用於捕捉幹細胞的生物材料及其製備方法與應用的製作方法

2023-05-07 20:57:31

專利名稱：用於捕捉幹細胞的生物材料及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於捕捉幹細胞的生物材料及其製備方法與應用。
背景技術：
幹細胞是一類具有自我更新能力，且具有多向分化潛能的細胞。通常，組織內的幹細胞處於靜止狀態，一旦組織發生損傷，這些靜止的幹細胞迅速活化並遷移到損傷部位，幫助損傷組織的修復。幹細胞對維持組織的自我平衡及損傷後組織的再生十分重要。因此， 幹細胞被越來越多的應用於多種疾病的治療中，包括大面積創傷或燒傷、心血管類疾病、神經類疾病等，並取得了一定的修復效果，尤其對於心肌、神經等再生能力有限的組織，幹細胞治療無疑為患者帶來了治療的新希望。常用的幹細胞主要有具有全系分化潛能的胚胎幹細胞、多系分化潛能的成體幹細胞，包括骨髓間充質幹細胞及一些組織特異性幹細胞。外源性幹細胞的體內移植是幹細胞治療的主要手段。然而，由於免疫排斥反應，大部分移植的細胞會經歷凋亡或壞死，僅有 5%-8%的外源幹細胞可在移植部位存活。再者，體內組織的微環境往往與體外細胞培養的微環境相距甚遠，不適宜外源幹細胞的增殖與分化，是外源幹細胞的移植效率通常較低的另一大原因。此外，胚胎幹細胞的體內治療還存在倫理道德方面的局限性，這些問題大大阻礙了幹細胞移植在臨床治療上的應用。由此可見利用外源性幹細胞進行損傷組織的修復在短期內還面臨很多問題，而利用自體幹細胞進行修復可以避免上述問題，在短期內有可能實現臨床上的應用。皮膚等再生能力較強的組織發生小面積損傷時，皮膚組織內靜止的幹細胞可自行修復受損的組織，為自體幹細胞修復受損組織提供了一定的理論依據。然而，對於大面積損傷或是再生能力很差的組織，機體自行可動員的幹細胞數量極其有限，並不能有效的修復受損的組織。如何有效引導自體幹細胞參與損傷修復及組織再生是擺在科研人員面前的一大難題。血液循環系統是體內幹細胞的一大儲存庫，其內所含造血幹細胞、骨髓間充質幹細胞及內皮祖細胞等伴隨著血液的流動到達全身各處，這些循環系統內的幹細胞被認為是自體幹細胞治療的潛在的、理想的種子細胞。目前，自體幹細胞治療的研究多集中於此。粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是一種幹細胞動員劑，對造血幹細胞、骨髓間充質幹細胞均具有廣泛的動員效應，被應用於心肌、神經等再生能力差的組織修復過程中。在一些心肌損傷動物模型中，G-CSF注射後可見心肌細胞的增殖及心肌功能的恢復，但是其修復效果一直存在爭議。在臨床心肌梗塞的治療中，G-CSF注射後，心肌再生及功能恢復未見實質性的改善。 究其緣由，雖然G-CSF可動員自體的造血及骨髓間充質幹細胞，但是其動員效應並非特異。 幹細胞被動員後，廣泛分布於各組織內，到達損傷部位的幹細胞數量並未有顯著的提高，且隨著血液的流動這些幹細胞隨時可能被帶走，而並不能特異參與到受損組織的修復與再生過程中。此外，微環境對細胞的增殖分化也非常重要，一系列幹細胞及微環境的相互作用對內源自體幹細胞的命運決定及功能性分化亦是不可或缺的。幹細胞微環境調控的重要手段之一是通過特異的生物材料來調節細胞命運。此外，生物材料被廣泛應用於組織的靶向修復過程中，它們不僅為藥物、細胞的靶向遞送提供載體，同時又能引導組織的三維重建。比如在心肌的損傷修復中，生物材料可代替受損的心肌組織或疤痕組織以引導心肌組織的再生，改善心肌功能。在神經損傷修復中，生物材料亦可承載細胞或特異性生長因子作為靶向修復的有效載體。研究表明，應用於心肌損傷治療的組織工程化心肌補片如細胞外基質(ECM)可在一定程度上改善心肌功能，然而僅有生物材料並不足以誘導細胞的浸潤、增殖及分化，其心肌修復能力也是有限的。而在神經損傷修復中，承載了外源細胞的生物材料移植入體內後，由於細胞仍帶有免疫原性，部分細胞仍會受到機體免疫分子的攻擊。因此，如果能在損傷部位的生物材料上捕捉足夠數量的自體幹細胞必將在很大程度上推進自體幹細胞修復受損心肌組織的應用，因為這既能消除外源幹細胞帶來的免疫排斥反應，另一方面又能克服自體幹細胞治療時損傷部位幹細胞數量不足的問題。抗體可與其抗原特異性結合，這一特性推動了它在靶向治療中的應用，目前大約有300種抗體類藥物被開發，且部分已進入臨床評價階段。在腫瘤治療中，偶聯免疫相關抗原和腫瘤相關抗原的雙向抗體可直接募集免疫效應細胞至腫瘤，並殺死腫瘤細胞。在心血管疾病治療中，偶聯造血幹細胞特異標誌的CD45和心肌特異抗原MLC的雙向抗體可攜帶外源造血幹細胞至心臟並幫助受損心肌的再生。膠原蛋白存在於體內許多組織內，是體內細胞外基質的主要組成成分之一。膠原材料為組織提供機械支撐，維持器官與組織的完整性。此外，膠原是細胞外基質的主要成分，可作為細胞依附、生長的支架，誘導細胞遷移、增殖及分化。Sca-I是Ly-6基因家族的一員，是小鼠造血幹細胞的特異標誌物。有研究表明，骨髓間充質幹細胞、心肌幹細胞、骨骼肌幹細胞等也表達這一標誌物。

發明內容
本發明的目的在於提供一種用於捕捉幹細胞的生物材料的製備方法。本發明提供的用於捕捉幹細胞的生物材料的製備方法，是將膠原材料與Sca-I抗體共價交聯，得到所述用於捕捉幹細胞的生物材料。上述膠原材料為膠原凝膠、脫細胞骨基質膠原材料或膠原膜。上述共價交聯是通過化學交聯劑作用完成的。上述化學交聯劑為Sulfo-SMCC 和 Traut』 s Reagent。上述共價交聯的步驟包括如下I)將Traut』 s Reagent與膠原材料一起反應2小時,獲得膠原-Traut』 s化合物； 將Sulfo-SMCC與Sca-I抗體孵育I小時，獲得抗體-Sulfo-SMCC化合物；2)再將上述步驟I)中獲得的膠原-Traut』 s化合物和抗體-Sulfo-SMCC化合物混合孵育，孵育的時間為O. 5-2小時，優選為I小時，得到所述用於捕捉幹細胞的生物材料。步驟I)中，上述膠原材料、Trautj s Reagent、SuIfo-SMCC和Sca-I抗體為如下
(1)-(3)中任一所述(I)膠原材料為膠原凝膠,膠原凝膠、Trautj s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗體的質量比為 O. 2-0. 4mg O. 2-0. 3mg O. 4-0. 7 μ g 2-3 μ g ；(2)膠原材料為脫細胞骨基質膠原材料，脫細胞骨基質膠原材料、Traut』 sReagent、SuIfo-SMCC 和 Sca-I 抗體的比例為:1 簇:O. 3-0. 6mg I. 5-1. 8 μ g 4-6 μ g ； 所述I簇的規格是20-40mm3,優選是30mm3 ；(3)膠原材料為膠原膜，膠原膜、Traut』 s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗體的比例為1簇O. 3-0. 6mg 3-4 μ g 8-12 μ g，所述I簇的規格是5_15_2，優選是9mm2。其中，上述(I)中Traut』 s Reagent的濃度為2-3mg/ml, Sca-I抗體的濃度為 O. 4-0. 6 μ g/ μ 1，Sulfo-SMCC 的濃度為 O. 4-0. 6mg/ml ；上述⑵中Traut』 s Reagent的濃度為4-6mg/ml, Sca-I抗體的濃度為
O.4-0. 6 μ g/ μ 1，Sulfo-SMCC 的濃度為 O. 4-0. 6mg/ml ；上述(3)中Traut』 s Reagent的濃度為4-6mg/ml, Sca-I抗體的濃度為
O.4-0. 6 μ g/ μ 1，Sulfo-SMCC 的濃度為 O. 4-0. 6mg/ml。上述共價交聯的步驟中各物質的用量和濃度優選為所述⑴中膠原凝膠、Traut』 sReagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗體的質量比為
0.3mg : 0. 25mg : O. 58 μ g : 2. 5 μ g，所述 Traut，s Reagent 的濃度為 2. 5mg/ml, Sca-1 抗體的濃度為0. 5 μ g/ μ I, Sulfo-SMCC的濃度為O. 5mg/ml ；所述(2)中脫細胞骨基質膠原材料、Traut』 s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗體的比例為1 簇0. 5mg : I. 66 μ g : 5 μ g,所述 Traut』 s Reagent 的濃度為 5mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為 O. 5 μ g/ μ I, Sulfo-SMCC 的濃度為 0. 5mg/ml ；所述(3)中膠原膜、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC 和 Sca-1 抗體的比例為1 簇0. 5mg : 3. 32 μ g : 10 μ g,所述 Traut’s Reagent 的濃度為 5mg/ml, Sca_l 抗體的濃度為 O. 5 μ g/ μ 1，Sulfo-SMCC 的濃度為 0. 5mg/ml。上述的Sulfo-SMCC是溶解於一緩衝液中的，該緩衝液的配置方法如下將8g NaCl.O. 2g KCl、I. 44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04 溶於 IL 蒸餾水，然後再將 4mmol 的 EDTA 溶於上述蒸餾水中，最後調pH至7. 2。上述的Traut』 s Reagent是溶解於另一緩衝液中的，該緩衝液的配置方法如下 將 8gNaCl、0. 2g KCl ,1. 44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04 溶於 IL 蒸餾水，然後再將 4mmol 的 EDTA溶於上述蒸餾水中，最後調pH至8. O。上述的Sca-I抗體是溶解於又一緩衝液中的，該緩衝液的配置方法如下將8g NaCl.O. 2g KC1、1. 44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04 溶於 IL 蒸餾水，調 pH 至 7. O。上述製備方法得到的用於捕捉幹細胞的生物材料也屬於本發明的保護範圍。上述本發明方法製備得到的生物材料在製備組織修復材料中的應用也屬於本發明的保護範圍。具體的組織修復材料可以是心肌補片。本發明是根據抗體可與細胞上的特異性抗原結合的特性，提出的一種新的功能性生物材料——偶聯幹細胞特異性抗體的生物材料，以達到體內在特定的損傷部位特異性捕捉自體幹細胞的目的。本發明使用的膠原材料可以為一種免疫原性低、可降解及生物相容性良好的天然生物材料，能夠引導組織再生。本發明通過化學交聯的方法將Sca-I單克隆抗體錨定到膠原材料上。實驗證明通過體外實驗發現交聯有Sca-I抗體的膠原材料可有效捕捉Sca-I 陽性的造血幹細胞，且這種通過抗原抗體相互作用的捕捉方法並不影響幹細胞的分化能力；通過肌肉包埋實驗發現這種交聯了 Sca-I抗體的膠原材料亦可在體內捕捉相當數量的Sca-I陽性細胞；對本發明進行了功能性評價，將這種交聯有Sca-I抗體的膠原材料作為心肌補片應用於心肌修復實驗中，手術90天後可觀察到明顯的心肌再生且伴隨著心肌功能的恢復，取得了良好的修復的效果。由於血液循環系統遍及全身，因此本發明的生物材料不僅可應用於心肌組織的修補，還可應用於其它組織的損傷修復，如血供豐富的腦、肝臟、腎臟、皮膚、骨組織等。所以本發明的生物材料在組織器官損傷修復中有著重要的應用價值。


圖I為本發明實施例I使用的交聯反應的示意圖。圖2為本發明的生物材料捕捉幹細胞示意圖。圖3為不同處理下抗體在膠原材料上的存留量，圖中A，膠原為膠原凝膠時的結果；B，膠原為DBM膠原材料時的結果；C，膠原為膠原膜時的結果；C/PBS表示單純膠原組； C/Sca-Ι表示膠原和Sca-I抗體簡單吸附；CXBSA表示膠原和BSA蛋白共價交聯；CXSca_l 表示膠原和Sca-I抗體共價交聯。圖4為交聯Sca-I抗體的膠原凝膠體外捕捉Sca-I陽性細胞及鑑定，圖中A :交聯Sca-I抗體的膠原凝膠體外可捕捉大量細胞；圖中C/PBS :單純膠原組；C/Sca-1 :膠原/ Sca-I抗體簡單吸附；CXBSA :膠原/BSA蛋白共價交聯；CXSca_l :膠原/Sca-I抗體共價交聯；B :克隆形成實驗；C :流式分選結果。圖5為肌肉包埋實驗驗證交聯Sca-I抗體的膠原材料在體內具有捕捉幹細胞的能力，圖中CXBSA :膠原/BSA蛋白共價交聯；CXSca-l :膠原/Sca-I抗體共價交聯。圖6為手術4周後小鼠心肌修復的病理學檢測分析，圖中A，膠原和BSA交聯組的 HE染色；B，膠原和Sca-I抗體交聯組的HE染色；C，膠原和BSA交聯組的細胞數目；D，膠原和Sca-I抗體交聯組的細胞數目；E，膠原和BSA交聯組的血管數目；F，膠原和Sca-I抗體交聯組的血管數目；G，細胞數目統計；H，血管數目統計，G、H中CXBSA表示膠原/BSA蛋白共價交聯；CXSca-I表示膠原/Sca-I抗體共價交聯。圖7為手術12周後小鼠心肌修復的病理學及功能學檢測分析，圖中A，膠原和BSA 交聯組的HE染色；B，膠原和Sca-I抗體交聯組的HE染色；C，膠原和BSA交聯組的細胞數目；D，膠原和Sca-I抗體交聯組的細胞數目；E、G，膠原和BSA交聯組的肌纖維染色；F、H，膠原和Sca-I抗體交聯組的肌纖維染色；1，細胞數目統計；J，肌纖維陽性率的統計；K，超聲心動射血分數統計山，超聲心動縮短分數統計。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例I、用於捕捉幹細胞的生物材料的製備I、化學交聯劑準備和共價交聯原理本實施例中選用的化學交聯劑是2-亞氨基噻吩(Traut’s Reagent,購自Sigma公司)和璜基琥珀醯亞胺4-[N-甲基馬來酸]-I-羧環乙烷(Sulfo-SMCC，購自Sigma公司)。共價交聯作用的原理通過共價交聯的方法用交聯劑2-亞氨基噻吩(Traut’sReagent)和璜基琥珀醯亞胺4_[N_甲基馬來酸]_1_羧環乙烷(Sulfo-SMCC)將細胞特異的抗體固定在膠原材料上，從而在體外和體內捕捉幹細胞。其中Traut』 s Reagent 是一種環形的交聯劑，可與膠原分子中N末端的氨基(-NH2)發生反應，將巰基(-SH2)基團添加到膠原分子上；而Sulfo-SMCC是一種雙功能交聯劑，分子兩端分別含有羥基琥珀醯亞胺基(N-hydroxysuccinimide ester group, NHS)和馬來酸亞胺基(maleimide group), Sulfo-SMCC中的NHS可與氨基(-NH2)反應，而Sulfo-SMCC中的馬來醯亞胺基可與巰基 (-SH)反應。本實施例中，Sulfo-SMCC通過一端的NHS基團與Sca-I抗體的氨基反應與抗體相連，而另一端的馬來醯亞胺基團則可與含有巰基(-SH)基團的膠原分子反應，將Sca-I 抗體與膠原分子共價交聯在一起(如圖I所示)。其生物材料捕捉幹細胞的狀態如圖2所示，A為未進行共價交聯幹細胞特異性抗體的膠原材料捕捉幹細胞的情況，B為本發明共價交聯了幹細胞特異性抗體的生物材料捕捉幹細胞的情況。本實施例中①Traut』 s Reagent :採用pH 8. O,含4mM EDTA的PBS緩衝液(配置方法如下將 8g NaCl.O. 2g KCl、1.44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04 溶於 IL 蒸餾水， 然後再將4mmol的EDTA溶於上述蒸餾水中，最後調pH至8. 0)溶解，取2. 5mg和5mg的 Traut』 sReagent 分別溶於 Iml pH 8. O,EDTA 4mM PBS 緩衝液中，得到 2. 5mg/ml 和 5mg/ml 的Traut，s試劑。②Sulfo-SMCC :採用pH 7. 2，含4mM EDTA的PBS緩衝液(配置方法如下將8g NaCl.O. 2g KCl、1.44g Na2HP04和0. 24g KH2P04溶於 IL蒸餾水，然後再將4mmol 的EDTA溶於上述蒸餾水中，最後調PH至7. 2)溶解，取2mg的Sulfo-SMCC溶於4ml pH 7. 2,EDTA4mM PBS緩衝液，得到O. 5mg/ml的Sulfo-SMCC試劑。③Sca-I抗體購自RD公司(MAB1226)，500 μ g溶於Iml PBS緩衝液(配置方法如下將 8g NaCl.O. 2g KCl、1.44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04 溶於 IL 蒸餾水，調 pH至 7· 0) 使其終濃度為0. 5 μ g/ μ I。2、用於捕捉幹細胞的生物材料的獲得本實施例中設置了 3組實驗，分別製備3種生物材料，該生物材料分別是膠原凝膠XSca-I抗體材料(即膠原凝膠與Sca-I抗體共價交聯的生物材料)、DBMXSca-I抗體材料(即DBM膠原材料與Sca-I抗體共價交聯的生物材料)和膠原膜XSca-I抗體材料 (即膠原膜與Sca-I抗體共價交聯的生物材料)。每組實驗做3次平行，3組實驗材料分別安排如下(I)膠原凝膠X Sca-I組實驗所用的膠原凝膠由100 μ I，3mg/ml的I型膠原鋪 96孔板吹乾而得到，其中I型膠原由鼠尾提取經2M/L醋酸溶解得到(製備方法如下取新鮮大鼠尾，洗淨，在酒精中浸泡15分鐘消毒。將鼠尾用剪刀分成大約2cm的若干段。將鼠尾腱擠出，放於蒸餾水中，避免風乾。用PBS (pH =7. 0-7. 5,1. 5M NaCl)浸泡尾腱，4度處理 2天，換液4-6次。用預冷的2mol/L乙酸浸泡，體積根據最終需要的濃度掌握。4°C酸抽提 2天，4°C離心，2000g 10分鐘。上清即為鼠尾膠原。)。Traut』 s 試劑的濃度為 2. 5mg/ml,每個反應取 100 μ I ； SuIfo-SMCC 的濃度為0. 5mg/ml,每個反應取I. 16 μ ;Sca_l抗體濃度為0. 5yg/yl,每個反應取5μ I。即膠原凝膠、Traut』 s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗體的質量比為
0.3mg : 0. 25mg : 0. 58 μ g : 2. 5 μ g。
(2) DBMX Sca-I組膠原材料採用脫細胞骨基質膠原材料(DBM膠原材料)(購自山東正海生物有限公司)，經Co6ci滅菌，用量為I簇，規格是5X3X2mm，即30mm3 Jrauf s 試劑的濃度為5mg/ml，每個反應取100 μ I ；SuIfo-SMCC的濃度為O. 5mg/ml,每個反應取
3.32 μ I ；Sca-l抗體濃度為O. 5 μ g/μ 1，每個反應取10 μ I。即脫細胞骨基質膠原材料、 Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC 和 Sca-1 抗體的比例為I 族O. 5mg : I. 66 μ g : 5 μ go(3)膠原膜XSca-I組膠原材料採用膠原膜(購自山東正海生物有限公司， I簇的規格是3X3mm,即9mm2),經Co6°滅菌；Traut』 s試劑的濃度為5mg/ml,每個反應取 100 μ I ；SuIfo-SMCC 的濃度為 O. 5mg/ml，每個反應取 6. 64 μ I ;Sca_l 抗體濃度為 O. 5 μ g/ μ 1，每個反應取20 μ I。即膠原膜、Traut’s Reagent、Sulfo_SMCC和Sca-1抗體的比例為 I 簇O. 5mg 3. 32μ g 10 μ g。按上述3組實驗安排的膠原材料、化學交聯劑的濃度以及Sca-I抗體的用量進行製備上述三種生物材料，具體步驟如下I)取Traut』 s試劑與膠原材料於室溫反應2小時，生成膠原-Traut』 s化合物； 同時取Sulfo-SMCC試劑與Sca-I抗體孵育I小時，生成抗體-Sulfo-SMCC化合物。2)然後將上述步驟I)中得到的膠原-Traut』 s化合物和抗體-Sulfo-SMCC化合物混合於室溫孵育I小時，將Sca-I抗體共價交聯到膠原材料上，即得到本發明的用於捕捉幹細胞的生物材料。通過Elisa檢測製備得到的三種生物材料(膠原凝膠XSca-I抗體材料、DBMX 抗體材料和膠原膜X Sca-I抗體材料)中Sca-I抗體共價交聯到膠原材料上的效率。具體方法為Sca-I抗體固定到材料後，5% BSA溶液(購自Sigma公司)室溫孵育I小時。加入 100 μ I抗大鼠鹼性磷酸酶二抗(PBS緩衝液I : 20000稀釋)(購自Sigma公司)室溫孵育 I小時後PBS緩衝液清洗3次，加入溶於鹼性磷酸酶緩衝液(IOOmM Tris-HCl ； IOOmM NaCl ； IOmM MgCl2, pH 9. 6)的2mg/ml的顯色底物對氧磷(p-NPP,購自Ameresco公司)進行顯色。酶標儀0D405nm進行讀數，分別檢測了不同處理下抗體在膠原材料上的存留量。針對每種生物材料設置以下3個對照單純膠原組(C/PBS):膠原凝膠、DBM膠原材料、膠原膜分別在室溫下浸泡於PBS緩衝液中I小時。膠原材料簡單吸附Sca-I抗體組(C/Sca_l):膠原凝膠室溫下浸泡於含有
2.5 μ gSca-1抗體溶液中I小時；DBM膠原材料室溫下浸泡於含有5 μ g Sca-I抗體溶液中 I小時；膠原膜室溫下浸泡於含有10 μ g Sca-I抗體溶液中I小時。膠原XBSA蛋白材料(CXBSA):取Traut’s試劑與各個膠原材料(膠原凝膠、DBM 膠原材料或膠原膜)於室溫反應2小時，生成膠原-Traut’s化合物；同時取Sulf0-SMCC試劑與和Sca-I抗體等摩爾數的BSA孵育I小時，生成抗體-Sulf0-SMCC化合物。然後將膠原-Traut』 s化合物和BSA蛋白-Sulfo-SMCC化合物混合於室溫孵育I小時，將BSA蛋白共價交聯到膠原材料上。其中，當膠原材料為膠原凝膠時，除BSA以外的各物質用量與上述
(I)膠原凝膠XSca-I組中的用量相同，BSA用量與(I)組中Sca-I抗體用量等摩爾；當膠原材料為DBM膠原材料時，除BSA以外的各物質用量與上述(2)DBMXSca-I組中的用量相同，BSA用量與(2)組Sca-I抗體等摩爾；當膠原材料為膠原膜時，除BSA以外的各物質用量與上述(3)膠原膜XSca-I組中的用量相同，BSA用量與(3)組中Sca-I抗體等摩爾。
結果如圖3所示，共價交聯後Sca-I抗體在各類膠原材料上存留顯著高於其它各組，可見共價交聯能夠有效的將抗體固定在膠原材料上。實施例2、用於捕捉幹細胞的生物材料的功能檢測一、體外實驗在體外驗證固定有Sca-I抗體的膠原材料是否具有捕捉Sca-I陽性細胞的能力。 由於C57BL/6小鼠的骨髓腔是Sca-I陽性細胞的聚集處，可在體外分離C57BL/6的骨髓腔中的細胞，本實施例中具體採用C57BL/6小鼠全骨髓細胞，將C57BL/6小鼠全骨髓細胞加到功能材料上以驗證體外情況下功能材料捕捉幹細胞的能力。本實驗所用的生物材料是膠原凝膠XSca-I抗體材料；同時以上述的C/PBS、C/ Sca-I和CXBSA為對照。具體實驗如下將5%牛血清白蛋白(BSA)室溫孵育I小時，同時製備C57BL/6小鼠全骨髓細胞， 用含22號針頭的注射器將骨髓從C57BL/6小鼠的後腿的股骨和脛骨中衝出，隨後用紅細胞裂解液(1.5M NH4C1 UOOnM KHC03、10nM Na4EDTA)去除紅細胞，得到C57BL/6小鼠全骨髓細胞。BSA孵育材料完畢後，將IO5ceIls/孔的全骨髓細胞加入至不同處理的膠原凝膠(膠原凝膠XSca-I抗體材料、C/PBS、C/Sca-1或CXBSA)上，室溫搖床孵育30分鐘，去除細胞懸液，PBS清洗3次。用O. 2%膠原酶將滯留在凝膠上的細胞消化下來，進行克隆形成實驗並進行流式細胞儀分析。實驗結果如圖4所示，在體外，交聯了 Sca-I抗體的膠原凝膠(即膠原凝膠XSca-I抗體材料)可富集大量細胞，而單純膠原組(C/PBS)、膠原材料簡單吸附Sca-I 抗體組(C/Sca-Ι)及BSA蛋白/膠原材料共價交聯蛋白組(CXBSA)細胞零星分布，說明對照組並不具有富集細胞的能力。隨後，將滯留在Sca-I抗體共價交聯膠原凝膠上的細胞進行了克隆形成率實驗，發現這些細胞具有多向分化潛能，能夠分化為紅細胞系集落形成單位(CFU-E)、紅細胞裂解形成單位(BFU-E)、粒細胞巨噬細胞集落形成單位(CFU-GM)、粒細胞-幼紅細胞-單核細胞-巨核細胞集落形成單位(CFU-GEMM)等克隆，而單純的全骨髓細胞主要形成CFU-GM。流式細胞儀分析結果，如圖4中C所示，Sca-I抗體共價交聯膠原組的細胞Sca-I的陽性率為69. 2±6. 5，而未分選的細胞陽性率為14. 5±1. 3，兩者具有極其顯著差。二、體內驗證在上述步驟一中的體外實驗驗證了共價交聯Sca-I抗體的膠原材料具有捕捉 Sca-I陽性細胞的能力之後，本步驟二中進一步進行了體內驗證。具體為首先，採用肌肉包埋的方法驗證本發明的生物材料在體內是否具有捕捉幹細胞的能力，隨後，將本發明的生物材料以心肌補片的形式移植入小鼠心臟以驗證其在心肌損傷上的修復效果。I、肌肉包埋實驗取5X3X2mm的DBM膠原材料經Co60滅菌，將Sca-1抗體及與Sca-1抗體等量的BSA蛋白經交聯反應錨定在DBM膠原材料上，構成DBMXSca-I抗體材料和DBMX BSA蛋白材料(CXBSA)對照。將C57BL/6小鼠大腿肌肉進行橫斷，破壞其動脈，隨後將製備好的 DBMXSca-I抗體材料或CXBSA對照移植入小鼠大腿肌肉內。48小時後，將移植後的膠原支架取出，膠原酶消化後進行流式細胞儀分析。實驗結果如圖5所示，DBMXSca-I抗體材料包埋入C56/BL6小鼠肌肉內2天後，膠原酶消化獲得細胞。流式細胞儀分析結果，顯示DBMX Sca-I抗體材料內Sca-I幹細胞陽性率為11. 96±1. 62，而CXBSA對照膠原內Sca-I幹細胞陽性率為3. 59±1. 01，具有極顯
著性差異。2、心肌補片實驗取3X3mm的膠原膜經Co6°滅菌，將Sca-I抗體及與Sca-I抗體等量的BSA蛋白經交聯反應分別錨定在膠原膜上，構成膠原膜XSca-I抗體材料和膠原膜XBSA蛋白材料。將C57/BL6小鼠麻醉後，進行開胸手術。待心臟暴露後，在無血管左心室壁上切除 2X2. 5X0. 5mm心肌組織，將本發明生物材料(膠原膜XSca-I抗體材料或膠原膜XBSA蛋白材料對照)分別作為心肌補片縫合在傷口部位。手術後30天、90天取材進行病理學切片分析，手術後90天進行超聲心動功能分析。實驗結果如圖6和圖7所示，在小鼠心肌補片手術4、12周後，將包埋有材料的心臟取出並進行一系列病理學及功能學檢測分析。結果顯示，手術4周後，膠原Sca-I抗體交聯組中膠原已出現轉型重構(remodeling)，膠原纖維排列有序，而膠原BSA交聯組中膠原排列雜亂無章。且膠原Sca-I抗體交聯組中材料內浸潤的細胞數目明顯多於膠原BSA交聯組，具有顯著性差異。此外，我們還檢測了材料內血管網絡的重建，發現膠原Sca-I抗體交聯組中材料內的血管數目亦顯著多於膠原BSA交聯組(如圖5所示)。手術12周後，膠原 Sca-I抗體交聯組中膠原材料排列已完全降解，其排列與正常心肌組織類似，且出現心肌細胞的再生。而膠原BSA交聯組中膠原材料仍未全部降解，其排列雜亂無章，且幾乎未見心肌細胞的再生。同時，我們通過超聲心動檢測了心臟功能。膠原Sca-I抗體交聯組中，小鼠的左心室射血分數及縮短分數均高於膠原BSA交聯組(如圖7所示)。綜上，幹細胞特異性抗體Sca-I抗體通過共價交聯的方法錨定在膠原材料上，得到的本發明的生物材料，無論在體外實驗還是體內實驗中均可捕捉足夠數量的Sca-I陽性幹細胞，且並不影響幹細胞的活性。當該功能性膠原材料移植入受損心肌部位，手術90天後可觀察到明顯的心肌再生且伴隨著心肌功能的恢復。
權利要求
1.用於捕捉幹細胞的生物材料的製備方法，是將膠原材料與Sca-I抗體共價交聯，得到所述用於捕捉幹細胞的生物材料。
2.如權利要求I所述的製備方法，其特徵在於所述膠原材料為膠原凝膠、脫細胞骨基質膠原材料或膠原膜。
3.如權利要求I或2所述的製備方法，其特徵在於所述共價交聯是通過化學交聯劑作用完成的。
4.如權利要求3所述的製備方法，其特徵在於所述化學交聯劑為Sulfo-SMCC和 Traut』 s Reagent。
5.如權利要求1-4中任一所述的製備方法，其特徵在於所述共價交聯的步驟包括如下1)將所述Traut』 s Reagent與所述膠原材料一起反應2小時,獲得膠原-Traut 』 s化合物；將所述Sulfo-SMCC與所述Sca-I抗體孵育I小時，獲得抗體-Sulf0-SMCC化合物；2)再將上述步驟I)中獲得的膠原-Traut』 s化合物和抗體-Sulfo-SMCC化合物混合孵育，所述孵育的時間為0. 5-2小時，優選為I小時，得到所述用於捕捉幹細胞的生物材料。
6.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於步驟I)中，所述膠原材料、 Trautj sReagent、Sulfo-SMCC 和 Sca-I 抗體為如下(1)-(3)中任一所述(1)膠原材料為膠原凝膠，膠原凝膠、Trautjs Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-I抗體的質量比為 0. 2-0. 4mg : 0. 2-0. 3mg : 0. 4-0. 7 u g ； 2-3 u g ；(2)膠原材料為脫細胞骨基質膠原材料，脫細胞骨基質膠原材料、Traufs Reagent、 Sulfo-SMCC 和 Sca-I 抗體的比例為:1 簇:0. 3-0. 6mg I. 5-1. 8u g 4-6 u g ;所述 I 簇的規格是20-40mm3,優選是30mm3 ；(3)膠原材料為膠原膜，膠原膜、Traufs Reagent、Sulf0-SMCC和Sca-I抗體的比例為1 簇0.3-0.6mg 3-4 u g 8-12 y g，所述 I 簇的規格是 5_15mm2，優選是 9mm2。
7.如權利要求6所述的製備方法,其特徵在於所述(I)中Traut’s Reagent的濃度為 2_3mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為 0. 4-0. 6 u g/ u I, Sulfo-SMCC 的濃度為 0. 4-0. 6mg/ml ；所述(2)中 Traut』 s Reagent 的濃度為 4_6mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為 0. 4-0. 6 u g/ U 1，Sulfo-SMCC 的濃度為 0. 4-0. 6mg/ml ；所述(3)中 Traut』 s Reagent 的濃度為 4_6mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為 0. 4-0. 6 u g/ U 1，Sulfo-SMCC 的濃度為 0. 4-0. 6mg/ml。
8.如權利要求6或7所述的製備方法，其特徵在於所述⑴中膠原凝膠、Traut』 sReagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗體的質量比為 0. 3mg : 0. 25mg : 0. 58 u g : 2. 5 u g,所述 Traut』 s Reagent 的濃度為 2. 5mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為0. 5U g/u I, Sulfo-SMCC的濃度為0. 5mg/ml ；所述(2)中脫細胞骨基質膠原材料、Traut』 s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-I抗體的比例為1 族0. 5mg : I. 66 u g : 5 y g,所述 Traut』 s Reagent 的濃度為 5mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為0. 5U g/u I, Sulfo-SMCC的濃度為0. 5mg/ml ；所述⑶中膠原膜、Traut』 s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-I抗體的比例為1 簇0. 5mg : 3. 32 u g : 10 y g,所述 Traut’s Reagent 的濃度為 5mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為 0. 5u g/u I, Sulfo-SMCC 的濃度為 0. 5mg/ml。
9.權利要求1-8中任一所述製備方法得到的用於捕捉幹細胞的生物材料。
10.權利要求9所述的生物材料在製備組織修復材料中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種用於捕捉幹細胞的生物材料及其製備方法與應用。本發明提供的方法是將膠原材料與Sca-1抗體共價交聯，得到所述用於捕捉幹細胞的生物材料。本發明是根據抗體可與細胞上的特異性抗原結合的特性，提出的一種新的功能性生物材料-偶聯幹細胞特異性抗體的生物材料，以達到體內在特定的損傷部位特異性捕捉自體幹細胞的目的。本發明的生物材料不僅可應用於心肌組織的修補，還可應用於其它組織的損傷修復，如血供豐富的腦、肝臟、腎臟、皮膚、骨組織等。因此本發明的生物材料在組織器官損傷修復中有著重要的應用價值。
文檔編號A61L27/24GK102600505SQ20111002609
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月24日 優先權日2011年1月24日
發明者戴建武, 施春英, 肖志峰, 趙燕南, 陳冰 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所