快速檢測致病大腸桿菌的TiO₂納米帶生物傳感器晶片及系統的製作方法

2023-05-08 11:53:26

專利名稱：快速檢測致病大腸桿菌的TiO2納米帶生物傳感器晶片及系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及食品中細菌的檢測技術領域。
背景技術：
食品安全問題一直是制約我國食品行業發展的瓶頸。據衛生部調查結果顯示，微生物汙染食品問題已成為目前影響我國食品衛生和安全的最主要因素，細菌性食物中毒造成的中毒人數最多，近兩年佔到總中毒人數的一半左右。
傳統的細菌檢測手段如細胞培養、螢光測試等不僅檢測周期長而且耗費大量的人力物力，難以滿足目前國內外對食品安全檢測的要求。目前，酶聯免疫吸附測定技術 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)以及聚合酶鏈反應法(Polymerase Chain Reaction, PCR)等常用的檢測手段與傳統方法相比，雖然能夠有效的縮短分析時間，但是其檢測時間仍長達五到六個小時，而且不能實現對細菌的實時檢測。近年來，抗體或免疫傳感器已經成為人們研究的熱點，通過抗原抗體的相互作用，微生物可以被直接或間接的快速檢測出來。實踐證明，利用此原理製備的生物傳感器具有低成本、高靈敏度、高穩定性和時時在線探測特種細菌的特點。特別是近年來，隨著納米技術的進步和微加工技術的不斷成熟，納米生物傳感器也不斷地被開發出來，並表現出良好的穩定性、靈敏度和壽命。
TiO2是一種寬帶隙半導體氧化物，其在傳感、光催化、燃料敏化太陽能電池以及電化學鋰存儲等方面有著重要的潛在應用價值。此外，其還具有良好的生物相容性、化學穩定性和可忽略的蛋白質變性作用，這些特殊的性能都使其成為理想的生物傳感材料。發明內容
針對傳統食品細菌檢測方法的諸多問題，本發明目的第一目的是提供一種快速檢測五種重要的食品致病菌的TiO2納米帶生物傳感器晶片。
本發明包括兩個平行的金電極和TiO2納米帶，所述TiO2納米帶連接在兩個平行的金電極之間，所述TiO2納米帶為多層狀納米結構,所述TiO2納米帶的表面鍵合有若干輕基。
本發明還提出快速檢測食品致病菌的系統本發明快速檢測食品致病菌的系統包括生物傳感器、阻抗檢測電路、多級蠕動泵和交變磁場，所述生物傳感器包括進樣容器、出樣容器和TiO2納米帶生物傳感器晶片，進樣容器和出樣容器通過微流通道連通，TiO2納米帶生物傳感器晶片中的TiO2納米帶置於所述微流通道內，TiO2納米帶生物傳感器晶片中的兩個平行的金電極分置於微流通道的兩側；所述 TiO2納米帶生物傳感器晶片中的TiO2納米帶置於所述交變磁場內；在所述進樣容器上分別連接細菌進樣管和清洗液進樣管，所述多通道蠕動泵分別設置在所述細菌進樣管和清洗液進樣管上；所述阻抗檢測電路分別與兩個金電極、多蠕動泵蠕動泵電連接。
本發明採用多層狀TiO2納米帶做傳感材料，其具有較大的面積，且表面鍵合大量的羥基，羥基可以很容易的與抗體相互作用，使得抗體被固定在納米帶表面，從而抗體可以快速捕獲細菌，使用該納米帶生物傳感器晶片檢測細菌的時間由傳統的五、六個小時縮短為50分鐘；同時，TiO2納米帶面積可控，表面羥基的數目可控導致抗體固定數目的可控，從而在細菌數目較低到10 102cfu/ml時，細菌仍能被很好的檢測到。蠕動泵可以實現高精度的給傳感器進樣，檢測過程所需的細菌用量很少，利於節約成本。採用阻抗測量晶片測定阻抗，操作簡單，測試速度快，便於使用。同時，與現有技術相比，利用本檢測系統不需要對含有細菌的樣本做複雜的預處理，從而縮短了細菌的檢測時間，易於滿足對細菌快速檢測的需求。
本發明適合用於快速檢測E. coli、non-0157 STEC、Salmonella、Listeria monocytogenes、和Campylobacter五種重要的食品致病菌。
進一步地，本發明所述阻抗檢測電路包括相互連接的單片機和阻抗檢測晶片。利用阻抗檢測晶片來測定TiO2納米帶生物傳感器晶片在抗體修飾前後及細菌捕獲後I Hz I MHz範圍內的阻抗譜。


圖I是本發明具有多層狀結構的TiO2納米帶示意圖；圖2是本發明含有TiO2納米帶生物傳感器晶片的快速檢測食品致病菌的系統的結構示意圖；圖3是本發明一種阻抗檢測電路的單片機與串行通信模塊的電路圖；圖4是本發明一種阻抗檢測電路的蠕動泵驅動及外圍接口模塊的電路圖；圖5是本發明一種阻抗檢測電路的阻抗檢測模塊的電路圖；圖6是本發明一種阻抗檢測電路的電源模塊的電路圖；圖7是本發明利用含TiO2納米帶生物傳感器晶片的系統檢測食品致病菌時，抗體固定前後及細菌捕獲後TiO2納米帶生物傳感器晶片的阻抗值與頻率的關係曲線。
具體實施方式
一、本發明多層狀結構TiO2納米帶採用溶液法製備，以下舉例說明將0. 2 g TiO2粉末在不斷攪拌下加入到2. O mol/L的Ca(OH)2和10 mol/L的NaOH混合液中，將此混合液轉移到聚四氟乙烯反應釜中密封，在100 250°C下，於4小時至7天後得到產物，即具有多層狀結構的TiO2納米帶。所得產物用去離子水衝洗至中性備用。
本發明所製得多層狀納米結構的TiO2納米帶的結構示意圖見圖I。多層狀1102納米帶的表面鍵合有一定數目的羥基。該多層狀納米帶具有價帶可調、表面羥基數量可控的優點。通過調控反應時間的長短可以控制TiO2納米帶的面積，從而調節TiO2納米帶表面羥基的數目。羥基數目多，則固定抗體數量相應增加，可以提高TiO2納米帶的敏感性，使得在細菌數目低到10 102cfu/ml時，仍能被很好的檢測到。
二、多層狀結構的TiO2納米帶生物傳感器晶片的製備過程如下將TiO2納米帶置於氧化矽基片上，然後採用光刻法製備兩個平行的金電極與TiO2納米帶相連，使得在兩個平行的金電極之間連接有TiO2納米帶。
使用本發明多層狀TiO2納米帶生物傳感器晶片時，將該生物傳感器晶片的表面進行抗體修飾，具體過程如下將TiO2納米帶生物傳感器晶片置於2-甲基-2-丙硫醇中對金電極表面進行修飾，然後分別用99. 5%乙醇和二次去離子水清洗。將致病性細菌抗體直接滴在TiO2納米帶生物晶片的表面上，在室溫下孵育2小時，然後用去離子水衝洗，並在氮氣氣氛下乾燥。這樣表面修飾有抗體的TiO2納米帶生物傳感器晶片就製成了。
三、本發明包含有多層狀的TiO2納米帶生物傳感器晶片的快速檢測食品致病菌的系統主要有三部分構成生物傳感器、自動進樣清洗裝置和阻抗檢測電路。
圖2是本發明快速檢測食品致病菌的系統的結構示意圖。該系統中的生物傳感器包括微流通道3、進樣容器4、出樣容器5和TiO2納米帶生物傳感器晶片，進樣容器4和出樣容器5通過微流通道3連通。
TiO2納米帶生物傳感器晶片中的TiO2納米帶6置於微流通道3內，TiO2納米帶生物傳感器晶片中的相互平行的金電極7和金電極8分置於微流通道3的兩側。TiO2納米帶生物傳感器晶片的金電極7和金電極8通過導線與圖4的阻抗檢測電路的外圍接口模塊中的接線端子P3的VIN接線柱和VOUT接線柱連接。使用時，在微流通道3的兩側施加交變磁場9,使TiO2納米帶生物傳感器晶片微流通道中的TiO2納米帶處於交變磁場內，這就會使免疫磁分離的細菌在微流通道3內流動時更易被TiO2納米帶上的抗體捕獲。
在本發明快速檢測食品致病菌的系統的自動進樣清洗裝置中，多級蠕動泵可以分別控制通道12和13，通過細菌進樣管10與進樣容器4連通，蠕動泵通過清洗液進樣管11 與進樣容器4連通。蠕動泵通過細菌進樣管10自動給生物傳感器定量注入致病大腸桿菌的培養液。通道於12和13的步進電機轉速範圍為O. I 50 rpm,流量最低可達I μ L/ min,以此來保證系統高精度控制細菌培養液的進樣量。通過清洗液進樣管11注入清洗液 (如蒸懼水)來清洗TiO2納米帶生物傳感器晶片。
本發明的阻抗檢測電路包括單片機與串行通信模塊、蠕動泵驅動及外圍接口模塊、阻抗檢測模塊及電源模塊四部分構成，各個模塊之間通過各模塊電路圖中相同網絡標號的引腳相連接。
圖3和圖4分別是本發明一種阻抗檢測電路的單片機與串行通信模塊以及蠕動泵驅動及外圍接口模塊的電路圖。
圖3中阻抗檢測電路的核心控制晶片採用飛利浦公司P89C51型單片機。單片機 P89C51通過圖4中的步進電機直流電機驅動電路中的ULN2803A達林頓集成驅動晶片U3 和光電耦合器U6來分別控制圖2的通道12和13的開啟、停止、加速減速及正反轉。由於核心控制電路中的微控制器Ul的GPIO驅動能力有限，因此採用ULN2803A達林頓集成驅動晶片U3驅動圖2中通道12的步進電機，蠕動泵驅動電路板中接線端子P2的1、2、3、4、5接線柱分別與圖2中通道12的步進電機相連。微控制器Ul通過發出有序的矩形脈衝，控制 ULN2803A驅動四相步進電機實現加速、減速、正反轉等功能。
圖5是本發明一種阻抗檢測電路的阻抗檢測模塊的電路圖。在阻抗檢測模塊中採用ADI公司的AD5933型高精度的阻抗測量晶片測定抗體固定前、抗體固定後以及細菌滴加後TiO2納米線生物傳感器晶片在I Hz I MHz頻率範圍內的阻抗譜。AD5933晶片由片上集成頻率發生器與12位、IMSPS的模數轉換器(ADC)組成。用頻率發生器產生的信號來激勵外部復阻抗，外部阻抗的響應信號由片上ADC進行採樣，然後由片上DSP引擎進行離散傅立葉變換(DFT)處理。通過DFT算法在每個頻率上返回一個實部(R)數據字和一個虛部(I) 數據字。校準之後，算出各掃描頻率點的阻抗幅度和相對相位。隨後圖3中單片機P89C51通過串行通信模塊的RS232接口把數據傳遞給上機位(PC機)用戶。
圖6是本發明阻抗檢測電路的電源模塊的電路圖。阻抗檢測電路的各個模塊通過相應的埠與電源模塊相連。以此來通過電源驅動各個模塊的正常運轉。
四、以大腸桿菌為例，舉例說明利用本發明系統檢測細菌的過程。
I、將TiO2納米帶生物傳感器晶片置於微流通道中，使TiO2納米帶6與微流通道 3的流體流動方向相垂直，然後利用阻抗測定電路中的AD5933型高精度的阻抗測量晶片測定抗體固定前I Hz I MHz頻率範圍內TiO2納米帶生物傳感器晶片的阻抗值；2、取出TiO2納米帶生物傳感器晶片，對晶片表面進行抗體修飾，隨後將抗體修飾的 TiO2納米帶生物傳感器晶片置於微流通道3中，使TiO2納米帶6與微流通道3的流體流動方向相垂直，然後利用阻抗測定電路中的AD5933型高精度的阻抗測量晶片測定抗體固定後I Hz I MHz頻率範圍內TiO2納米線生物傳感器晶片的阻抗值；3、將通道12和13分別與阻抗檢測電路電連接，通過阻抗檢測電路控制第一蠕動泵向固定有TiO2納米帶生物傳感器晶片的微流通道3注入致病大腸桿菌。利用阻抗測定電路中的AD5933型高精度的阻抗測量晶片測定細菌吸附後I Hz I MHz頻率範圍內TiO2納米帶生物傳感器晶片的阻抗譜。隨後利用阻抗檢測電路控制13通道對固定有TiO2納米帶生物傳感器晶片的微流通道3注入一定量的去離子水進行清洗，以用於重複使用。
五、檢測結論圖7是本發明利用含TiO2納米帶生物傳感器晶片的系統檢測致病大腸桿菌時，抗體固定前後及濃度為IO2 cfu/ml的細菌捕獲後TiO2納米帶生物傳感器晶片的阻抗值與頻率的關係曲線。
從圖7可見，抗體加入後，TiO2納米帶生物傳感器晶片阻抗值降低。而當加入細菌後，TiO2納米帶生物傳感器晶片阻抗值升高。這是由於當TiO2納米帶表面固定抗體後,TiO2 納米帶表面輕基與抗體結合使得抗體固定，同時TiO2納米帶與抗體發生靜電吸引亦使得抗體被固定，由於抗體加入TiO2納米帶表面電荷減少引起阻抗降低；當對致病大腸桿菌進行檢測時，抗體捕獲細菌使得TiO2納米帶表面電荷增加而使得阻抗升高。這表明固定有抗體的TiO2納米帶生物傳感器晶片可以快速檢測致病性大腸桿菌。
權利要求
1.一種快速檢測致病大腸桿菌的TiO2納米帶生物傳感器晶片，其特徵在於包括兩個平行的金電極和TiO2納米帶,所述TiO2納米帶連接在兩個平行的金電極之間,所述TiO2納米帶為多層狀納米結構，所述TiO2納米帶的表面鍵合有若干羥基。
2.一種包含權利要求I的TiO2納米帶生物傳感器晶片的快速檢測食品致病菌的系統，其特徵在於包括生物傳感器、阻抗檢測電路、多通道蠕動泵和交變磁場；所述生物傳感器包括進樣容器、出樣容器和TiO2納米帶生物傳感器晶片，進樣容器和出樣容器通過微流通道連通，TiO2納米帶生物傳感器晶片中的TiO2納米帶置於所述微流通道內，TiO2納米帶生物傳感器晶片中的兩個平行的金電極分置於微流通道的兩側；所述TiO2納米帶生物傳感器晶片中的TiO2納米帶置於所述交變磁場內；在所述進樣容器上分別連接細菌進樣管和清洗液進樣管，所述多通道蠕動泵分別設置在所述細菌進樣管和清洗液進樣管上；所述阻抗檢測 電路分別與兩個金電極、多蠕動泵蠕動泵電連接。
3.根據權利要求2所述的快速檢測致病大腸桿菌的系統，其特徵在於所述阻抗檢測電路包括相互連接的單片機和阻抗檢測晶片。
全文摘要
快速檢測致病大腸桿菌的TiO2納米帶生物傳感器晶片及系統，涉及食品中細菌的檢測技術領域。TiO2納米帶生物傳感器晶片是在兩個平行的金電極之間連接有TiO2納米帶，TiO2納米帶為多層狀納米結構，TiO2納米帶的表面鍵合有羥基。快速檢測食品致病菌的系統的生物傳感器的進樣容器和出樣容器通過微流通道連通，TiO2納米帶生物傳感器晶片中的TiO2納米帶置於微流通道內，TiO2納米帶生物傳感器晶片中的兩個平行的金電極分置於微流通道兩側，且TiO2納米帶置於磁場內；該系統內裝有多級蠕動泵，分別連通細菌進樣管與進樣容器及清洗液進樣管與進樣容器。本發明可縮短細菌檢測時間，避免交叉感染。
文檔編號G01N27/02GK102928588SQ20121043245
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月2日 優先權日2012年11月2日
發明者董文鈞, 沈金明, 沈暘 申請人:江蘇康寶電器有限公司