，目前對於T2DM的機理還有很多不明之處，有待進一步研究。而適當的T7DM動物模型則是用於分析T2DM病理及進行胰島素抗性研究，並進行T2DM藥物篩選和鑑定治療藥物體內功效的臨床前必需工具。以往多是通過手術和化學辦法減少動物胰島P細胞分泌胰島素來建立糖尿病動物模型，特點是胰島素分泌缺乏所致的高血糖和"三多一少症"(多飲、多食、多尿、消痩)，此類方式造成的高血糖動物更傾向於l型糖尿病UDDM)模型，而與T2DM的病理特徵和臨床特點相差甚遠。現有的2型糖尿病動物模型多為遺傳性自發性動物模型，發病率偏低，不能很好地模擬人體2型糖尿病的發病過程。目前製備T2DM大鼠模型的方法主要有3種1.應用小劑量(25mg/kg)鏈脲佐菌素(STZ)和高熱量飼料給予成年大鼠的造模方法；2.中劑量STZ(30mg/kg)連續注射加高熱量伺料給予成年大鼠的造模方法；3.給予出生後2天的新生雄鼠腹腔注射大劑量STZ(90mg/kg)的造模方法。但上述方法的造模時間普遍相對較長，而且一些方法製備的T2DM大鼠模型空腹血糖低，達不到臨床診斷糖尿病的標準。
發明內容本發明的目的是提供一種2型糖尿病大鼠模型的製備方法，該方法製備的大鼠模型具有高空腹血糖、高胰島素血症、糖耐量低減、胰島素抵抗等2型糖尿病的典型症狀，是較為理想的T2DM大鼠模型。本發明的2型糖尿病大鼠模型的製備方法是先用鏈脲佐菌素造成新生鼠胰島P細胞對糖反應性下降，對斷乳大鼠再次小劑量注射鏈脲佐菌素，造成胰島輕度損傷，同時給予高糖高脂飲食誘導，使產生胰島素抵抗，得到2型糖尿病大鼠模型。本發明的2型糖尿病大鼠模型的具體製備方法包括以下步驟l.按照90mg/kg體重劑量向2d齡大鼠腹腔注射200mg/mL鏈脲佐菌素(STZ)溶液，哺乳餵養至斷乳；2.按照25mg/kg體重劑量向斷乳大鼠腹腔注射5mg/mL鏈脲佐菌素溶液；3.給予高糖高脂飲食詞養，4-8周得到T2DM大鼠模型。本發明的2型糖尿病大鼠模型製備方法中，高糖高脂飲食飼料是由基礎鼠詞料加蔗糖、豬油和蛋黃組成的，其重量百分比例為豬油18%，蔗糖20%，蛋黃3%,基礎鼠飼料59%。製成的高糖高脂飲食飼料總熱量21.37kJ/g，蛋白質含量15%,碳水化合物含量51%，脂肪含量25%。其中，基礎鼠飼料是由20%小麥粉、41%玉米粉、15%麩皮、20%豆粉、2%骨粉和2%魚粉配製而成的，總熱量為13.85kJ/g,蛋白質含量23%,碳水化合物含量50%，脂肪含量5%。胰島素抵抗是T2DM發病機理的基本環節和顯著特徵之一，表現為胰島素敏感性降低和胰島素反應性降低。資料報導，小劑量STZ可引起大鼠糖耐量異常，若餵養正常飼料，則大鼠體重增長比正常大鼠慢；單純餵養高熱量詞料，大鼠體重及脂肪組織雖有明顯增加，但糖耐量正常；若大劑量STZ注射，大鼠易產生高血糖，再加高熱量飼料餵養，則易死亡。很多實驗已經證實，STZ注射和高熱量飼料餵養是形成T2DM模型的重要條件。新生鼠P細胞破壞後，胰島重建的來源為導管上皮、腺泡細胞和P細胞增生，其中出生3天增生力最強，7天後增生力恢復至平均水平。應用STZ會導致大鼠成年後P細胞數量相對減少，尤其是對糖反應性下降，從而使得葡萄糖刺激後胰島素分泌不足。本發明吸取目前的T2DM造模經驗，在用STZ造成新生鼠胰島P細胞對糖反應性下降的基礎上，給予高糖高脂飲食誘導胰島素抵抗，同時再次小劑量注射STZ—次,造成胰島輕度損傷，從而出現空腹血糖升高及脂質代謝紊亂等一系列糖尿病的表現，成功製備出了T2DM大鼠模型，並且縮短了造模時間，提高了模型的空腹血糖水平。釆用本發明的造模方法，模型成功率高(96.2%,76/79)，成模時間48周左右，比現在至少需要io周的成模時間相對縮短。應用生物化學指標以及形態學方法對造模大鼠進行測定，進一步驗證了模型的真實性及可靠性。驗證結果顯示，T2DM大鼠模型空腹血糖增高，糖耐量下降，糖化血紅蛋白增高，空腹胰島素正常，胰島素敏感性降低。血膽固醇和甘油三酯增高。光鏡下T2DM大鼠胰島面積與正常大鼠比較無差別，P細胞胞漿顆粒少，染色淡，晚期可出現T2DM特有的胰島澱粉樣變，並且電鏡下P細胞胞漿內顆粒緻密程度也出現降低。這些都與臨床的T2DM生化改變以及形態學改變表現一致。可見該模型能夠很好地用於T2DM的研究。圖1為兩組大鼠不同時間段體重變化情況，圖中，--為正常對照組，-■-為T2DM組；圖2為光鏡下觀察12周正常大鼠胰島(放大倍數10x10);圖3為光鏡下觀察12周T2DM組大鼠胰島(放大倍數10x10);圖4為光鏡下觀察24周正常大鼠胰島(放大倍數10x10);圖5為光鏡下觀察24周T2DM組大鼠胰島(放大倍數10x10);圖6為電鏡下觀察正常大鼠胰島P細胞(放大10000倍)；圖7為電鏡下觀察T2DM組大鼠胰島P細胞(放大10000倍)。具體實施例方式一、實驗材料l.主要藥品及試劑盒鏈脲佐菌素(Str印tozotocin,STZ)，美國Sigma公司；枸櫞酸鹽，博士德公司；血清甘油三酯(TG)測試藥盒、血清膽固醇(Tch)測試藥盒，上海榮盛生物技術有限公司；血漿胰島素試劑盒(放射免疫法)，法國CIS公司；糖化血紅蛋白(微柱法)測定試劑盒，寧波市慈城生化試劑廠；Masson染色相關試劑，山西醫科大學病理科；血糖試紙，美國強生公司；尿糖試紙，桂林中輝生物技術有限公司。2.主要儀器強生surest印plus血糖儀，美國強生公司；UV755B紫外可見分光光度儀，上海分析儀器總廠；LD4-2A臺式離心機，北京醫用離心機廠；TLL-C臺式高速冷凍離心機，北京四環科學儀器廠；KJ-B快速漩渦混勻器，江蘇省姜堰巿健康醫療器具有限公司；DK-600電熱恆溫水槽，上海益恆實驗儀器有限公司；JEM-100CX型透射電子顯微鏡，日本電子株式會社。3.造模動物封閉群清潔級Wistar新生2d齡雄性大鼠，由山西醫科大學實驗動物中心提供。二、模型製備方法1.動物模型的製備擲幣法將2d齡大鼠分為正常對照組和T2DM組，正常對照組68隻，T2DM組79隻。將STZ用pH4.4,0.lmol/L的枸櫞酸緩衝液配成200mg/mL溶液，T2DM組大鼠按照STZ90mg/kg體重進行腹腔注射，正常對照組未作處理。出生4周後大鼠斷乳，將STZ用PH4.4，0.lmol/L枸櫞酸緩衝液配成5mg/mL溶液，T2DM組大鼠按照25mg/kg體重劑量腹腔注射STZ,同時給予高糖高脂飲食飼養。正常對照組給予基礎鼠飼料，並且腹腔注射等體積的枸櫞酸緩衝液。STZ均要求現用現配。2.飼料的配製基礎鼠飼料的配製:小麥粉20%,玉米粉41%,麩皮15%,豆粉20%,骨粉2%，魚粉2%。配好後用飼料成型機壓成顆粒狀。基礎鼠飼料總熱量13.85kJ/g，蛋白質含量23%、碳水化合物含量50%、脂肪含量5%。高糖高脂飲食飼料的配製由基礎鼠飼料加蔗糖、豬油和蛋黃製成，比例為豬油18%,蔗糖20%，蛋黃3%,基礎鼠飼料59%。將上述配料充分混勻後，用攪肉機成形，烤熟後，壓製成形。高糖高脂飲食飼料的總熱量為21.37kJ/g,蛋白質含量15%、碳水化合物含量51%、脂肪含量25%。3.測定指標及方法3.1—般狀況兩組大鼠分別在出生2天(2d)、斷乳時(出生28天，記為O周)、高糖高脂飲食第4周、8周、10周、12周、16周、20周、24周測定其體重，觀測飲水量，攝食量和尿量，並用尿糖試紙檢測尿糖情況。3.2空腹血糖、糖耐量測定在大鼠斷乳後4周測定所有正常對照組以及T2DM組大鼠空腹血糖值，隨機選取12隻正常對照組大鼠和35隻T2DM組大鼠測定糖耐量。剪尾採血，血糖釆用強生血糖儀，直接將全血滴在配套的血糖試紙上測得。設定空腹血糖大於對照正常大鼠空腹血糖均值+3個標準差為空腹血糖符合造模標準。，3.3糖化血紅蛋白測定剪尾取血，EDTA抗凝。利用陽離子交換樹脂(Biorex70)層析微柱洗脫糖化血紅蛋白，測定洗脫液中糖化血紅蛋白和溶血物中總血紅蛋白的吸光度，計算出糖化血紅蛋白佔總血紅蛋白的苜分比。測定步驟①溶血物製備取20pLEDTA抗凝血加到300pL溶血劑中，搖勻，置於37X:水洛15min,除去不穩定的糖化血紅蛋白。②微柱準備震蕩微柱使樹脂混懸，打開上蓋，將微柱上端圓片輕壓到載體面，微柱插入15mmxl00mL試管，摘掉下蓋，讓柱內緩衝液體完全流出。③層析用100pL微量移液器吸取溶血物加到微柱內樹脂床上，待溶血物完全進入樹脂床後，將微柱移到另一個15mmxlOOmL試管上，小心滴加3mL洗脫液，收集洗脫液作為糖化血紅蛋白(GHb)管。另取100pL溶血物加到另一個15mmx150mL試管中，用15mL蒸餾水稀釋，作為總的血紅蛋白(Hb)管。④測定以蒸餾水為空白，在420nm波長下，分別測定GHb管和總Hb管的吸光度值A。⑤計算GHb%=AGHb+(AHbx5)x1003.4空腹血清胰島素及胰島素敏感性指數計算在高糖高脂飲食第4周和第16周時，隨機選取正常對照和T2DM組大鼠各10隻，第12周時隨機選取正常對照和T2DM組大鼠各25隻，剪尾取血測定空腹血糖和空腹胰島素，空腹血糖為血糖儀試紙直接測出。空腹胰島素為釆血後提取血清，由雙抗體放射免疫分析法測定。胰島素敏感性指數的計算取空腹血糖與胰島素乘積倒數的自然對數為胰島素敏感性指數，設定4周組正常大鼠的胰島素敏感指數為1，計算相對胰島素敏感性。3.5血膽固醇、血甘油三酯的測定在高糖高脂飲食第12周時，隨機選取正常對照組和T2DM組大鼠各25隻，內眥取血，測定血清總膽固醇含量和甘油三酯含量。3.6胰腺形態學觀察在高糖高脂飲食第12周和第24周隨機選取兩組大鼠各6隻，製備胰腺光鏡標本及電鏡標本，觀察胰島以及其中P細胞的形態變化。3.6.l胰腺光鏡標本的製備①斷頭處死動物，迅速取出胰腺，盤帶狀巻曲，Bouin液固定。②Masson三色染色胰腺組織固定後，依照固定程序脫水，石蠟包塊。切片後，常規脫蠟至水化。Masson複合染色液染色5min，0.2%醋酸水溶液稍作衝洗，5%磷鎢酸染色5~10min,0.2°/。醋酸水溶液浸洗2次，2%苯胺藍液染色5min,0.2%醋酸水洗2次。無水酒精脫水。二甲苯透明，中性樹膠封固。3.6.2胰腺電鏡標本製備①斷頭處死動物，迅速取出胰腺，切成lmW小塊，加預冷的2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合固定液2mL，於4。C固定2h;②用磷酸緩衝液衝洗；③ly。鋨酸固定1.5h，逐級脫水；70%酒精飽和醋酸鈾塊染8~10h;⑤環氧樹脂618包埋，於6(TC下聚合48h;⑥用瑞典LKB型超薄切片機製成半薄切片，觀察到胰島後，再切成50nm厚的切片置於銅製載網上乾燥保存。三、統計分析方法採用SAS6.12統計軟體進行雙因素及單因素方差分析，結果用X士S表示，oc-O.05。四、製備的2型糖尿病大鼠模型驗證1.各組大鼠一般狀況正常對照組大鼠生長良好，體重持續增加。T2DM組大鼠在高糖高脂飲食飼養前10周平均體重與正常對照組大鼠相似，12周後T2DM組大鼠體重增長減慢，平均體重明顯低於對照組，20、24周體重不再增高，甚至較前下降(圖l)。觀察還發現T2DM組大鼠攝食量、飲水量和尿量增多，尿羶味加重，因資料收集難以十分準確，未作統計。2.空腹血糖以及糖耐量測定結果斷乳第4周測得正常對照組空腹血糖為3.76±0.97mmol/L,故本實驗成模大鼠的空腹血糖確定為6.67mmol/L。造模大鼠中，有96.2%(76/79)達到要求。並且糖耐量測定表明正常對照組大鼠餐後血糖增高不明顯，而T2DM組大鼠餐後30min、60min血糖水平明顯增高，120min時血糖下降，但仍顯著高於正常對照組(見表l)。在第4周和第16周的空腹血糖比較時發現，隨著大鼠增齡，兩組動物的空腹血糖均出現增高趨勢(表2)。3.糖化血紅蛋白測定結果糖化血紅蛋白測定結果顯示，正常大鼠的糖化血紅蛋白值為1.64±0.08%，T^DM組中全部大鼠的糖化血紅蛋白值(3.41士0.75%)超過了正常大鼠的平均值。表1高脂髙糖膳食飼養第4周兩組大鼠糖耐量試驗及糖化血紅蛋白測定指標(X土s)tableseeoriginaldocumentpage114.空腹胰島素和胰島素敏感性測定結果分別在第4、第12、第16周測定了空腹胰島素和胰島素敏感性，結果顯示T2DM組大鼠空腹胰島素與正常對照組比較差異無顯著性，而胰島素敏感性降低(見表2，表3)，並且隨著大鼠增齡，胰島素敏感性減低。5.血膽固醇、甘油三酯測定結果'T2DM組大鼠在高糖高脂飲食12周後，血清總膽固醇和甘油三脂測定值顯著高於正常對照組。_表2兩組大鼠空腹血糖、空腹血清胰島素及胰島素敏感指數比較(X±S)_空腹血糖，咖ol/L空腹血清胰島素nU/L胰島素敏感性指數分組n-_fJ5_!1jI_U_!^j_1j_16周1.60±0.121.70±0.10對照組103.47±0.314.65±0.5511.78±2.7711.11±2.22,、，(1.0)(0.96)2,09±0.412,39±0.20T2DM組109.43±5.4315.08±5.6616.48±15.415.70±4.55,、(0.78)(0.70),45.2283.19858.886表3第12周兩組大鼠血清甘油三酯、膽固醇、胰島素及胰島素敏感指數比較(文土S)分組n甘油三酯，咖ol/L膽固醇，mmol/L血清胰島素pU/L胰島素敏感性指數對照組250.87±0.311.711.2411.04±2.371-62±0響13(1.0)T2DM組251.20±0.552.911.7314.75±10.212.09±0.43(0.8)屍6.719.043.1458.8866.光鏡下胰島形態學變化Masson染色後，胰島內ot細胞染成深紅色，|3細胞染成淺紅色，PP細胞為藍色。光鏡下觀察發現兩組大鼠在第12周和第24周時比較，從單個視野的胰島數目，以及單個胰島的面積看，兩者均無顯著性差異。24周時T2DM組大鼠與正常對照組比較發現，其單個胰島內13細胞比例減少，胞漿染色淡，有澱粉樣改變。(見圖2、3、4、5)。7.電鏡下P細胞形態學變化透射電鏡觀察發現，正常胰島內P細胞佔總數的60-80%，多位於胰島中部，P細胞胞漿內可見大量緻密的分泌顆粒(圖6)。T2DM組大鼠胰島內p細胞比例減少，細胞胞漿內分泌顆粒減少，密度減低(圖7)。權利要求1、一種2型糖尿病大鼠模型的製備方法，是先用鏈脲佐菌素造成新生鼠胰島β細胞對糖反應性下降，對斷乳大鼠再次小劑量注射鏈脲佐菌素，造成胰島輕度損傷，同時給予高糖高脂飲食誘導，使產生胰島素抵抗，得到2型糖尿病大鼠模型。2、根據權利要求1所述的2型糖尿病大鼠模型的製備方法，其特徵是包括以下步驟a).按照90mg/kg體重劑量向2d齡大鼠腹腔注射200mg/mL鏈脲佐菌素溶液，哺乳餵養至斷乳；b).按照25mg/kg體重劑量向斷乳大鼠腹腔注射5mg/mL鏈脲佐菌素溶液；c).給予高糖高脂飲食飼養，48周得到T2DM大鼠模型。3、根據權利要求1或2所述的2型糖尿病大鼠模型的製備方法，其特徵是所述的高糖高脂飲食飼料的重量百分比組成為豬油18%蔗糖20%蛋黃3%基礎鼠飼料59%。4、根據權利要求3所述的2型糖尿病大鼠模型的製備方法，其特徵是所述的基礎鼠飼料的重量百分比組成為小麥粉20%玉米粉41%麩皮15%豆粉20%骨粉2%魚粉2%。全文摘要一種2型糖尿病大鼠模型的製備方法，是先用鏈脲佐菌素造成新生鼠胰島β細胞對糖反應性下降，對斷乳大鼠再次小劑量注射鏈脲佐菌素，造成胰島輕度損傷，同時給予高糖高脂飲食誘導，使產生胰島素抵抗，得到2型糖尿病大鼠模型。採用本發明方法製備的大鼠模型具有高空腹血糖、高胰島素血症、糖耐量低減、胰島素抵抗等2型糖尿病的典型症狀，是理想的T2DM大鼠模型，並且縮短了造模時間，模型成功率高。文檔編號A23K1/18GK101095958SQ20071006226公開日2008年1月2日申請日期2007年7月4日優先權日2007年7月4日發明者雙衛兵,利張,王東文,高宏飛申請人:山西醫科大學第一醫院