細胞保存方法和細胞運輸方法

2023-05-07 17:24:26

專利名稱：細胞保存方法和細胞運輸方法
技術領域：
本發明涉及保存活細胞的細胞保存方法和細胞運輸方法。
背景技術：
將從組織分離出的細胞用於試驗、檢驗的方法，是生物技術相關領域中不可欠缺的方法。其廣泛用於疾病、病情的診斷、新藥的探索和藥效的判定、或者動物檢驗、植物檢驗、環境汙染物質的試驗等。因此，在生物技術領域中使用的細胞類別極其多樣化。分離得到的細胞也有直接用於試驗的情況，但多數情況下是在培養皿或試管中進行細胞培養。使用該培養細胞，進行各種檢驗。對於用於細胞培養試驗的細胞培養株，要求其表現與在生物體內的試驗、即所謂體內(in vivo)試驗同樣的藥物感受性、毒性反應。即， 需要在細胞培養容器的表面能夠構築有規則性地排列的細胞間的網絡。另外，由於在細胞培養試驗中使用的細胞培養株極為昂貴，因此期望提高細胞的生存率和增殖速度。上述細胞培養試驗是在同一條件下，以將評價的藥物等的量、濃度等為變量，測定其效果。因此，細胞培養容器的材質、形狀等也需要相同。作為該細胞培養容器，一般使用塑料制平皿、玻璃制平皿、固定在容器內的玻璃板、孔板等。孔板有6孔、12孔、48孔、96孔的各板或平皿。它們一般與整個板的大小几乎相同，孔數越大，1個孔的尺寸越小。該1個孔相當於1個培養皿。另外，由於最近的微量化的趨勢，因此也開始使用包含更小口徑且多量的培養皿的384孔板。這些培養皿的底部是平坦的平板狀，使用該底面作為培養面。但是，在組織細胞的培養中，如果使用現有的細胞培養容器，則細胞薄薄地鋪展， 形成沒有方向性的形態。另外，由於在細胞培養容器的表面無規則地配置，因此細胞間的網絡複雜地交織而形成。因此，存在不能重現在生物體內的細胞功能的問題。例如，不能形成在肝細胞中維持肝功能的已知的球體狀的肝細胞團。為了解決上述問題，公開了在平板狀的培養面將特殊的高分子固定化的方法(參考專利文獻1)、使用特殊的裝置的方法(參考專利文獻2)、在高分子凝膠中進行培養的方法(參考專利文獻3)等。但是，在專利文獻1記載的方法中，存在固定化方法繁雜、不能穩定地製造、且成本高的問題。另外，在專利文獻2記載的方法中，無論培養方法的複雜，仍存在細胞團的形成效率差，成本高等的問題。在專利文獻3的方法中，有不能控制細胞團的大小、另外基板的操作性繁雜等的問題。這樣，這些方法都繁雜，不能穩定地製造，且成本高。專利文獻1:日本專利第3177610號公報專利文獻2:日本特開平7-79772號公報
專利文獻3:日本特開平8-308562號公報。

發明內容
從生物體分離的活細胞期望在與生物體同樣的環境下保存。例如，當保存非冷凍的肝細胞時，在平面狀的培養板粘附肝細胞，裝滿培養基，置於保溫(例如25 37°C )狀態下進行保存。但是，當在平面上培養細胞時，與生物體內的環境大為不同，因此存在使細胞具有的原本的功能喪失的問題。另外，由於培養中或保存中的環境要素、例如振動、溫度、CO2 濃度(培養基的PH的變化)等，有細胞的功能進一步降低這樣的問題。另外，如果用專利文獻1或專利文獻2公開的方法保存培養的細胞，則在發生振動等時，有由細胞的剝離或凝膠的損壞導致細胞凋亡等的擔心。因此，難以在維持活細胞的三維結構體的狀態下直接保存而運輸，難以在離開分離位置的位置利用。另一方面，從組織分離細胞的機制與進行試驗、檢驗的機制有許多不同，因而期望在不降低分離的細胞 的功能的情況下進行保存、運輸。本發明是為了解決這種問題而作出的發明，其目的在於提供在維持細胞功能的狀態下保存活細胞的細胞保存方法和細胞運輸方法。本發明的細胞保存方法的一種方式是使用具有多個微空間的細胞培養容器來保存活細胞的細胞保存方法，使活細胞粘附在上述多個微空間的表面來進行培養，在上述培養後，將培養基向上述細胞培養容器注入，以覆蓋上述多個微空間，將上述細胞培養容器密封，以使培養基不漏出，進行保存。在微空間的表面粘附活細胞，使用適於培養的微空間進行培養，在各微容器內形成三維結構體，利用微容器隔離三維結構體後，進行密封並保存， 由此能夠以維持功能的狀態保存活細胞。另外，上述細胞培養容器優選保持在4°C以上且小於37°C的溫度、來保存上述活細胞。進一步地，優選進行培養，以使粘附於上述表面、且在各微空間的空間內形成的三維結構體的細胞群體形成被隔離的細胞數。通過使用微空間，可以防止在各微空間培養的活細胞與其他微空間的活細胞接觸。上述多個微空間優選底部面積為0. 0Γ0. 1mm2、深度為25 150 μ m,另外，上述活細胞是肝細胞、胰β細胞、心肌細胞、神經細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、組織幹細胞、ES細胞和iPS細胞中的任一者，或者更優選由組織幹細胞、ES細胞和iPS細胞中的任一者分化的、肝細胞、胰β細胞、心肌細胞、神經細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、和骨細胞中
的任一者。更優選在上述培養後，除去非粘附細胞後將上述培養基向上述細胞培養容器注入，上述活細胞的培養優選在使活細胞粘附並培養後，可以進一步進行培養，使其增殖、鋪展或者聚集。更優選以IX IiTlX IO6細胞/cm2的細胞接種密度將活細胞接種到上述多個微空間中，更優選細胞接種密度為IX IiTlX IO6細胞/cm2。在上述多個微空間中，優選形成活細胞集聚的細胞團，更優選上述細胞團的直徑為3(Γ200μπι。上述培養基更優選下述情況中的至少一種，S卩，含有血清、增殖因子和血中成分中的至少一種，和使用可透過氧或二氧化碳的膜來密封上述細胞培養容器。另外，本發明的細胞運輸方法的一種方式是將活細胞保存在具有多個微空間的細胞培養容器中並運輸的細胞運輸方法。該運輸方法首先使活細胞粘附在上述多個微空間的表面來培養。上述培養後，將培養基向上述細胞培養容器注入，以覆蓋上述多個微空間。然後，將上述細胞培養容器密封，以使培養基不漏出。並且，使用車輛、船舶或者航空器中的任一種運輸裝置將密封的上述細胞培養容器進行運輸。利用該細胞運輸方法，能夠以維持活細胞的功能的狀態進行運輸。另外，上述細胞培養容器優選保持在4°C以上且小於37°C的溫度。根據本發明，可以提供以維持細胞功能的狀態保存活細胞的細胞保存方法和細胞運輸方法。


圖1是表示實施方式的細胞培養容器的構成的平面圖。圖2是表示實施方式的細胞培養容器的構成的II-II截面圖。圖3是表示實施方式的細胞培養容器的其他的構成的平面圖。圖4是表示實施方式的細胞培養容器的其他的構成的IV-IV截面圖。圖5是表示實施方式的細胞培養容器的進而其他的構成的平面圖。圖6是表示實施方式的細胞培養容器的進而其他的構成的VI-VI截面圖。 圖7是表示使用圖5和圖6所示的細胞培養容器培養細胞並進行密封的狀態例的圖。圖8A是表示實施例06的結果的照片。圖8B是表示實施例07的結果的照片。符號說明 10,20細胞培養容器 11微容器
12側壁 13開口部 23處所(7水° 7卜)
24處所的側壁 30密封裝置 40活細胞 50培養基。
具體實施例方式本發明的細胞保存方法的一種方式是，使用適於活細胞培養的細胞培養容器，使活細胞粘附於微容器進行培養，在微容器內形成三維結構體，培養後在細胞培養容器中裝滿培養基進行保存。微容器使活細胞的三維結構體形成、另外維持其結構。另外，微容器將在內部形成的活細胞的三維結構體與其他的活細胞的三維結構體隔離。因此，培養活細胞的微容器需要使用合適的微容器。用於該保存的細胞培養容器例如可以使用以下的容器。在細胞培養容器中形成凹凸格局、即多個微容器。由此，可以進行與生物體內同樣的立體性的細胞生長，而且在各微容器內，可無差異地使細胞以聚集的形態培養。另外，對於微容器，例如通過將使微容器分隔的側壁(凸部)的高度最優化，可以將聚集的活細胞 (例如肝細胞團)僅在微容器內培養。其中，微空間是通過微容器形成的空間，更具體地，是指通過在平面上形成的凹凸格局而形成的空間。在以下的說明中，微容器和微空間沒有特別地區分。由側壁圍住的微容器的尺寸需要是用於培養細胞的最佳範圍。如果微容器的底部面積過於大，則與在平板上的培養同樣，細胞淺淺地鋪展，不能形成立體結構。另一方面，如果微容器的底部面積過小，則不能收納細胞。因此，空間的尺寸根據培養的細胞種類，優選是可收納一個或多個的範圍。例如，當形成多個細胞集聚的肝細胞團時，優選為可收納該肝細胞團的範圍。為了不使在微容器中培養的細胞向相鄰的微容器轉移，側壁的高度需要為最佳的範圍。如果側壁的高度過低，則細胞越過側壁，不適於培養。如果側壁的高度過高，則難以製作，而且物質擴散變難，培養環境惡化。因此，側壁的高度根據細胞種類，優選是將配置在微容器內的培養細胞在該微容器內穩定地持續培養的範圍。另外，通過形成在側壁設置開口部、將多個微容器連通的結構，可以高效地向細胞供給氧或營養成分以及從細胞中除去廢物。應予說明，根據培養的細胞種類，適當設定側壁的高度、微容器尺寸、開口部的寬度，由此也可以適用於多種的培養體系。另外，本說明書中，活細胞是指從生物體組織分離出的細胞(原代培養細胞)的未經傳代的細胞。另外，活細胞含有冷凍細胞和新鮮細胞這2種。另外，含有所有的株化細胞、 其他的ES細胞(Enbryonic Stem Cells)等。新鮮細胞是指原代培養細胞未經冷凍過的細胞。實施方式
以下，對於本發明的實施方式進行說明。其中，本發明不應限於以下實施方式。另外， 為了清楚地說明，以下的記載和圖適當地進行簡略化。首先對於在實施方式的細胞保存方法中使用的細胞培養容器進行說明，接著對於細胞保存方法進行說明。首先使用圖1、2說明細胞培養容器的構成例。圖1是表示本實施方式的細胞培養容器的構成的平面圖，圖2是圖1的II-II截面圖。如圖1所示，細胞培養容器10具備微容器11、側壁12、開口部13。在細胞培養容器10的培養面，多個側壁形成為網眼狀，被該側壁12包圍四周的空間形成了微容器11。另外，在各微容器11的四邊形成的側壁12的各邊的中央部，形成開口部13。圖1中，表示了微容器11的底部的寬度a、用於劃分微容器11的側壁12的寬度b、 高度c、用於使相鄰的微容器11相互連通的開口部13的寬度d。本發明的底部面積是指， 在與微容器開口水平面(與側壁12上面為同一面)垂直的方向上、從上方向容器底部照射平行光時的投影面積。例如，當微容器的底部為U字形狀時，從與其開口面為垂直方向的上方射向底部的平行光所投影的形狀形成底部面積。對於投影底部的長徑和短徑，當為圓和橢圓時，將通過其重心的長軸和短軸與圓周的交點在各軸上的距離作為長徑和短徑，當為多角形時，是指與該多角形的面積之差最小且通過各頂點的外接圓或外接橢圓的長徑和短徑，當不能描繪通過各頂點的外接圓或外接橢圓時，是指通過最多頂點的近似圓或橢圓的長徑和短徑。微容器11的底部形狀沒有特別地限定，除了正方形、圓、多角形以外還可以採用多種形狀。在再現在生物體內的肝功能的細胞培養中，該底部面積優選為0.01mm2 0.1mm2。另外，優選底部的長徑為短徑的1 1.5倍。進一步地，優選為等方的形狀，如果是正方形，則例如形成當量直徑為100 μ m的肝細胞團時，優選一邊的長度為100 μ m 300 μ Hlo微容器11的水平面與側壁12形成的角度必須是使細胞不越上(乗」上(f )的角度，因此優選從側面的上部起50%以上的部分為80° 90°，特別優選85° 90°。側壁12的高度c只要不使在微容器11中培養的細胞越上並向相鄰的微容器11 轉移即可，例如當形成當量直徑為100 μ m的肝細胞團時，優選為50 μ m 150 μ m。用於使相鄰的微容器11相互連通的開口部13的寬度d，只要是使培養細胞不能從最初接種的微容器11向相鄰的微容器11轉移的程度即可。例如，如果培養細胞的當量直徑為20 μ m,則優選為5 15 μ m。應予說明，開口部13不是必須的，如圖3和圖4所示，微容器11的四邊也可以被側壁12完全地圍住。其中，圖3是表示本實施方式的其他的細胞培養容器的構成的平面圖，圖4是圖3的IV-IV截面圖。另外，如圖5和圖6所示的那樣，本實施方式的細胞培養容器也可以具有包含預定數的多個微容器的、被劃分的處所。其中，圖5是表示本實施方式的進而其他的細胞培養部的構成的平面圖，圖6是圖5的VI-VI截面圖。在圖5和圖6中，表示使用圖3和圖4所示的微容器的結構的例子。圖5中，表示劃分出多個微容器的側壁24和被劃分的處所23。 側壁24的高度d只要是可保持培養液或反應液等的上清液不乾燥的容量即可，可以適當設定。通過具有側壁24，可在各處所23中使用不同的培養基。另外，在圖5和圖6中，表示具有側壁24的構成例，但也可以是不具有側壁24的構成。作為製作細胞培養容器上的凹凸格局的方法，沒有特別地限定，例如可以列舉使用了模子的轉印成型、3維光造形、精密機械切削、溼式蝕亥IJ、乾式蝕亥IJ、雷射加工、放電加工等的方法。優選考慮細胞培養容器的用途、要求的加工精度、成本等來適當選擇這些製造方法。作為使用模子進行轉印成型方法的具體例子，可以列舉以金屬結構體作為模具通過樹脂成型形成凹凸格局的方法。該方法可以以高的轉印率將金屬結構體的形狀對樹脂再現凹凸格局，另外通過使用通用的樹脂材料，可以降低材料成本，因此是優選的。使用這種金屬結構體的模具的方法是低成本的，在可滿足高的尺寸精度這方面是優異的。上述金屬結構體的製造方法例如可以列舉對利用光刻法製作的抗蝕圖形或利用3 維光造形製作的樹脂圖案的鍍敷處理、精密機械切削、溼式蝕刻、乾式蝕刻、雷射加工、放電加工等。只要考慮用途、要求的加工精度、成本等進行適當選擇即可。作為使用上述得到的金屬結構體作為模具來對樹脂進行凹凸格局的成型的方法， 例如可以列舉注射成型、加壓成型、單體澆鑄成型、溶劑澆鑄成型、熱壓印〃卜工
成型、採用擠出成型的輥轉印等的方法。從生產性和模具轉印性的角度考慮，優選採用注射成型。作為構成細胞培養容器的材料，只要是具有自身支持性的材料即可，沒有特別地限定，例如可以列舉合成樹脂、矽、玻璃等。從成本方面或利用顯微鏡觀察時的細胞可見性的角度考慮，優選以透明的合成樹脂作為材料。作為透明的合成樹脂，例如可以列舉聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物等的丙烯酸系樹脂、聚苯乙烯等的苯乙烯系樹脂、環烯烴等的烯烴系樹脂、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚乳酸等的酯系樹脂、聚二甲基矽氧烷等的有機矽系樹脂、聚碳酸酯樹脂等。在不損害透明性的範圍內，也可以在這種樹脂中含有著色劑、擴散劑、增稠劑等的各種添加劑。對於細胞培養容器，為了提高容器表面的親水性、生物體適應性、細胞親和性等， 也可以在凹凸格局表面側進行表面處理，配置改性層和/或塗布層。作為設置上述改性層的方法，只要不是喪失自身支持性的方法或產生100 μ m以上的極端的表面粗糙的方法即可，沒有特別地限定，例如可以列舉藥物處理、溶劑處理、利用表面接枝聚合引入接枝聚合物等的化學性處理、電暈放電、臭氧處理、等離子體處理等的物理性處理等的方法。另外，作為設置塗布層的方法，沒有特別地限定，例如可以列舉濺射、蒸鍍等的乾式塗布、無機材料塗布、聚合物塗布等的溼式塗布等的方法。為了在不混入氣泡地注入培養液，期望在凹凸格局上賦予親水性，作為形成均勻的親水性膜的方法，優選無機蒸鍍。另外，當考慮到細胞親和性時，更優選塗布例如膠原、纖維結合素等的細胞親和性蛋白質。為了均勻地塗布膠原水溶液等，優選在形成上述親水性膜後進行塗布。通常，在肝細胞培養中，期望模擬生物體內環境在細胞外基質表面進行培養，因此特別優選如上所述， 在配置了均勻的親水性無機膜後，再配置包含適合培養細胞的細胞外基質的有機膜。另外，對於使用上述細胞培養容器的細胞培養方法，為了使細胞僅配置在培養細胞的微容器中，並在該空間內表現類似於生物體內的形態或功能，需要接種適當的細胞數， 優選細胞接種密度為1.0 X IO2 1.0 X IO6細胞/cm2，更優選細胞接種密度為1.0X IO4 1.0X IO6細胞/cm2。例如當微容器為正方形、且一邊長為200 μ m時，優選5. OX IO4 5. OX IO5細胞/cm2。基於這種條件，可以得到直徑達到30 200 μ m的肝細胞團。接著，對於本實施方式的細胞保存方法進行說明。細胞保存方法是使用上述具有多個微容器的細胞培養容器來培養活細胞，並進行保存的方法。具體來說，首先進行使活細胞粘附於細胞培養容器的多個微容器的表面並進行培養的培養工序。接著，向細胞培養容器注入培養基(培養液)以覆蓋多個微容器、進行保存的準備的保存準備工序。保存這樣製成的細胞培養容器(保存工序)。以下更詳細地說明各工序。首先，對於培養工序進行說明。活細胞使用粘附性的細胞。通過使活細胞粘附在微容器表面，可以防止保存、運輸中活細胞衝撞微容器的表面等、防止從微容器流出。由此， 抑制培養的活細胞的功能損失，或者防止由於活細胞從培養基露出而導致的乾燥、由此導致的細胞功能的降低等。培養的活細胞可以使用實質細胞。具體來說，可以使用肝細胞、胰β細胞、心肌細胞、神經細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、組織幹細胞、ES細胞和iPS細胞(induced pluripotent stem cells)中的任一者。或者使用由組織幹細胞、ES細胞和iPS細胞中的任一者分化的肝細胞、胰β細胞、心肌細胞、神經細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞和骨細胞中的任一者。培養工序中，包括⑴使細胞粘附的工序，(2)除去非粘附細胞的工序，(3)進一步培養細胞、使其增殖、鋪展或聚集的工序。通過除去非粘附細胞，可以除去廢物，能夠防止培養基被汙染。另外，通過進一步培養增殖等，將活細胞培養至期望的細胞團的大小。例如， 進行增殖、鋪展、聚集，直至使細胞聚集塊的直徑為3(Γ200μπι。各微容器設計成可放入期望的細胞團的大小。這樣，進行活細胞的培養，以使活細胞粘附(接種)在多個微容器的表面、且在各微容器的空間內形成的三維結構體的細胞群體形成被隔離的細胞數。通過上述工序，在微容器內形成相當於1個三維結構體份的細胞數的細胞群體， 並隔離。其中，將在微容器內形成的細胞群體(細胞團)作為1份。利用微容器活細胞根據活細胞的大小而用高的壁隔離，且活細胞粘附於微容器。因此，與相鄰的三維結構體不相接。由此，即使在非靜置環境(運輸狀態等)下，活細胞也可以形成或維持均勻的三維結構體。接著，對於保存準備工序進行說明。培養基以不使培養的活細胞乾燥、還不與外部空氣接觸的量來注入。保存中使用的培養基是含有營養成分的介質，例如含有血清或增殖因子等的血中成分。培養基所含的成分根據保存的活細胞來確定。另外，細胞培養容器利用密封裝置密封，以使培養基不漏出。細胞培養容器是例如在具有開口部分的平皿或板、燒瓶中形成多個微容器的容器。在密封時，用膜或帽等的密封裝置覆蓋細胞培養容器的上面的開口部分，以使活細胞與外部隔離的狀態保存。密封裝置可以使用可阻斷液體或氣體的流入的材質的裝置，也可以使用可使二氧化碳或氧透過的裝置。其根據保存的活細胞或培養狀態進行選擇即可。另外，當運輸活細胞時，必須密封，以使培養基不漏出，但在靜置狀態下進行保存期間，可以是加上蓋子的狀態，以達到能夠防止培養基幹燥的程度，也可以是以開口部分的狀態進行保存的情況。根據活細胞的保存狀態， 細胞培養容器也可以是不密封的狀態。最後對於保存工序進行說明。保存時，細胞培養容器優選調節至在4°C以上且小於 37°C的溫度範圍的任意溫度，更優選6°C以上且小於25°C，進一步優選10°C以上且20°C以下。另外，保存工序還含有將在保存準備工序製作的密封的細胞培養容器進行運輸的期間。 優選在運輸期間也實施溫度調節。這裡，保存準備工序結束後的細胞培養容器的狀態例示於圖7。圖7中，表示使用如圖5和圖6所示的細胞培養容器，進行培養工序和保存準備工序的一個例子，在圖6所示的截面圖中補加了活細胞40和密封裝置30。具體來說，在細胞培養容器20內的各微容器 11中粘附活細胞40，並進行培養。圖7中，活細胞40用塗黑的圓簡略地表示，培養基50表示放入至雙點劃線的位置。密封裝置30將細胞培養容器20密封。圖7所示的培養基的量作為一個例子，例如有注入容器的三分之一容積的培養基的情況，也有注入培養基，直至與密封裝置30之間沒有空氣層的狀態的情況。培養基的容量根據活細胞的種類、培養狀態等來適當地選擇。如以上說明的那樣，根據上述實施方式的一種方式，可以不使用特殊的高分子，而使活細胞以與硬塑料狀的培養基板粘附的狀態形成三維結構來進行保存。已知活細胞在形成三維結構體時，可以提高細胞的功能。因此，在培養活細胞後，能夠以維持功能的狀態進行保存。進一步地，當使用車輛、船舶、航空器等的運輸裝置運輸細胞時，由於運輸中的環境要素、例如振動、溫度、CO2濃度(培養基的PH的變化)等，有細胞的功能進一步降低的擔心，或者由於運輸中產生的振動，有由於細胞的剝離或凝膠的損壞導致細胞凋亡等的擔心。 對於這些問題，通過使用本發明實施方式的一個方式，可以維持活細胞的功能進行運輸。例如當將從生物體分離的新鮮肝細胞運輸到其他地方時，可以應用本發明。特別地，從生物體分離的新鮮肝細胞僅可生存規定的時間(60小時)。這種情況下，可以期待能夠以維持新鮮肝細胞的三維結構、維持功能的狀態運輸細胞。另外，當將從生物體分離的新鮮肝細胞以冷凍的狀態運輸時，也可以應用本發明的一種方式，通過在將冷凍細胞融化後使用本發明的方法，可以期待能夠以非冷凍狀態保存或運輸。進一步地，當使用凝膠等的高分子運輸活細胞的三維結構時，有凝膠從活細胞剝落，或者凝膠的形狀變形，由此破壞活細胞的三維結構的情況，但通過應用本發明的一個方式，可期待能夠以維持三維結構、維持功能的狀態運輸活細胞。 實施例接著，對於本發明的細胞培養方法的實施例進行說明，但本發明不限於這些實施例。[實施例01]
用具有多個微空間的細胞培養容器保存的情況和用平板保存的情況的實施例 (培養容器)
利用光刻來製作作為圖3、4所示的凹凸格局形狀的、a=200 μ m、b=20 μ m、c=50 μ m的格局，進行Μ電鍍，得到具有相應的凹凸形狀的模具。使用該模具，利用熱壓印成型在聚苯乙烯上進行凹凸格局形狀的轉印，製作上述尺寸的樹脂基材。製作在該樹脂基材表面利用真空蒸鍍形成了 IOOnm 二氧化矽膜的膜，利用雷射熔接法在聚苯乙烯制的沒有培養底面的M 孔板上貼合膜後，進行Y射線滅菌，製作M孔的具有多個微空間的培養容器，用於保存試驗。
權利要求
1.細胞保存方法，其是使用具有多個微空間的細胞培養容器來保存活細胞的細胞保存方法，其中，使活細胞粘附於上述多個微空間的表面進行培養，在上述培養後，將培養基向上述細胞培養容器注入，以覆蓋上述多個微空間，將上述細胞培養容器密封，以使培養基不漏出，保存上述活細胞。
2.根據權利要求1所述的細胞保存方法，其特徵在於，上述細胞培養容器保持在4°C以上且小於37°C的溫度來保存上述活細胞。
3.根據權利要求1或2所述的細胞保存方法，其特徵在於，進行上述培養，以使粘附於上述表面、且在各微空間的空間內形成的三維結構體的細胞群體形成被隔離的細胞數。
4.根據權利要求廣3中任一項所述的細胞保存方法，其特徵在於，上述多個微空間的底部面積為0. ΟΓΟ. 1mm2，深度為25 150 μ m。
5.根據權利要求1、中任一項所述的細胞保存方法，其特徵在於，上述活細胞是肝細胞、胰β細胞、心肌細胞、神經細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、組織幹細胞、ES細胞和iPS細胞中的任一者。
6.根據權利要求廣4中任一項所述的細胞保存方法，其特徵在於，上述活細胞是由組織幹細胞、ES細胞和iPS細胞中的任一者分化的、肝細胞、胰β細胞、心肌細胞、神經細胞、 皮膚上皮細胞、軟骨細胞和骨細胞中的任一者。
7.根據權利要求廣6中任一項所述的細胞保存方法，其特徵在於，在上述培養後，除去非粘附細胞後將上述培養基向上述細胞培養容器注入。
8.根據權利要求廣7中任一項所述的細胞保存方法，其特徵在於，上述活細胞的培養為，在使活細胞粘附並進行培養後，進一步進行培養，使其增殖、鋪展或者聚集。
9.根據權利要求廣8中任一項所述的細胞保存方法，其中，以IXIiTlX IO6細胞/cm2 的細胞接種密度將活細胞接種在上述多個微空間中。
10.根據權利要求廣9中任一項所述的細胞保存方法，其特徵在於，在上述多個微空間中形成有活細胞集聚的細胞團。
11.根據權利要求廣10中任一項所述的細胞保存方法，其特徵在於，上述細胞團的直徑為30 200 μ m。
12.根據權利要求廣11中任一項所述的細胞保存方法，其特徵在於，上述培養基含有血清、增殖因子和血中成分中的至少一種。
13.根據權利要求廣12中任一項所述的細胞保存方法，其特徵在於，使用使氧或二氧化碳透過的膜來密封上述細胞培養容器。
14.細胞運輸方法，其是將活細胞保存於具有多個微空間的細胞培養容器並運輸的細胞運輸方法，其中，使活細胞粘附於上述多個微空間的表面進行培養，上述培養後，將培養基向上述細胞培養容器注入，以覆蓋上述多個微空間，將上述細胞培養容器密封，以使培養基不漏出，使用車輛、船舶或者航空器中的任一種運輸裝置將密封的上述細胞培養容器進行運輸。
15.根據權利要求14所述的細胞運輸方法，其特徵在於，上述細胞培養容器保持在4°C以上且小於37°C的溫度 。
全文摘要
本發明提供以維持活細胞的功能的狀態保存活細胞的細胞保存方法。細胞保存方法的一個方式是使用具有多個微容器(11)的細胞培養容器(20)來保存活細胞(40)的方法，其中，使活細胞粘附於多個微空間的表面來進行培養，在培養後，將培養基(50)向細胞培養容器(20)注入，以覆蓋多個微容器(11)。在適當大小的細胞培養容器中粘附活細胞，進行培養，形成三維結構體，由此可以以維持活細胞的三維結構體、且維持功能的狀態保存活細胞。
文檔編號C12N5/071GK102203241SQ20098014221
公開日2011年9月28日 申請日期2009年10月23日 優先權日2008年10月24日
發明者一丁田洋子, 田崎剛, 福田始弘, 谷口英樹, 鶴田仁志 申請人:公立大學法人橫浜市立大學, 可樂麗股份有限公司