一種快速檢測痕量吡蟲啉殘留的試劑盒的製作方法

2023-05-07 05:20:01

專利名稱：一種快速檢測痕量吡蟲啉殘留的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫化學檢測領域，涉及一種快速檢測微量氯化菸鹼殺蟲劑吡蟲啉的酶聯免疫檢測試劑盒。二、技術背景
1978年在瑞士蘇黎世舉行的國際純粹化學與應用化學協會(IUPAC)年會上，Soloway 等報導了一類稱為硝基甲撐殺蟲劑的新化合物，並指出這類化合物中殺蟲活性最高的是硝基噻嗪(N i t h i a ζ i η e )，但由於硝基噻嗪分子中的2 -硝基亞甲基遇光易分解，致使 Nithiazine沒有完全市場化，因此，其未能大範圍服務於農業生產。20世紀80年代後期， 日本科學家以Nithiazine為先導結構，通過和硝基胍建立橋偶聯，引入含氮原子的芳雜環甲基，作為2-硝基亞甲基-咪唑烷五元環或六元環系列的N-取代化合物，再通過雜環上官能團轉換，獲得了一系列結構衍生物，通過殺蟲活性測定，發現活性最高的是硝基亞胺類化合物，該類化合物經過在世界各地的大田實驗，發現其中的的吡蟲啉(Imidacloprid，IMI) 在殺蟲活性、光穩定性、低毒性和廣泛使用性等方面表現突出，1991年英國布萊頓作物保護會議上IMI作為殺蟲劑被首次介紹，當年即投入商業化生產。IMI是新型氯化菸鹼類殺蟲劑中的第一個品種，也是代表品種。目前已成功開發出的劑型包括可溼性粉劑(WP)、微膠囊劑 (GG)、乳油(EC)、可溶性液劑(SL)、可溶性粉劑(SP)五大系列，共計70餘個產品。目前，含 IMI的殺蟲劑產品已在120餘個國家的140餘種農作物上獲得登記，其應用範圍涉及糧食、 經濟、果樹、茶葉和蔬菜等60餘種作物，防治對象涉及同翅目、鞘翅目和鱗翅目等7個目50 多種害蟲。IMI以昆蟲菸鹼型乙醯膽鹼受體(nAchR)為分子靶標，IMI與該受體結合，會造成因IMI刺激引起的神經衝動電傳導受阻，導致昆蟲異常興奮、痙攣、身體搖晃至衰竭死亡等中毒症狀。研究發現IMI對環境生物，如蜜蜂、家蠶均有極高的胃毒和觸殺毒性，且其代謝產物去硝基吡蟲啉(Desniero-Lnidacloprid，DN-IMI)對蜜蜂也表現為高毒。目前因IMI 使用不當，造成的大面積蜜蜂、家蠶中毒事件時有發生。IMI對水生生物(如魚、蝦、蝌蚪、青蛙)、土壤有益生物(如蚯蚓)雖屬中等毒性，但在一定劑量範圍內均顯示出一定程度的遺傳毒性，且其水解產物和光解產物與IMI原藥有類似的生態效應。此外，IMI除對一些天敵生物表現出直接毒性外，對一些天敵生物還具有明顯的亞致死效應。不僅會使其產卵量減少、 壽命縮短，而且其功能性反應參數也會顯著改變，即明顯降低其對寄主的搜索能力。尤其值得注意的是，國外學者近年來報導了 IMI在高等動物體內有明顯的慢性蓄積毒性、對人類的遺傳毒性和潛在的影響學習和影響記憶的效應。目前關於IMI殘留的檢測方法主要是儀器方法，包括高效液相色普法(HPLC)、氣相色譜質普聯用法(GC-MS)和液相色譜質普聯用法(LC-MS)等，這些方法雖然表現出檢出靈敏度高和特異性強等優勢，但殘留樣本需要經過繁瑣費時的預處理程序(樣品提取和淨化)；同時這類檢測方法需要大型的專門檢測儀器設備、專門的實驗室和高水平的專業技術人員操作，無法進行現場檢測，時效性差，難以推廣。殘留物的生物技術檢測方法主要是酶抑制法(EIA)和酶聯免疫吸附測定法(ELISA)0 EIA技術主要是利用農藥對膽鹼酯酶活性有抑制作用的原理，酶與底物反應後， 通過比色法測定酶抑制率，來判定農藥殘留是否超標。但EIA的應用有很大的局限性，存在著只能用來檢測有機磷酸酯類和氨基甲酸酯類農藥、假陽性或假陰性檢測結果出現的概率比較大、難以從多殘留樣本中檢測單一農藥、不能定性、只能粗略定量等技術問題。以競爭性酶聯反應為檢測原理的ELISA檢測技術在以上幾方面則有明顯優勢，反應結束後用酶標分析儀測相應的OD值，OD值越低表示被檢樣本中的殘留樣品含量越高，且節省時間、費用低，定性和定量同時進行，基於單克隆抗體的ELISA幾乎不會出現假陽性或假陰性現象。但由於ELISA是一種靈敏度很高的檢測方法，不同的操作者往往會出現不同的檢測結果，所以該方法常常造成人為的誤檢和漏檢。因此，基於ELISA原理物化出來的標準化、程序化檢測產品的研製開發就顯得尤為必要。目前IMI殘留免疫學檢測試劑盒的開發在國內尚屬空白，急待研究解決。
發明內容
本發明的目的研製並開發出特異性強、靈敏度高、操作便捷、經濟實用的農產品中微量IMI殘留快速檢測試劑盒。本發明的技術方案是
本發明含有吡蟲啉包被抗原AET-IMI-0VA包被並封閉好的96孔酶標反應板，用於研磨植物組織的石英砂，工作濃度的抗吡蟲啉單克隆抗體，工作濃度的酶標記二抗GaMIgG-HRP， 底物緩衝液，反應終止液，洗滌緩衝液，工作濃度的陰性血清和用於製作標準曲線的系列濃度的吡蟲啉標準溶液，其中酶標記二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠RaMIgG-HRP ； 偶聯IMI人工半抗原的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白0VA，或匙孔血藍蛋白 KLH。本發明的有益效果是
1.特異性強，靈敏度高。本發明試劑盒以強特異性和高親和力的IMI-mAb為基礎製備而成，具有較強的特異性和較高的靈敏度，其在8. 30 ΧΙΟ"6 mg/mL^5. 32X10_4 mg/mL的 IMI濃度範圍內與對應的抑制率線性關係良好(R2=O. 997)，採用簡易樣本前處理程序，獲得的殘留檢測樣本中IMI的添加回收率均大於75.0% (CV < 10.0%)，方法的最低檢測限為 8. OOXlO-6 mg/mL，且與結構類似的常用氯化菸鹼殺蟲劑無交叉反應(CR < 0. 05%)。本發明在保障農產品質量安全，保護消費者健康方面具有極其重要的意義。2.簡便、快速。使用本發明試劑盒，無需其它任何試劑和儀器，可現場操作。只要將殘留樣本經過方法所述的簡單預處理，在30分鐘內即可判定檢測結果。3.結果顯示形象、直觀、準確。本發明試劑盒以顯色反應為定性和定量標準，通過與標準比色卡比對，根據顯色反應作為檢測結果陽性和陰性標記，結果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現假陽性和假陰性等人為誤判。4.節省費用。使用該試劑盒，無需另配儀器設備和其它試劑，可能隨時隨地進行檢測，費用低廉，節省大量貴重儀器及設備費用。5.適用範圍廣，便於推廣應用。該試劑盒操作簡便，能滿足不同層次人員需要，包括專業化驗、海關檢疫、衛生檢疫、質量監測、農產品加工、以及消費者個人等，具有廣闊的市場前景和明顯的經濟、社會效益。具體實施例方式要製成快速檢測微量IMI的檢測試劑盒，首先要把IMI與載體蛋白有效偶聯，通過按既的免疫程序免疫試驗動物產生多克隆抗體，然後採用細胞融合技術製備其雜交瘤細胞，從而篩選和製備IMI-mAb，其次需製備小鼠IgG抗體，最後通過建立間接競爭ELISA模式，即可用於樣品檢測。1. IMI與載體蛋白偶聯
首先以IMI原藥和β -巰基丙酸為起始原料，在熱鹼作用下通過親核取代反應，合成出 IMI人工半抗原，再採用碳二亞胺法(EDC)將IMI與載體蛋白進行偶聯製備人工結合抗原。第一步縮合反應引入羧基，用40 mL DMSO在反應燒瓶中溶解9 g原藥(經過重結晶提純)，加入4 g Κ0Η。攪拌下將4 mL β-巰基丙酸緩慢滴加至反應燒瓶，於100 °C油浴下反應2 h，撤去油浴待產物自然冷卻至室溫後，用100 mL CH3CI2提取此混合液；然後用6 moL/L HCl調節萃取液pH為3，再加入100 mL乙酸乙酯萃取，最後減壓濃縮、乾燥得淡黃色固體，即為IMI人工半抗原。第二步利用碳二亞胺(EDC)作縮合劑，採用碳二亞胺法將IMI人工半抗原分子中的羧基與載體蛋白(BSA/0VA)分子中的氨基以醯胺鍵偶連，合成IMI免疫抗原和包被抗原。 將14. 7 mg/mL的IMI半抗原與20 mg/mL BSA的PBS溶液混合，室溫下低速震蕩過夜，再以 3000 rpm離心5 min，棄沉澱後先在上清液中加入2 mL NHS作保護劑，然後逐滴加入5 mg/ mL EDC水溶液，繼續振蕩5 h，再以3000 rpm離心5 min，上清液用PBS連續透析3 d，其間每隔8 h更換一次透析液，透析完畢後分裝，即得免疫抗原(IMI-BSA)。再將BSA換為0VA， 採用與IMI-BSA合成相同的步驟合成包被抗原(IMI-0VA),供ELISA檢測包被酶標板之用， IMI-BSA和IMI-OVA經真空冷凍乾燥後，於一 20°C保存，備用。2.抗IMI單克隆抗體(IMI-mAb)的製備
單抗製備以80 μδ/只的IMI-BSA偶聯物免疫8周齡BALB/c小鼠5次，每次免疫間隔時間3周，最後一次超強免疫後3天，將免疫小鼠眶下竇採血，分離陽性血清；拉頸致死， 用75%酒精浸泡小鼠10 min消毒體表，無菌取其脾臟，將脾臟剪碎並研磨，經120目尼龍紗布過濾，1000 rpm離心10 min，收集脾細胞。將1 X IO8的脾細胞與NSO骨髓瘤細胞按10 1的比例混合，1000 rpm離心10 min棄上清，細胞沉澱物於37 °〇水浴中緩緩加入1. 0 mL 50%的PEG-4000作用1 min，然後緩緩加入無血清1640培養基15 mL,以終止PEG的作用，37 °C下水浴10 min, 1000 rpm離心10 min棄上清，將細胞沉澱物重懸於HAT選擇培養基中，並加入96孔細胞培養板孔(150 μ 7孔)，置於37 °C 5%的CO2培養箱中培養。培養 10 14 d，用間接ELISA法進行陽性孔篩選，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行3次有限稀釋克隆化，而後擴大培養，建立雜交瘤細胞株。所製備的雜交瘤細胞染色體數目為96 102條，平均98. 6條，其分泌的單克隆抗體可特異地與IMI反應，親和力常數達到101° 1012，輕鏈亞型為κ或λ，重鏈亞型為IgG^ IgG2a, IgG2b，針對IMI特異抗原決定簇的單克隆抗體。3.山羊抗小鼠IgG抗體的製備
以飽和硫酸銨提取IMI-BSA陰性小鼠血清IgG，即取1份小鼠血清加2份PBS(pH=7. 2) 混勻，加等體積飽和硫酸銨溶液混勻，置4°C冰箱12 h，4 3000 rpm離心15 min，棄上清， 再以適量PBS (pH=7. 2)溶解沉澱，加飽和硫酸銨溶液至終濃度33%，置4 °C條件下2 h， 4 °C >3000 rpm離心15 min，棄上清，以適量PBS (pH=7. 2)溶解沉澱，置4 ！條件下用PBS(pH=7.2)透析48 h，中間換液8次，4 °C >12000 rpm離心15 min，收集上清，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度，以80 Pg/kg體重的小鼠血清IgG經皮下和肌肉注射健康山羊5次， 末次注射10天後，以ELISA測定其血清效價達到1 :2000以上時，心臟或動脈採血，分離收集高免血清，以飽和硫酸銨提取羊抗小鼠IgG抗體，用於IMI快速檢測試劑盒裝配。4.本試劑盒檢測反應原理
當待測樣品溶液加入經包被且經封閉的聚苯乙烯酶標反應板之後，待測溶液與包被抗原(IMI-OVA)競爭性地與IMI-mAb結合，當達到反應平衡後，加入工作濃度的酶標記抗抗體 (GaMIgG-HRP)，反應25 min後，再加入酶反應的底物溶液，通過顯色反應的深淺程度判定殘留樣品中待測抗原的含量是否超標。5.待測樣品溶液的製備及檢測操作步驟測試器具為8X 12孔聚苯乙烯酶標反應板。 檢測試劑盒包含用於比色的標準比色卡。檢測樣品製備檢測多汁液的蔬菜、水果等農產品樣品，可用檢測試劑盒配置的石英砂將待檢樣本粗研，加入提取液稀釋製成1 :2 1 :10的待測樣品懸液；檢測乾燥類穀物等農產品，需要用檢測試劑盒配置的石英砂將待檢樣本細研，再加入提取液稀釋製成1 2 1 10的待測樣品懸液。操作方法將待檢樣品液加入包被好的聚苯乙烯酶標反應板，反應15 min後洗板，再加入工作濃度的RaMIgG-HRP，反應25 min後洗板，然後在酶標反應板中加入酶底物緩衝液，顯然以反應10 min後，與標準比色卡比對，判定檢測結果。結果判定(a)陽性——如果顯色程度低於標準比色卡上的對應值，表示檢測結果為陽性，說明在待測樣品中含有超標量的IMI ;(b)陰性——如果顯色程度高於標準比色卡上的對應值，表示檢測結果為陰性，說明在待測樣品中所含IMI不超標或不含有該待檢農藥。以下表格為本試劑盒基本配置。
權利要求
1.一種快速檢測痕量吡蟲啉殘留的試劑盒，其特徵是含有吡蟲啉包被抗原 AET-IMI-0VA包被並封閉好的96孔酶標反應板，用於研磨植物組織的石英砂，工作濃度的抗吡蟲啉單克隆抗體，工作濃度的酶標記二抗GaMIgG-HRP，底物緩衝液，反應終止液，洗滌緩衝液，工作濃度的陰性血清和用於製作標準曲線的系列濃度的吡蟲啉標準溶液，其中酶標記二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠RaMIgG-HRP ；偶聯IMI人工半抗原的載體蛋白溶液為IMI人工半抗原與載體蛋白偶聯的複合物溶液。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵是偶聯IMI人工半抗原的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白0VA，或匙孔血藍蛋白KLH。
全文摘要
本發明涉及一種農產品中微量吡蟲啉殘留的酶聯免疫檢測試劑盒。它含有包被純化的抗吡蟲啉單克隆抗體、過氧化物酶標記的RaMIgG-HRP、酶反應的底物溶液、反應終止液和殘留樣本預處理材料等。該試劑盒在8.30×10-6mg/mL~5.32×10-4mg/mL的吡蟲啉濃度範圍內與對應的抗體抑制率線性關係良好，採用簡易樣本前處理程序，獲得的殘留檢測樣本中吡蟲啉的添加回收率平均大於87.0%(CV＜10.0%)，方法的最低檢測限為8.00×10-6mg/mL，且與結構類似的常用氯化菸鹼殺蟲劑無交叉反應。該試劑盒為農產品中的殘留吡蟲啉研究提供了有效的檢測手段。抗吡蟲啉抗體為單克隆抗體，偶聯吡蟲啉的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA或雞卵清白蛋白OVA或匙孔血藍蛋白KLH。本發明的試劑盒具有特異性強，靈敏度高，簡便，直觀，準確，適用範圍廣，成本低，易於推廣應用。
文檔編號G01N33/558GK102507930SQ201110347619
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月7日 優先權日2011年11月7日
發明者張海棠, 王自良, 石洪波 申請人:石洪波