一種人外周血RORγt轉錄本螢光定量PCR檢測方法
2023-05-07 13:16:46 1
專利名稱：一種人外周血RORγt轉錄本螢光定量PCR檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種人外周血單個核細胞ROR y t轉錄本螢光定量PCR檢測方法。屬於生物技術領域。
背景技術：
天然CD4+T細胞是包括許多亞群的異質性細胞。在體內微環境的作用下，能分化成不同類型具有不同免疫功能的細胞群。經典的觀點認為它在體內分化為Thl和Th2兩種細胞群體。Thl主要分泌IFN-y、 IL-2 、 TNF-e ，主要介導細胞免疫。而Th2主要分泌TGF-e和IL-6，介導體免疫和抗寄生蟲感染。後來又提出了一個新亞群--調節性T細胞(Treg細胞)，此細胞在體內調節Th細胞和Tc細胞使之處於動態平衡從而維護機體的免疫自身穩定.。最近，Harrington等根據分泌的細胞因子不同又發現了一種新的CD4+T細胞亞群Thl7細胞。此細胞分泌的效應因子主要是IL-I7。爾後由此誘生出其它細胞因子如IL-6、 TNF-a等、基質金屬激酶(MMP)和趨化因子如MCP-1、 MIP-2、 CLCL-1、 CXCL5等，從而引發炎症導致其他疾病如自身免疫性疾病、慢性炎症、腫瘤等。在研究Thl7細胞的分化過程中，發現了其特異性轉錄因子孤獨核受體(RORyt)，此轉錄因子在TGF-P和IL-6共同誘導下是IL-17基因表達的關鍵性調控因子。因此，檢測此轉錄因子水平，可以間接地反映出IL-17基因的表達水平，從而為研究TH17細胞分化及其在自身免疫性疾病、慢性炎症、腫瘤等疾病中的作用有著重要的臨床和科研意義。
轉錄因子的檢測方法以目前技術手段主要有兩種，其一是利用螢光標記的抗轉錄因子抗體，通過流式細胞儀從蛋白水平來檢測。此方法儘管特異性強，但因操作過程中需要特異性抗體、流式細胞儀等試劑和儀器，代價較高且操作繁瑣，故難於推廣。其二是利用聚合酶鏈反應(PCR)技術從基因水平來檢測。常規PCR只能定性且靈敏度低、汙染強，而螢光定量PCR具有靈敏度高、特異性強、無汙染且實時、定量、快速等特點。但螢光定量PCR技術對特異性要求較高，目前，還沒有實時、快速、準確地檢測人外周血單個核細胞孤獨核受體(RORYt)的檢測方法。
發明內容
為了填補人外周血單個核細胞孤獨核受體(ROR y t)轉錄因子在檢測方法方面的空白。本發明採用螢光定量PCR技術提供了一種能夠實時、準確、快速檢測人外周血單個核細胞孤獨核受體(RORYt)轉錄因子的檢測方法。
3鑑於螢光定量PCR技術對檢測過程中特異性要求較高，本發明是通過以下方法來提高檢測特異性的
(1) 利用Oligo 6.0和Primer prhner5.0軟體設計多對引物，並進行PCR擴增，通過瓊
脂糖凝膠電泳，選取目的條帶單一且產量最多的引物作為螢光定量PCR引物。
(2) 優化PCR反應體系，如通過改變引物濃度、提高退火溫度等方法減少非特異性擴增，提高特異性。
(3) 根據引物二聚體和目的基因Tm值不同，按照張馳宇等推薦螢光定量PCR四步法收集螢光，排除引物二聚體對檢測結果乾擾，提高反應特異性。
本發明所採用的技術方案如下-
一種人外周血單個核細胞RORYt轉錄本螢光定量PCR檢測方法，是首先設計特異性螢光定量引物，然後建立實時定量PCR反應體系和反應程序，製備含有目的片斷的質粒作為標準質粒繪製標準曲線，之後將待測樣品與標準質粒同時擴增，根據標準曲線確定樣品中目的基因的拷貝數。
其中特異性螢光定量引物，其序列如下正向引物5'-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC隱3，反向引物5'-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3，其中標準質粒所含目的基因序列如SEQ.ID.NO.l所示。
本發明檢測方法中，所述螢光定量PCR反應體系由下列組分構成10ul 2XSYBRMIX， 20nM正向引物、反向引物各0.2nl， 0.12plTaq酶，1 y 1標準質粒或樣本cDNA，補充滅菌水至於20 ul。
本發明檢測方法中，所述PCR反應程序為94°C 5min， 94°c30sec， 65°C 30sec ， 72°C30sec， 88°C 10sec收集螢光，擴增40個循環，72°C 7min。
本發明利用螢光定量PCR技術提供了一種能夠實時、快速、準確地檢測人外周血孤獨核受體(RORYt)的檢測方法，從而填補了該轉錄因子在檢測方法方面的空白。
圖1為螢光定量PCR標準品擴增的融解曲線圖中橫坐標代表解鏈溫度圖中縱坐標代表相對螢光強度
圖中平行於縱坐標的直線所對應橫坐標的溫度為收集螢光信號的溫度(88°0圖中的曲線從上至下依次代表標準品拷貝數為108、 107、 106、 105、 104、 103 copies/
4U1及以滅菌水作為模板的空白對照的融解曲線圖2為螢光定量PCR標準品擴增的螢光信號中橫坐標代表循環數圖中縱坐標代表相對螢光強度圖中平行於橫坐標的直線代表循環閾值
圖中的曲線從左向右依次代表標準品拷貝數為108、 107、 106、 105、 104、 103 c叩ies/li 1及以滅菌水作為模板的空白對照的螢光信號圖3為螢光定量PCR擴增的標準曲線y=-3.332Iog(conc)+34 .521圖中橫坐標代表標準質粒的拷貝數(copies/y 1)圖中縱坐標代表循環數
注cone為標準質粒或樣本cDNA copies/ul
具體實施例方式
下面結合具體實施例來進一步闡述本發明，但應當理解這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求保護的範圍。
材料
Ficoll淋巴細胞分離液(天津灝洋生物技術有限公司)，Trizol (invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(ToYoBo公司)，SYBR Greenl Real Time PCR Kit (杭州BIOER公司)，rTaq酶、dNTP、 10 X Buffer、 pMD18-T (TakaRa公司)，Rotor Gene RG6000螢光定量PCR儀(澳大利亞Corbett公司)，PMA、 Inomycin (Sigma公司)實施例1:
製備含ROR Y t目的基因的標準曲線1， 引物設計與合成
先從 http:〃www.ncbi.nlm.nig.gov/GenBank 中査找人 RORC mRNA 序列(NM001001523 .1)，然後根據人RORC mRNA保守序列(CDS區域)為模板利用Oligo 6.0和Primer primer5.0軟體設計引物，最後通過NCBI中BLAST從中挑選最佳引物送上海生物工程有限公司合成。引物、模板序列如下
正向弓l物5'-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3' ( SEQ.ID.NO.2)
反向引物5'-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3， ( SEQ.ID.NO.3)
模板(SEQ.ID.NO.l)GCAGAGAGA-3，
2. 刺激培養人外周血單個核細胞(PBMC)
取外周靜脈血2ml經肝素抗凝後，用人的淋巴細胞分離液(Ficoll分離液)按照產品說明書操作分離單個核細胞。此單個核細胞用RPMI1640培養基(含終濃度為50ng/ml PMA和終濃度為lPg/ml離子黴素)調整細胞密度為lX10Vml，放入24孔板，每孔1X106細胞數，於5% C02 37。C刺激培養，5h後收集細胞。
3. 提取人外周血單個核細胞總RNA
收集上述經刺激培養後的外周血單個核細胞。加入細胞裂解液Trizol，裂解細胞，然後按照Trizol說明書提取總RNA。
4. 逆轉錄單個核細胞總RNA
利用逆轉錄酶腿LV將上述人外周血單個核細胞總RNA逆轉錄成cDNA。逆轉錄反應體系為4"1 5XRT Buffer、 2m1 dNTP mixture (各10mM)、 lul RNase Inhibitor(10U/iil)、 lul 0ligo(dT)2。隨機引物、ly 1逆轉錄酶(ReverTra Ace) 、 lugcDNA模板，其餘用Rnase Free H2O補足至20ul，於PCR儀上42°C 20min、 99°C 5min、 4°C 5min。
5. 構建標準質粒
1) PCR條件優化在20 ii 1反應體系中以前述的cDNA為模板，加入dNTP 、 10XBuffer、前述特異性上、下遊引物、rTaq酶和滅菌水以不同的退火溫度擴增30個循環，PCR反應結束後取5 n 1產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，最後EB染料染色，凝膠成像儀上觀察。取目的條帶最亮而又無非特異性條帶的退火溫度作為最佳退火溫度。
2) T-A克隆按上述的PCR反應條件擴增RORYt基因，PCR產物經純化後，同pMD18-T載體(2692bp)按一定的比例混合，於16°C連接30min,然後該連接產物轉化感受態細胞DH5a菌。根據藍白斑篩選挑取陽性克隆。然後用鹼裂解法抽提質粒,通過PCR和酶切鑑定，如鑑定陽性，則送公司測序。
3)稀釋標準質粒測定上述測序正確的陽性質粒的核酸濃度，並計算出其拷貝數/"l，然後將陽性質粒先稀釋成1X 1(Tc叩ies/ u 1，然後按10倍依次倍比稀釋成1X 109、 1X 108、1X107、 1X106、 1X105、 1X104、 lX103copies/u 1。
6. 制定標準曲線
以上述稀釋的標準質粒作為模板，利用SYBR Grrenl能嵌合到雙鏈DNA，結合螢光定量PCR儀能夠實時檢測螢光強度的特點來制定標準曲線。螢光定量PCR反應體系如下在20wl反應體系中加入稀釋的標準質粒各lul、 10ul 2XSYBRMIX、特異性上、下遊到
6物(20 u M)各0.2 iU 、 Taq酶0.12 P 1，其餘用滅菌水補足至20 u 1，在螢光定量PCR儀上94。C5min、 94°C 30sec、 65°C 30sec 、 72°C 30 sec、 88°C 10sec (收集螢光—此步驟為基於SYBR Grrenl的螢光定量PCR檢測的四步法，即在通用的三步法延伸之後增加一個短暫的螢光收集步驟以消除引物二聚體對檢測結果的幹擾)，擴增40個循環，72°C7min，最後進行融解曲線分析以確定PCR反應的特異性。
標準品的融解曲線圖參見圖1，標準品的螢光信號圖參見圖2，標準品的標準曲線圖參見圖3。
樣本外周血單個核細胞RORYt轉錄本的檢測
外周血單個核細胞按前述的方法製備成cDNA，然後與標準質粒同時進行PCR反應，最後根據標準曲線來確定樣本中ROR Y t轉錄本的拷貝數。
正常人(ND)和胃癌患者(GC)外周血單個核細胞ROR Y t轉錄本的檢測
10例正常人和10例經胃鏡或手術病理證實的胃癌患者外周血單個核細胞ROR Yt轉錄
本相對表達(以e -actin作為內參照基因)的檢測結果如下
li性別年齡(歲)~M~~定量(拷貝數io3 / "i) 腿y t/ e
例 e -actin _actin
3. 7973900.001
10. 3085500. 001
6. 5787000. 001
22. 7080950. 003
1,2421460. 001
19. 6059550. 003
6. 7547200. 001
8. 6435800.002
81.80307500. 003
6.6835810. 002
66. 7018650.036
54. 8017700. 031
24. 6522350.011
505. 0092000. 055
73. 9015750.047
8. 456590.013
29. 3026300.011
43. 7018950.023
50. 8027400. 019
26. 206170. 042
7
DDDDDDDDDDCCCCCCCCCC
NNNNNNNNNNGGGGGGGGGG
8 8
5 2
512726396810
3434645365
7 5
5 9 2
4 5
6 5
4
4
123456789
01234567890
11111111112〈110>江蘇大學
〈120〉一種人外周血ROR Y t轉錄本螢光定量PCR檢測方法 <160〉3
〈210>1 〈211>170 〈212〉DNA 〈213〉人(Homo)
〈400〉1
cctgggctcc tcgcctgacc tgcctgaggc ttctgcetgt ccecctggcc tcctgaaagc 60
ctcaggctct gggccctcat attccaacaa cttggccaag gcagggctca atggggcctc 120
atgccacctt gaatacagcc ctgagcgggg caaggctgag ggcagagaga 170
20 〈212>腿 〈213〉人工序列
〈400〉2
cctgggctcc tcgcctgacc 20
〈210>3 〈211>22 DNA <213〉人工序列
〈400>3
tctctctgcc ctcagccttg cc 2權利要求
1、一種人外周血RORγt轉錄本螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，首先設計特異性螢光定量引物，然後建立實時定量PCR反應體系和反應程序，製備含有目的片斷RORγt的質粒作為標準質粒繪製標準曲線，最後待測樣品與標準質粒同時擴增，根據標準曲線確定樣品目的基因的拷貝數。
2、 根據權利要求1所述的一種人外周血RORYt轉錄本螢光定量PCR檢測方法， 其特徵在於，其中特異性螢光定量引物，其序列如下正向引物5'-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3， 反向弓l物5，-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3' 其中標準質粒所含目的基因序列如SEQ.ID.NO.l所示。
3、 根據權利要求1所述的一種人外周血RORYt轉錄本螢光定量PCR檢測方法， 其特徵在於，上述螢光定量PCR反應體系由下列組分構成10ul2XSYBRMIX， 20y M正向引物、反向引物各0.2iU， 0.12ulTaq酶，1 U 1標準質粒或樣本cDNA，補充滅 菌水至於20u 1。
4、 根據權利要求1所述的一種人外周血RORYt轉錄本螢光定量PCR檢測方法， 其特徵在於，PCR反應程序為94°C 5min， 94°c 30sec， 65°C 30sec ， 72°C 30 sec, 88°C 10sec 收集螢光，擴增40個循環，72°C7min。
全文摘要
本發明涉及一種人外周血RORγt轉錄本螢光定量PCR檢測方法。其特徵在於，首先設計特異性螢光定量引物，然後建立實時定量PCR反應體系和反應程序，製備含有目的片斷RORγt的質粒作為標準質粒繪製標準曲線，最後待測樣品與標準質粒同時擴增，根據標準曲線確定樣品目的基因的拷貝數。本發明由於利用了螢光定量PCR具有靈敏度高，特性強，無汙染且實時、準確、快速的特點，從而填補了該基因在檢測方法方面的空白，為研究TH17細胞分化提供了一個實用方法。
文檔編號G01N21/64GK101580874SQ20091003021
公開日2009年11月18日 申請日期2009年3月17日 優先權日2009年3月17日
發明者燁 史, 吳朝陽, 彭素芳, 楊先知, 王海生, 王勝軍, 許化溪, 陳建國 申請人:江蘇大學