必特螺旋黴素的基因工程菌株螺旋黴素鏈黴菌wsj－195的製作方法
2023-05-08 12:02:31 2
專利名稱：必特螺旋黴素的基因工程菌株螺旋黴素鏈黴菌wsj－195的製作方法
技術領域：
本發明涉及產生抗生素的基因工程菌菌株。
背景技術：
必特螺旋黴素(原名生技黴素)為利用基因重組技術將碳黴素產生菌4」異戊醯基轉移酶基因p66B轉入螺旋黴素鏈黴菌獲得的克隆菌株(Streptomycesspiramyceticus p66B-F21)的發酵產物，必特螺旋黴素是以異戊醯螺旋黴素III、異戊醯螺旋黴素II、異戊醯螺旋黴素I三個組分為主的混合物，含有一定量的(異)丁醯、丙醯、乙醯螺旋黴素III及(異)丁醯、丙醯、乙醯螺旋黴素II，其化學結構及組分如下 異戊醯螺旋黴素III R＝COCH2CH3R』＝COCH2CH(CH3)2異戊醯螺旋黴素II R＝COCH3R』＝COCH2CH(CH3)2異戊醯螺旋黴素I R＝H R』＝COCH2CH(CH3)2異丁醯螺旋黴素III， R＝COCH2CH3R』＝COCH(CH3)2異丁醯螺旋黴素II R＝COCH3R』＝COCH(CH3)2丁醯螺旋黴素III R＝COCH2CH3R』＝COCH2CH2CH3丁醯螺旋黴素IIR＝COCH3R』＝COCH2CH2CH3丙醯螺旋黴素III R＝COCH2CH3R』＝COCH2CH3丙醯螺旋黴素IIR＝COCH3R』＝COCH2CH3
乙醯螺旋黴素IIIR＝COCH2CH3R』＝COCH3乙醯螺旋黴素II R＝COCH3R』＝COCH3其中異戊醯螺旋黴素III應不低於30％；異戊醯螺旋黴素(I+II+III)應不低於65％。
臨床前藥理毒理研究表明，必特螺旋黴素對革蘭氏陽性菌，尤其是對耐紅黴素、耐β內醯胺酶的金葡菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌有較好的抗菌活性，對部分陰性菌如卡他球菌、淋球菌、流感桿菌和部分軍團菌及厭氧菌有效，尤其對肺炎支原體的活性顯著；藥代動力學試驗表明，必特螺旋黴素口服有較好的生物利用度，組織滲透性好，組織分布廣、維持時間長；急、慢性及生殖毒性和致突變等研究顯示，在新一代大環內酯類抗生素中必特螺旋黴素的毒性最低。以上特點說明必特螺旋黴素有較好的臨床應用前景。必特螺旋黴素於2001年7月已獲國家藥品監督管理局進行臨床試驗的批文(批准文號為2001XL0292)。
利用基因工程技術製造生技黴素(必特螺旋黴素)的方法已於2000年獲中國發明專利(ZL97104440.6)。該克隆菌株所含有的4」異戊醯基轉移酶基因p66B是以質粒狀態存在，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No.0304。質粒型p66B-F21菌種的發酵單位平均為每毫升450微克，為了在螺旋黴素產生菌維持外源4」異戊醯基轉移酶基因的穩定性，在菌種傳代斜面中必須加入硫鏈絲菌素以保持質粒的存在，這些缺點影響了基因工程必特螺旋黴素的實際應用。為了獲得產生必特螺旋黴素的基因穩定型菌株，本發明人利用基因整合技術，通過基因同源重組將4」異戊醯基轉移酶基因整合在螺旋黴素鏈黴菌染色體上，獲得了基因整合型菌株螺旋黴素鏈黴菌WSJ1，WSJ1菌株在不加壓情況下連續傳代，發酵效價及所產生的必特螺旋黴素組分穩定，而且發酵效價比質粒型菌株提高1倍以上(生物工程學報15卷2期171-176，1999)，但是這樣的發酵水平仍不符合生產的需求。
本發明的目的是提供穩定的必特螺旋黴素高產菌株，以滿足製藥工業規模化生產的要求。
發明內容
在維持4」異戊醯基轉移酶基因整合狀態下，通過紫外、微波、甲基磺酸乙酯等化學誘變劑處理、並應用自然分離手段提高WSJ-1發酵產生必特螺旋黴素的能力，獲得高產菌株WSJ-195及其突變體，該菌株或其突變體連續多次在黃豆餅粉—澱粉—瓊脂孢子斜面培養基傳代，經種子培養和在澱粉—魚粉—玉米漿發酵培養基進行發酵實驗驗證；以藤黃微球菌為檢定菌，用微生物法測定發酵液效價；發酵液在微礆性條件下用乙酸乙酯等溶媒提取，提取物經薄層色譜分析或高壓液相色譜進行分析；以遺傳標記的方法對4」異戊醯基轉移酶基因在染色體的整合狀態進行考察。結果顯示，WSJ—195及其突變體的發酵水平穩定(平均發酵效價為3020微克/毫升)，所產生必特螺旋黴素組分符合質量標準的要求，可進入試生產工藝的研究。本發明獲得的高產菌株WSJ-195已於2002年9月27日送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCNo.0801。本發明將提供高產菌株發酵條件；提供多次傳代菌株發酵單位穩定、所產生的必特螺旋黴素組分穩定的試驗證明，並對該菌株的形態及生理生化特徵進行描述。
發明效果本發明提供了必特螺旋黴素基因工程高產菌株，其發酵水平較原始質粒型菌株提高了6倍多，比整合型原株提高了3倍多，該菌株發酵效價及所產生的必特螺旋黴素組分穩定，可應用於製藥工業規模化生產。
表一 WSJ-195菌株發酵效價
實施例3WSJ-195菌株的發酵產物必特螺旋黴素組分的驗證取實施例2中得到的發酵液，用氫氧化鈉(1％)調節pH至8.0-9.0，加入1/2體積的乙酸乙酯混合、靜止，分離乙酸乙酯層，在用0.1％氫氧化鈉處理過的鹼性矽膠薄層板上點樣後，在苯∶甲醇2∶1中展開，用碘蒸汽顯跡，以螺旋黴素為對照，Rf值高於螺旋黴素的顯跡點，即為必特螺旋黴素(圖2)。利用ShimadzuLC-6A高壓液相色譜儀及Shimadzu Shim-pack CLC-ODS Φ6.0×150mm分析柱，進行WSJ-195的發酵產物必特螺旋黴素組分的反相高效液相分析，流動相為CH3OH∶1％NaH2PO4(53∶47)，檢測波長231nm，流速1ml/min，必特螺旋黴素的組分分析結果見高壓液相色譜(圖3)。
表二 螺旋黴素鏈黴菌WSJ-195生理生化特徵
WSJ-195顯示能降解黃嘌呤、水解澱粉、在0.1％酚中生長，並能還原硝酸鹽，在3-7％的氯化鈉中生長良好。WSJ-195能利用多種碳源，僅在棉籽糖、木糖和D-Saccharic acid上不生長。WSJ-195菌種生理生化特徵見表二。
本發明WSJ-195菌株與螺旋黴素鏈黴菌原株(微生物學報22(1)13-16，1982)及文獻報導的螺旋黴素產生菌-生二素鏈黴菌(Pinnert-Sindico，SAnn.Inst.Pasteur.，87703-709，1954)形態學及生理生化差異見表三、四。
表三 WSJ-195和螺旋黴素鏈黴菌原株及生二素鏈黴菌形態學差異
表四 WSJ-195和螺旋黴素鏈黴菌原株及生二素鏈黴菌生理生化學差異
權利要求
1.一株基因工程螺旋黴素鏈黴菌(Streptomyces spiramyceticus)WSJ-195CGMCC No.0801及其變異體。
2.如權利要求1所述的基因工程螺旋黴素鏈黴菌WSJ-195及其變異體，其特徵在於經孢子斜面、種子及發酵培養產生以異戊醯螺旋黴素III、異戊醯螺旋黴素II、異戊醯螺旋黴素I三個組分為主的醯化螺旋黴素混合物-必特螺旋黴素。
全文摘要
本發明涉及抗生素基因工程菌株螺旋黴素鏈黴菌WSJ－195，它是在維持4」－異戊醯基轉移酶基因整合狀態下通過誘變、自然分離等手段提高整合型原始菌株WSJ－1發酵產生必特螺旋黴素的能力，獲得高產菌株WSJ－195，其平均發酵效價3020微克/豪升，比質粒型p66B－F21菌株發酵效價高6倍多，比整合型原始菌株WSJ－1的發酵效價高3倍多，不僅發酵單位穩定，所產生的必特螺旋黴素的化學組分也穩定，從而為工業化生產奠定了基礎。
文檔編號C12P19/62GK1405299SQ0214877
公開日2003年3月26日 申請日期2002年11月19日 優先權日2002年11月19日
發明者王以光, 戴劍漉, 尚廣東 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所, 北京京泰投資管理中心, 北京首科集團公司, 北京寶億通商貿有限責任公司