一種通過糞便睪酮含量判定林麝泌香活動時間的方法

2023-05-07 10:37:26 1

一種通過糞便睪酮含量判定林麝泌香活動時間的方法
【專利摘要】本發明公開了一種通過糞便睪酮含量判定林麝泌香活動時間的方法。本發明公開的一種輔助判斷林麝泌香活動時間的方法，包括如下步驟：在5月-8月連續每天測定林麝的糞便中的睪酮含量，得到糞便中的睪酮佔每克幹糞的質量比例，記作A；從測定的第一天開始，在第m天開始連續3天的A值顯著大於第m-1天的A值，將第m天記作泌香活動準備起始時間點，之後在第n天開始連續3天的A值降至第m-1天的A值水平及以下，將第n+2天記作泌香活動確定終止時間點，在泌香活動準備起始時間點至泌香活動確定終止時間點之間的時間段內發生泌香活動。本發明的方法既對動物沒有幹擾，也能準確預測香腺活動的起始，為雄麝泌香期的管護和預測提供科學依據。
【專利說明】一種通過糞便睪酮含量判定林麝泌香活動時間的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種通過糞便睪酮含量判定林麝泌香活動時間的方法。
【背景技術】
[0002]麝科物種是亞洲特產野生動物(吳家炎等，2006 ;盛和林等，2007)，目前普遍認為有5-6個獨立的種(Groves, 1995 ；Zhang, 1998 ；Yang, 1999)。麝香腺囊是雄麝的特有器官，位於腹下部陰囊與臍帶之間。麝香腺能分泌一種特殊物質——磨香，是名貴的藥材和香料。我國是麝資源最豐富的國家，種群數量曾佔世界總量的70%以上，麝香產量也曾佔全世界產量的90%以上。因麝香的巨大市場需求及高昂的價格，我國麝資源遭受嚴重的非法盜獵和過度利用，麝種群數量已由上世紀50年代的200-300萬頭下降至目前的6-7萬頭，分布區呈現急劇縮減。所有麝類動物均被納入瀕危野生動植物國際貿易公約附錄中(CITES，1979)和瀕危物種保護紅皮書中(IUCN，1996)。我國已將所有麝類物種列為國家I類重點保護物種(國家林業局,2003 )。
[0003]麝香是一種重要的外激素，影響麝類動物的繁殖活動(Flerov，1952 ；Homes,1999)。我國自1958年開始麝類動物的人工養殖，旨在獲取高品質和高產量的麝香。雄麝在泌香期的生物學特徵是養麝業關注的問題，多年研究表明，雄麝在泌香期會發生顯著的行為和生理變化，主要有食慾下降乃至拒食，香囊腫脹，體溫升高，尿液PH值變化等(李復東等，1980 ;尹淑媛和戴衛國，1990)。雄麝香腺活動早期及隨後的泌香期是管護林麝的關鍵時期，掌握雄麝香腺活動狀態顯得尤為重要。因麝類動物應激性極高，不易接近，導致香囊的外部形態變化難以觀測；行為觀察較簡單直觀，然而，食慾不佳及拒食行為容易與一些病態行為相混淆，且時間上滯後；體溫升高及尿液PH值不是香腺活動的特定指標，易與體況及疾病症狀相混淆。因此，迄今尚無判定雄麝香腺早期活動的準確方法。研究證實，雄麝泌香活動受控於下丘腦-垂體-生殖腺-香腺，睪酮是香腺活動的誘因(李復東等，1980 ;畢增書等，1981 ;尹淑媛等，1990)。由此，測定雄麝睪酮值可準確判定香腺活動的起止，但迄今尚未見有關雄麝睪酮變化與泌香活動的詳盡報導。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種通過糞便睪酮含量判定林麝泌香活動時間的方法。
[0005]本發明提供的一種輔助判斷林麝泌香活動時間的方法，包括如下步驟:在5月-8月連續每天測定林麝的糞便中的睪酮含量，得到糞便中的睪酮佔每克幹糞的質量比例，記作A ;從測定的第一天開始，在第m天開始連續3天的A值顯著大於第m-Ι天的A值，將第m天記作泌香活動準備起始時間點，之後在第η天開始連續3天的A值降至第m-Ι天的A值水平及以下，將第n+2天記作泌香活動確定終止時間點，在泌香活動準備起始時間點至泌香活動確定終止時間點之間的時間段內發生泌香活動；
[0006]所述幹糞為水分的質量百分含量為37.9±9.8%的糞便；
[0007]所述泌香為林麝遺漏麝香香液或彌散麝香香味。[0008]一種輔助判斷林麝泌香活動時間的方法也屬於本發明的保護範圍，包括如下步驟:在5月-8月連續每天測定林麝的糞便中的睪酮含量，得到糞便中的睪酮佔每克幹糞的質量比例，記作A ;從測定的第一天開始,將A連續3天大於1877.0ng/g的第一天記作泌香活動準備起始時間點，之後將A連續3天低於1877.0ng/g的最後一天記作泌香活動確定終止時間點，在泌香活動準備起始時間點至泌香活動確定終止時間點之間的時間段內發生泌香活動；
[0009]所述幹糞為水分的質量百分含量為37.9±9.8%的糞便；
[0010]所述泌香為林麝遺漏麝香香液或彌散麝香香味。
[0011]上述方法中，所述林麝的糞便中的睪酮含量的測定時間選取如下:每天的同一時間取所述林麝的糞便測定所述林麝的糞便中的睪酮的含量；
[0012]所述時間具體為每天早上6:00-8:00。
[0013]上述任一所述的方法中,所述泌香活動的發生時間點在所述泌香活動準備起始時間點之後第7-15天。
[0014]糞便中睪酮含量作為標誌物在輔助判斷林麝泌香活動時間中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0015]檢測糞便中睪酮含量的物質在製備輔助判斷林麝泌香活動時間的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0016]上述任一所述的應用中，所述泌香為林麝遺漏麝香香液或彌散麝香香味。
[0017]林麝在泌香期(5-8月)糞便中的睪酮僅出現一次持續的高水平期，提示林麝僅有一次泌香活動。
[0018]林麝糞便睪酮明顯上升的時間點較之拒食行為能更早、更準確的判斷林麝香液滲出及麝香香味彌散，成為雄麝泌香期管護的重要指示參數。
[0019]本發明具有以下優點:
[0020](I)本發明針對雄麝特殊的泌香活動，遴選準確、簡單的判定香腺活動的方法。
[0021](2)本發明首次揭示雄麝睪酮分泌規律，證實每隻雄麝在泌香期僅有一次泌香活動。
[0022](3)本發明首次採用非損傷性方法，即採用糞便睪酮含量確定雄麝香腺活動的時間，這種方法既對動物沒有幹擾，也能準確預測香腺活動的起始，為雄麝泌香期的管護和預測提供科學依據。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1-圖26分別為26隻林麝的睪酮含量變化趨勢圖。
【具體實施方式】
[0024]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0025]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0026]睪酮酶聯免疫診斷試劑盒購自北京北方生物技術研究所，產品目錄號為E-88-96。
[0027]實施例1、糞便睪酮含量與林麝泌香的關係
[0028]本專利的實施例中，泌香活動是指林麝遺漏麝香香液/彌散麝香香味。[0029]一、在2012年5-8月間，每天採集同一組(16隻)成年健康雄麝的糞樣，採集時間為每天早上6:00-8:00，得到雄麝糞便。
[0030]二、糞便睪酮的提取與測定
[0031]將雄麝糞便參照Wasser (2000)和Yu (2010)的方法提取糞便激素，具體操作如下:將解凍後的雄麝糞便置於研缽中研碎，混勻後，稱取0.5g溼糞於盛有5ml體積百分含量為90%的乙醇水溶液的離心管中，震蕩lmin,60°C溫育20min, 2500rpm離心20min,上清液倒於?甘禍中，沉澱中加入5ml同等濃度的乙醇,震蕩2min, 2500rpm離心15min,合併兩次上清液，60°C蒸乾，加Iml甲醇，震蕩回收，_20°C保存備用。
[0032]三、糞便睪酮測定 [0033]酶聯免疫檢測睪酮的原理:採用酶聯免疫競爭法檢測待測樣品中的睪酮含量。首先用羊抗兔包被微孔板，製成固相二抗，然後加入待測樣品、辣根過氧化物酶標記睪酮(睪酮(HRP)複合物)以及抗睪酮抗體，使之形成包被二抗-抗睪酮抗體-睪酮(HRP)複合物，睪酮(HRP)複合物的結合量與待測樣品中的睪酮含量成反比。經顯色後再用酶標儀測定吸光值，通過計算機擬合濃度-吸光值曲線，根據濃度-吸光值曲線反算出待測樣品中的睪酮含量。
[0034]採用北京北方生物技術研究所的睪酮酶聯免疫診斷試劑盒測定糞便睪酮水平(單位為ng/ml )，再將得到的濃度換算成睪酮佔每克幹糞(幹糞指的是烘乾水分後的糞便，水分的質量百分含量為37.9 ±9.8%)的質量比例(單位為ng/g)。
[0035]四、數據處理
[0036]實驗取得的數據通過SPSS13.0進行數據分析，使用originS.0數據繪圖。數據結果以"Mean 士 SE"的形式表示。所分析的數據都通過單一樣本K-S檢驗(One-SampleKolmogorov-Smirnov Test)進行正態分布檢驗。組內數據使用單因素方差分析(one-wayAN0VA),組間比較採用獨立樣本T檢驗(Independent-samples T test),使用這兩種檢驗均進行了方差齊性檢驗，顯著水平設置α=0.05。雄麝糞便睪酮含量採用平方歐式距離(Euclidean distance)進行系統聚類分析(Systematic cluster analysis)。
[0037]五、實驗結果
[0038](一)雄麝糞便睪酮的含量
[0039]16隻實驗雄磨糞便睪酮的測定結果為，最高值為25264.8ng/g,最低值為273.1ngfg0各個體的睪酮變化如圖1-圖16所示。運用系統聚類法處理16個實驗雄性林麝個體的糞便睪酮值，得出所有實驗個體的糞便睪酮值可分為兩組，即高睪酮值組和低睪酮值組。運用獨立樣本T檢驗逐一比較每個實驗林麝的兩組數據的差異性，得出所有個體的高睪酮值組和低睪酮值組之間存在顯著性差異(P〈0.05)。因此得出，實驗期間雄性林麝存在一個睪酮顯著上升的時間段。
[0040](二)糞便睪酮高值組和低值組的統計處理
[0041]採用迭代法處理每個個體的低值組和高值組的糞便睪酮值，去除平均值±2SD以外的值，直到所有的值均在平均值±2SD範圍內，由此求得每個個體糞便睪酮的低值組的平均值Ml=695.3ng/g。同理,求得每個個體糞便睪酮的高值組的平均值M2=4313.5ng/g。經過獨立樣本T檢驗，兩者存在顯著差異(P〈0.05)。
[0042](三)糞便睪酮低值組的「標準值」[0043]採用迭代法處理所有個體的Ml數據集合，求得該數據集合的平均值和標準差，定義為M3:即M3=M1±2SD=695.3±2X163.7ng/g，此值為糞便睪酮未顯著上升前的「標準值」。
[0044](四)糞便睪酮高值組的「標準值」
[0045]採用迭代法處理所有個體的M2數據集合，求得該數據集合的平均值和標準差，定義為M4，即M4=M2±2SD=4313.5±2X 1218.3ng/g,此值為糞便睪酮顯著上升後的「標準值」。
[0046](五)糞便睪酮明顯上升的判斷標準
[0047]以M2的下限值(M2-2SD)判斷雄麝糞便睪酮值是否達到睪酮高值組的水平，即顯著上升。計算得出M2_2SD=1877.0ng/g,該值即為指示值I (Indicator value, IV1)。
[0048]六、同時進行雄麝的麝香香液/麝香香味出現的時間(以下簡稱香味/香液出現時間)、拒食行為出現及持續的時間，並計算糞便睪酮明顯上升的時間點(即糞便睪酮含量連續3天高於1877.0ng/g的第一天)較拒食行為出現提前的天數、糞便睪酮明顯上升的時間點(即糞便睪酮含量連續3天高於1877.0ng/g的第一天)較香液/香味出現時間提前的天數、糞便睪酮含量降至糞便睪酮明顯上升之前的水平的時間點(即糞便睪酮含量連續3天低於1877.0ng/g的最後一天)較拒食行為結束推遲的天數，結果如表I所示。
[0049]表I中，睪酮較拒食提前的天數為糞便睪酮明顯上升的時間點(即糞便睪酮含量連續3天高於1877.0ng/g的第一天)較拒食行為出現提前的天數，睪酮較香液/香味出現時間提前的天數為糞便睪酮明顯上升的時間點(即糞便睪酮含量連續3天高於1877.0ng/g的第一天)較香液/香味出現時間提前的天數，睪酮降至糞便睪酮明顯上升之前的水平較拒食結束推遲的天數為糞便睪酮含量降至糞便睪酮明顯上升之前的水平的時間點(即糞便睪酮含量連續3天低於1877.0ng/g的最後一天)較拒食行為結束推遲的天數。
[0050]編號為1-16的雄麝的糞便睪酮含量顯著上升的時間點(即糞便睪酮含量連續3天高於1877.0的第一天)、出現拒食行為的時間點以及出現香液遺漏/香味彌散的時間點分別如圖1-圖16所示，圖1-圖16中的箭頭所表示的含義均相同。
[0051]表I雄磨香液/香味出現的時間、拒食行為出現及持續的時間、睪酮含量顯著上升及
[0052]持續的時間及以上三者之間的關係
[0053]
【權利要求】
1.一種輔助判斷林麝泌香活動時間的方法，包括如下步驟:在5月-8月連續每天測定林麝的糞便中的睪酮含量，得到糞便中的睪酮佔每克幹糞的質量比例，記作A ;從測定的第一天開始，在第m天開始連續3天的A值顯著大於第m-Ι天的A值，將第m天記作泌香活動準備起始時間點，之後在第η天開始連續3天的A值降至第m-Ι天的A值水平及以下，將第η+2天記作泌香活動確定終止時間點,在泌香活動準備起始時間點至泌香活動確定終止時間點之間的時間段內發生泌香活動； 所述幹糞為水分的質量百分含量為37.9±9.8%的糞便； 所述泌香為林麝遺漏麝香香液或彌散麝香香味。
2.一種輔助判斷林麝泌香活動時間的方法，包括如下步驟:在5月-8月連續每天測定林麝的糞便中的睪酮含量，得到糞便中的睪酮佔每克幹糞的質量比例，記作A ;從測定的第一天開始，將A連續3天大於1877.0ng/g的第一天記作泌香活動準備起始時間點，之後將A連續3天低於1877.0ng/g的最後一天記作泌香活動確定終止時間點，在泌香活動準備起始時間點至泌香活動確定終止時間點之間的時間段內發生泌香活動； 所述幹糞為水分的質量百分含量為37.9±9.8%的糞便； 所述泌香為林麝遺漏麝香香液或彌散麝香香味。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於:所述林麝的糞便中的睪酮含量的測定時間選取如下:每天的同一時間取所述林麝的糞便測定所述林麝的糞便中的睪酮的含量。
4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特徵在於:所述泌香活動的發生時間點在權利要求I或2所述的泌香活動準備起始時間點之後第7-15天。
5.糞便中睪酮含量作為標誌物在輔助判斷林麝泌香活動時間中的應用。
6.檢測糞便中睪酮含量的物質在製備輔助判斷林麝泌香活動時間的產品中的應用。
7.根據權利要求5或6所述的應用，其特徵在於:所述泌香為林麝遺漏麝香香液或彌散麝香香味。
【文檔編號】G01N33/64GK103777020SQ201410035639
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月24日 優先權日:2014年1月24日
【發明者】何嵐, 劉寶慶, 李林海, 胡德夫, 王文霞, 衛寧, 葛興芳, 連航浜 申請人:北京林業大學