一種異魯米諾衍生物及其製備方法和應用與流程

2023-05-07 16:47:46 1

本發明涉及生物免疫學檢測領域，具體涉及一種異魯米諾衍生物及其製備方法和應用。

背景技術：

魯米諾(luminol)、異魯米諾(isoluminol)及其衍生物是最早在化學發光法中使用的化學發光物質。魯米諾化學名3-氨基鄰苯二甲醯胼，最早由albrecht報導其發光特性。這類物質通過氧化產生α-羥基過氧化物的中間體，該中間體的分解可釋放出光能，所發光的性質與反應系統的ph值有關。魯米諾類化合物的氧化步驟與溶劑組分有關，在非質子溶劑中，化學發光只需要氧氣和一種強鹼；在質子溶劑中，需要酶來催化各種氧的衍生物氧化魯米諾。魯米諾體系的發光效率並不高，標記後發光強度會降低，而通過對非雜環進行化學修飾可以提高部分發光強度。

上世紀三十年代中後期，gleu發現了可以大大增強酶催化魯米諾化學發光體系發光強度的物質，即增強劑-羥高鐵血紅素(haematin)，其可以明顯增強發光強度，延長發光時間，提高信噪比及靈敏度。與不含增強劑的體系相比，加入增強劑後組成的魯米諾體系的發光強度可提高1000倍，發光時間延長至幾個小時，使原來的瞬時發光變為了持續發光，1978年，schroeder報導了abei及其類似物的合成方法，並指出在h2o2-haematin底物系統中，n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾(以下簡稱為abei)幾乎與魯米諾具有相當的發光效率和檢測靈敏度，並建立了甲狀腺素(t4)的化學發光免疫分析法，鑑於此，abei作為一種化學發光標記物，被廣泛應用於臨床診斷中。

目前abei的主要標記方法有edc法、半琥珀醯胺活潑酯法、環內酯法，但這些方法均存在發光強度不夠、背景值偏高，靈敏度有待改善等缺陷，同時，過多的標記又會對抗體或蛋白活性產生影響，限制了其在化學發光免疫分析的應用。因此為適應科學研究及市場的實際需求，有必要提供一種增強型異魯米諾衍生物，以提供更高檢測的靈敏度，且減少對蛋白活性產生的影響。

技術實現要素：

針對以上缺陷，本發明的目的在於提供一種發光強度高的增強型異魯米諾衍生物及其製備方法，用於增強現有魯米諾-過氧化物體系的發光強度，提高測試靈敏度與檢出限；同時，降低發光標記物對抗體或抗原的標記量，減少過量標記對抗體或抗原活性的影響。

本發明的另一目的在於提供一種包含上述異魯米諾衍生物的化學發光底液，或包含上述異魯米諾衍生物標記的抗原或抗體的化學發光試劑盒以及化學發光免疫分析系統，已解決採用現有魯米諾-過氧化物體系測試時靈敏度和檢出限差的技術問題。

本發明的再一目的在於上述異魯米諾衍生物在化學發光免疫定量分析中的應用。

根據本發明，提供了一種異魯米諾衍生物，其通式(i)為下式所示：

式中，x表示含有一個醯胺基的c原子數為1～7的直鏈或支鏈烷基，且烷基中插入至多一個亞氨基，或

x表示含有一個醯胺基的c原子數為1～7的烷基次氨基；

a的結構式為：

y表示亞甲基或1,3-亞乙氧基；

a選自4～24的整數，b選自0～20的整數，且a+b≤24；

c、d選自0～6的整數；

s、t選自3～10的整數；

m、n選自0或1。

在現有技術中，abei作為一種化學發光標記物，一方面，在標記抗體或抗原時會損壞抗體或抗原的活性；另一方面，abei在參與發光反應時，其結構會影響反應效率以及蛋白表面電荷的平衡，致使其標記的抗原或抗體易沉澱從而影響抗原或抗體的穩定性；且鑑於abei現有結構，其發光效率也有局限性。因此，本發明通過提供一種發光強度高的增強型異魯米諾衍生物，不僅降低發光標記物對抗體或抗原的標記量，減少過量標記對抗體或抗原活性的影響；且有效保證發光反應的正向進行，維持抗原或抗體在溶液中的穩定性。更關鍵的，本發明提供的異魯米諾衍生物通過成倍添加該衍生物的發光單元，大幅提高現有魯米諾-過氧化物體系的發光強度，提高測試靈敏度與檢出限。

上述通式(i)中，x的醯胺基與通式(i)中的-(ch2)b-連接。可以理解，上述a是一個基團，其與z基團連接形成a-z結構式，具體如下：

，其中z表示通式(i)中除去a的基團。

優選地，x可任選自以下結構：

(b1)：-n(h)c(＝o)-烷基-，且烷基中插入至多一個亞氨基，其中，烷基的碳原子數為1～6；或

(b2)：-n(h)c(＝o)-烷基次氨基-，且烷基的碳原子數為1～6；或

(b3)：-c(＝o)n(h)-烷基-，且烷基的碳原子數為1～6；或

(b4)：-c(＝o)n(h)-烷基次氨基-，且烷基的碳原子數為1～6。

進一步優選地，當x的結構為上述b1或b2時，m＝n＝1；

進一步優選地，當x的結構為上述b3或b4時，m＝n＝0。

在上述異魯米諾衍生物中，通過控制插入的間隔臂，即通過多個亞甲基和/或1,3-亞乙氧基形成的長鏈，尤其是通過1,3-亞乙氧基形成的長鏈保證該異魯米諾衍生物標記抗原或抗體後保持其在溶液中的穩定，進一步保證發光反應的穩定性，本發明a優選為4～12的整數；b優選為0～12的整數；同樣，將s、t進一步優選為3～6的整數，c、d進一步優選自0～3的整數。

上述通式(i)中，x結構式的烷基的碳原子數優選為1～3，進一步優選為下述結構：

-n(h)c(＝o)-ch(r1r2)或

-n(h)c(＝o)-ch2-ch(r1r2)或

-n(h)c(＝o)-ch2-ch2-ch(r1r2)或

-n(h)c(＝o)-ch2-ch(ch3)-ch(r1r2)或

-c(＝o)n(h)-ch(r1r2)或

-c(＝o)n(h)-ch2-ch(r1r2)或

-c(＝o)n(h)-ch2-ch2-ch(r1r2)或

-c(＝o)n(h)-ch2-ch(ch3)-ch(r1r2)或

-n(h)c(＝o)-ch2-nh-ch(r1r2)或

-n(h)c(＝o)-ch2-ch2-nh-ch(r1r2)或

-n(h)c(＝o)-ch2-ch(ch3)-nh-ch(r1r2)或

-n(h)c(＝o)-ch2-nh-ch2-ch(r1r2)或

-n(h)c(＝o)-ch2-n(r1r2)或

-n(h)c(＝o)-ch2-ch2-n(r1r2)或

-n(h)c(＝o)-ch2-ch2-ch2-n(r1r2)或

-n(h)c(＝o)-ch2-ch2-n(r1r2)或

-n(h)c(＝o)-ch2-ch(ch3)-n(r1r2)或

-c(＝o)n(h)-ch2-n(r1r2)或

-c(＝o)n(h)-ch2-ch2-n(r1r2)或

-c(＝o)n(h)-ch2-ch2-ch2-n(r1r2)或

-c(＝o)n(h)-ch2-ch2-n(r1r2)或

-c(＝o)n(h)-ch2-ch(ch3)-n(r1r2)

上述r1、r2基團相互獨立，且分別表示通式(i)中的-(ch2)c-和-(ch2)d-的結構。

特別優選地，為保證本發明的異魯米諾衍生物易於參加後續發光反應，烷基為碳原子數優選為1～2的直鏈烷基，尤其優選為與r1、r2基團連接的原子為n且碳原子數為1～2的直鏈烷基。

本發明的異魯米諾衍生物通過插入有限長度的間隔臂，且通過優化基團和成倍添加發光單元，不僅降低現有abei發光標記物對抗體或抗原的標記量，減少過量標記對抗體或抗原活性的影響，提高抗原和抗體的結合率；且保證異魯米諾衍生物標記抗原或抗體後的穩定性，更顯著增強現有魯米諾-過氧化物體系的發光強度，提高測試靈敏度與檢出限。

本發明還提供一種製備上述異魯米諾衍生物的方法，包括下述步驟：

1)合成n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環內酯；

2)將所述n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環內酯與小分子物質i反應，獲得第一中間產物；

3)將所述第一中間產物、n-羥基琥珀醯亞胺(以下簡稱為nhs)、交聯劑反應，後添加化合物i繼續反應，獲得第二中間產物；

4)將第二中間產物、nhs、交聯劑反應，獲得異魯米諾衍生物；

其中，所述小分子物質i為至少含有兩個氨基且c原子數為2～10的脂肪酸，所述脂肪酸的碳鏈可插入0～2個n原子；

所述化合物i為hooc-(ch2ch2o)a-(ch2)b-nh2

或

其中，a選自4～24的整數，b選自0～20的整數，且a+b≤24。

上述步驟1)中合成n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環內酯的方法可以為現有技術，但優選採用下述步驟：n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾與酸酐反應，後加入交聯劑繼續反應，獲得所述n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環內酯。其中，酸酐優選為丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、庚二酸酐、辛二酸酐、二甘醇酸酐中的任一種。

在一些具體實施例中，將n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾與酸酐反應的步驟具體為：將n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾與酸酐溶於溶劑，並通入保護性氣體，在40～100℃下水浴攪拌反應10～60分鐘，後移到室溫下避光繼續反應1～3小時。上述反應溫度在40度以上，則反應速度不會下降，且縮短反應時間，較為適當；反應溫度在100度以下，則不發生副反應。

上述步驟1)中，加入的n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾、酸酐、交聯劑的摩爾比優選為1：1～3：1～3；在合成過程中，加入適當過量的酸酐和交聯劑可以保證反應的徹底性，同時也將副產物的產率控制在合理範圍，方便後續分離純化。在一些具體實施例中，上述加入的n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾、酸酐、交聯劑的摩爾比為1：1.25：1.25。

上述步驟2)中，獲得的n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環內酯與小分子物質i，反應獲得第一中間產物的步驟具體為：將所述n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環內酯與小分子物質i溶於溶劑，並通入保護性氣體，在30～50℃下避光反應3～6小時，室溫靜止過夜，獲得所述第一中間產物。

需要說明，本製備方法中小分子物質i的分子量小於500。其中，小分子物質i為含有兩個氨基且c原子數為3～10的脂肪酸，所述脂肪酸的碳鏈可插入0～1個n原子。優選地，所述小分子物質i的同一個碳原子上連接的兩個活性基團不相同，包括但不限於兩個羧基、或兩個氨基。進一步優選地，所述小分子物質i任選自3-(n,n-二胺乙基氨基)丙酸、2,4-二氨基戊酸、4-氨基-3-氨甲基丁酸、2-(n,n-二胺乙基氨基)乙酸、3,5-二氨基戊酸、3-(n,n-二胺丙基氨基)丙酸、2-(n,n-二胺丙基氨基)乙酸。

上述步驟(2)中，反應溫度在30度以上，則反應速度不會下降，且縮短反應時間，較為適當；且為防止反應產物分解及確保中間產物的穩定性，反應溫度應在50度以下。

在一些具體實施例中，上述加入的n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環內酯與小分子物質i的摩爾比為1：0.5～2.5，在合成過程中，加入適量過量的小分子物質i可以保證可以保證反應的徹底性，同時也將副產物的產率控制在合理範圍，方便後續分離純化。進一步優選地，加入的n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環內酯與小分子物質i的摩爾比為1：0.625。

上述步驟3)中，化合物i為hooc-(ch2ch2o)a-(ch2)b-nh2，或

其中，為保證獲得的異魯米諾衍生物參與發光反應時的反應效率，即維持抗原或抗體在溶液中的穩定性，本發明a優選為4～12的整數；b優選為0～12的整數。

需要說明，為便於後續描述，在一些具體實施例中，當化合物i中a、b的數量作出以下變化時，採用以下相應簡稱表示化合物i，其中下述的peg表示1,3-亞乙氧基，me表示亞甲基，c表示羧基，a表示氨基，bs表示兩個nhs基團：

(1)化合物i為hooc-(ch2ch2o)a-(ch2)b-nh2時，

a＝4，b＝2，化合物i簡稱為ca(peg)4(me)2；

a＝4，b＝4，化合物ii簡稱為ca(peg)4(me)4；

a＝4，b＝12，化合物ii簡稱為ca(peg)4(me)12；

a＝12，b＝2，化合物ii簡稱為ca(peg)12(me)2；

a＝12，b＝4，化合物ii簡稱為ca(peg)12(me)4；

(2)化合物i為

時，

a＝5，b＝2，化合物i簡稱為bs(peg)5(me)2；

a＝4，b＝4，化合物i簡稱為bs(peg)4(me)4；

a＝4，b＝12，化合物i簡稱為bs(peg)4(me)12。

在一些具體實施例中，上述加入的第一中間產物、nhs、交聯劑的摩爾比為1：1～3：1～3；。為進一步控制反應的正向進行，加入的第一中間產物、nhs、交聯劑的優選為摩爾比為1：1.25：1.25。在另一些具體的實施例中，上述加入的第一中間產物、化合物ii的摩爾比為1：1～5。

在一些具體實施例中，將第一中間產物、nhs、交聯劑反應，後添加化合物i繼續反應，獲得第二中間產物的步驟具體為：將第一中間產物、nhs、交聯劑溶於溶劑，並通入保護性氣體，室溫下攪拌且避光反應1～3小時，後添加化合物i在30～50℃下避光反應1～3小時，獲得所述第二中間產物。上述反應溫度在30度以上，則反應速度不會下降，且縮短反應時間，較為適當；且為防止反應產物分解及確保中間產物的穩定性，反應溫度應在50度以下。

優選地，上述在室溫下攪拌且避光反應1～3小時之後，且在添加所述化合物i之前，還包括判斷是否有沉澱，如有沉澱，離心去掉沉澱取上清溶液，後在上清溶液中加入化合物ii繼續反應。更優選地，當交聯劑為dcc或dic時，進行離心去掉沉澱取上清溶液的步驟。

在一些具體實施例中，再處理步驟具體為：氮氣吹乾所述反應液，後重溶於甲醇、分離，獲得所述第二中間產物。其中，分離的步驟可以採用現有技術，但優選為矽膠柱層析分離。

上述步驟4)中，第二中間產物、nhs、交聯劑的摩爾比為1：1～3：1～3；在合成過程中，加入適量過量的nhs和交聯劑可以保證反應正向進行。進一步優選地，加入的第二中間產物、nhs、交聯劑的摩爾比為1：1.25：1.25。

其中，步驟4)具體為：將第二中間產物、nhs、交聯劑溶於溶劑，並通入保護性氣體，室溫反應1～3小時，獲得異魯米諾衍生物。

本製備方法步驟1)～4)中。在反應後和獲得相應產物前，都還包括後處理步驟，所述後處理步驟至少包括萃取、洗滌、乾燥、分離步驟中的任一種，所述各步驟的操作順序和次數以具體情況而定。優選地：步驟1)和2)中，反應後依次進行萃取、洗滌、乾燥、旋蒸、分離，獲得所述n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環內酯或第一中間產物；步驟3)中，添加化合物i避光反應後，氮氣吹乾反應液，後進行重溶、分離，獲得第二中間產物。在一些具體實施例中，萃取採用的萃取劑包括但不限於酯類化合物，例如乙酸乙酯、甲酸乙酯，或者甲苯、二氯甲烷等，可以獨自使用也可以混合使用。洗滌可以進行單次或多次，使用的洗滌劑以具體情況而定，包括但不限於超純水、稀鹽酸、飽和氯化鈉等，且洗滌順序可根據實際需要而定。乾燥劑包括但不限於無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、無水氯化鈣等。分離的步驟應以具體情況而定，例如可以是矽膠柱分離或採用離心步驟或液相色譜等，也可以分多次進行，在此不加以贅述，但本製備方法的分離優選為步驟簡化且成本可控的矽膠柱分離。為進一步純化、去除反應的副產物，本發明也可包括對產物進行旋蒸的步驟，旋蒸根據獲得的目標產物的物化性質而定，例如，步驟2)中還包括的旋蒸過程就需要在低溫條件下(<30℃)進行。重溶可以進行單次或多次，採用的溶劑優選為甲醇、乙醇等醇類溶劑，溶劑可以是獨自使用或至少兩種以上混合使用，優選為獨自使用。

本製備方法步驟1)～4)中，反應均在液相中進行，所述液相均使用溶劑溶解反應物，包括溶解n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環內酯與小分子物質i；或者溶解第一中間產物、nhs、交聯劑；或者溶解第二中間產物、nhs、交聯劑，使用的溶劑均為無水溶劑，優選為非質子溶劑，進一步優選為非質子極性溶劑。考慮abei衍生物可溶性差，所述溶劑更優選自二甲基甲醯胺(以下簡稱為dmf)、n-甲基-2-吡咯烷酮(以下簡稱為nmp)，n,n-二甲基乙醯胺(以下簡稱為dmac)、二甲基亞碸(以下簡稱為dmso)、六甲基磷醯胺、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、吡啶、丙酮中的任一種或兩種以上混合物。該溶劑可以獨自使用或至少兩種以上混合使用，優選為獨自使用。

本製備方法步驟1)～3)中，交聯劑優選為碳化二亞胺類交聯劑，進一步優選為二環己基碳二亞胺(簡稱為dcc)、n,n'-二異丙基碳二亞胺(簡稱為dic)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(簡稱為edc)、n-環己基-n'-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺對甲苯磺酸鹽(簡稱為cmc)中的任一種或兩種以上混合物。特別優選為dcc和dic。為易於後續異魯米諾衍生物的標記，也可以採用水相的edc和cmc。可以理解，交聯劑在不同步驟的作用並不相同，例如，步驟1)中加入交聯劑可促進abei衍生物內部脫水縮合形成環內酯；在步驟3)交聯劑可促進nhs脫水形成活化酯，同時為防止化合物i自身交聯，交聯劑必須在加入化合物i之前加入；步驟(4)中交聯劑用於羧基的活化從而形成活潑酯的結構。

本製備方法步驟1)～4)中，為避免氧氣、防止部分反應物氧化，在反應中均通入優選自氬氣、氖氣或氮氣的所述保護性氣體。另外，考慮到異魯米諾衍生物見光易分解，因此本製備方法的所有步驟都需在避光條件下進行。

本製備方法獲得的異魯米諾衍生物在-4～-40℃下進行保存；為保證異魯米諾衍生物的穩定性，優選地，異魯米諾衍生物在-4～-20℃下進行保存。

本製備方法在現有技術的基礎上大力優化反應體系，通過加入小分子物質(i)成倍添加發光單元，後再添加化合物i，以確保降低該衍生物參與反應時的空間效應，且保證異魯米諾衍生物參與反應時的效率與穩定性，以及nhs和dcc的協同作用，獲得增強型abei衍生物，該製備方法不僅簡易可行，且獲得的異魯米諾衍生物不僅增強了現有魯米諾-過氧化物體系的發光強度，提高測試靈敏度與檢出限；同時，降低發光標記物對抗體或抗原的標記量，減少過量標記對抗體或抗原活性的影響。

本發明還提供另一種製備上述異魯米諾衍生物的方法，包括下述步驟：

(a)將n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾與小分子物質ii、交聯劑反應，獲得第三中間產物；

(b)溶解所述第三中間產物，並加入縛酸劑反應，獲得第四中間產物；

(c)將所述第四中間產物與化合物i反應，獲得異魯米諾衍生物；

其中，所述小分子物質ii含有至少兩個不與同一原子相連的羧基和至少一個連接有氨基保護基團的亞氨基；

所述化合物i為hooc-(ch2ch2o)a-(ch2)b-nh2，或

其中，a選自4～24的整數，b選自0～20的整數，且a+b≤24。

需要說明，本製備方法中小分子物質ii的分子量小於500。

上述步驟(a)中，為保護氨基，防止小分子物質ii自身交聯，所述氨基保護基團任選自甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基、芴甲氧羰基、苄氧羰基、鄰苯二甲醯基、2,4-二甲氧基苄基、對甲氧基苄基、烯丙氧羰基。在一些具體實施例中，為更利於反應的正向進行，所述氨基保護基團任選自叔丁氧羰基、芴甲氧羰基、苄氧羰基。

優選地，小分子物質ii中可插入0～1個n原子，且該n原子與亞氨基中的n不相同。在一些具體實施例中，所述小分子物質ii選自3-叔丁氧羰基氨基戊二酸、3-叔丁氧羰基氨基庚二酸、3-芴甲氧羰基氨基戊二酸、3-芴甲氧羰基氨基庚二酸、3-苄氧羰基氨基戊二酸、3-苄氧羰基氨基庚二酸、n-叔丁氧羰基氨丙基-n-羧甲基氨基乙酸、n-叔丁氧羰基乙基-n-羧甲基氨基乙酸、n-叔丁氧羰基氨丙基-n-羧乙基氨基丙酸、n-叔丁氧羰基乙基-n-羧乙基氨基丙酸、n-芴甲氧羰基氨丙基-n-羧甲基氨基乙酸、n-芴甲氧羰基乙基-n-羧甲基氨基乙酸、n-芴甲氧羰基氨丙基-n-羧乙基氨基丙酸、n-芴甲氧羰基乙基-n-羧乙基氨基丙酸、n-苄氧羰基氨丙基-n-羧甲基氨基乙酸、n-苄氧羰基乙基-n-羧甲基氨基乙酸、n-苄氧羰基氨丙基-n-羧乙基氨基丙酸、n-苄氧羰基乙基-n-羧乙基氨基丙酸中的任一種。

優選地，為將羧基活化後與氨基形成肽鍵，加入的交聯劑優選為碳化二亞胺類交聯劑，進一步優選為dcc、dic、edc、cmc中的任一種或兩種以上混合物。特別優選為dcc和dic。為易於後續異魯米諾衍生物的標記，也可以採用水相的edc和cmc。

其中，上述步驟加入的n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾、小分子物質ii和交聯劑的摩爾比為1：0.5～2.5：0.5～2.5，在合成過程中，加入適量過量的小分子物質ii和交聯劑可以保證反應的徹底性，同時有效控制副產物的產率。進一步優選地，n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾、小分子物質ii與交聯劑的摩爾比為1：0.625：0.625。

優選地，上述在加入交聯劑反應後，以及在獲得第三反應產物前，還包括判斷反應是否產生沉澱的步驟，如有沉澱，離心去掉沉澱取上清溶液。

上述步驟(b)中，為避免酸影響反應或反應平衡，防止副產物的生成，且更易於脫去所述氨基保護基團，在反應時可以加入縛酸劑。本發明中的縛酸劑指在反應過程中能中和掉酸的一類物質，包括但不限於有機鹼或無機鹼，進一步優選為有機弱鹼。在一些具體實施例中，更優選為三乙胺、三丁胺、吡啶、二甲基氨基吡啶中的任一種。縛酸劑相對於第三中間產物使用比例是縛酸劑/第三中間產物摩爾比為0.2～1：1；優選為0.3～0.5：1。

上述步驟(c)具體為：將第四中間產物、化合物i溶於溶劑，並通入保護性氣體，室溫反應1～3小時，後依次用氮氣吹乾反應液、重溶、分離，獲得最終異魯米諾衍生物；在一些具體實施例中，反應1～3小時後及用氮氣吹乾反應液前，還包括判斷反應是否有沉澱，如有沉澱，離心去掉沉澱取上清溶液，後用氮氣吹乾所述上清溶液。進一步優選地，當交聯劑為dcc或dic時，進行離心去掉沉澱取上清溶液的步驟。在另一些具體實施例中，第四中間產物與化合物i的摩爾比為1：1～3，優選為1：1.25。

上述步驟(c)中，化合物i為hooc-(ch2ch2o)a-(ch2)b-nh2，或

為保證獲得的異魯米諾衍生物參與液相反應時的反應效率，即抗原或抗體在溶液中的穩定性，本製備方法a優選為4～12的整數；b優選為0～12的整數。需要說明，為便於後續描述，在一些具體實施例中，當化合物i中a、b的數值作出以下變化時，採用以下相應簡稱表示化合物i，其中下述的peg表示1,3-亞乙氧基，me表示亞甲基，c表示羧基，a表示氨基，bs表示兩個nhs基團：

(1)化合物i為hooc-(ch2ch2o)a-(ch2)b-nh2時，

a＝4，b＝2，化合物i簡稱為ca(peg)4(me)2；

a＝4，b＝4，化合物i簡稱為ca(peg)4(me)4；

a＝4，b＝12，化合物i簡稱為ca(peg)4(me)12；

a＝12，b＝2，化合物i簡稱為ca(peg)12(me)2；

a＝12，b＝4，化合物ii簡稱為ca(peg)12(me)4；

(2)化合物i為

時，

a＝5，b＝2，化合物i簡稱為bs(peg)5(me)2；

a＝4，b＝4，化合物i簡稱為bs(peg)4(me)4；

a＝4，b＝12，化合物i簡稱為bs(peg)4(me)12。

本製備方法步驟(a)～(c)中，反應均在液相中進行，所述液相均使用溶劑溶解反應物，包括先將n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾與小分子物質ii溶於溶劑，後加入交聯劑反應；或者溶解所述第三中間產物；或者將第四中間產物、化合物i溶於溶劑。其中，使用的溶劑均為無水溶劑，優選為非質子溶劑，進一步優選為非質子極性溶劑。考慮abei衍生物可溶性差，所述溶劑更優選自二甲基甲醯胺(以下簡稱為dmf)、n-甲基-2-吡咯烷酮(以下簡稱為nmp)，n,n-二甲基乙醯胺(以下簡稱為dmac)、二甲基亞碸(以下簡稱為dmso)、六甲基磷醯胺、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、吡啶、丙酮中的任一種或兩種以上混合物。該溶劑可以獨自使用或至少兩種以上混合使用，優選為獨自使用。

本製備方法步驟(a)～(c)中。在反應後和獲得相應產物前，都還包括後處理步驟，所述後處理步驟至少包括乾燥、分離、離心、重溶、洗滌步驟中的任一種，所述各步驟的操作順序和次數以具體情況而定。優選地：步驟(a)中，反應後依次進行採用氮氣吹乾所述第三反應產物，後重溶、分離，獲得所述第三中間產物；步驟(b)中，在避光條件下反應後，氮氣吹乾反應液、分離，獲得所述第四中間產物。在一些具體實施例中，重溶可以進行單次或多次，採用的溶劑優選為甲酸乙酯、乙酸乙酯等酯類溶劑，溶劑可以是獨自使用或至少兩種以上混合使用，優選為獨自使用。分離的步驟應以具體情況而定，例如可以是矽膠柱分離或採用離心步驟或液相色譜等，也可以分多次進行，但本製備方法的分離優選為步驟簡化且成本可控的矽膠柱分離。為進一步純化、去除反應的副產物，本發明也可包括對產物進行旋蒸、萃取、洗滌、乾燥等步驟，該部分與上述第一種製備方法的限定相同，在此不加以贅述。

本製備方法步驟(a)～(c)中，為避免氧氣、防止部分反應物氧化，在反應中均通入優選自氬氣、氖氣或氮氣的所述保護性氣體。另外，考慮到異魯米諾衍生物見光易分解，因此本製備方法的所有步驟都優選在避光條件下進行。

本製備方法獲得的異魯米諾衍生物在-4～-40℃下進行保存；為保證異魯米諾衍生物的穩定性，優選地，異魯米諾衍生物在-4～-20℃下進行保存。

本製備方法直接通過氨基和羧基縮合，後脫去保護基團，再與化合物i反應擴鏈，一方面成倍添加發光單元，增強發光強度；另一方面增長第一中間產物的線性結構，不僅降低該衍生物參與反應時的空間效應，且保證異魯米諾衍生物標記的抗原或抗體的穩定性，以及在nhs和dcc的協同作用下，獲得增強型abei衍生物。該製備方法不僅簡易可行，且獲得的異魯米諾衍生物增強了現有魯米諾-過氧化物體系的發光強度，提高測試靈敏度與檢出限；同時，降低發光標記物對抗體或抗原的標記量，減少過量標記對抗體或抗原活性的影響。

本發明提供一種化學發光底液，其至少包括本發明的異魯米諾衍生物或者由本發明的兩種獨立的異魯米諾衍生物的製備方法製備得到的異魯米諾衍生物，還可包括輔助性的成分，包括但不限於本領域人員公知的發光增強劑。該化學發光底液與酶配合實現化學發光，所述酶包括但不限於鹼性磷酸酶、過氧化物酶。所述化學發光底液可以包括在試劑盒中也可單獨放置並應用於化學發光系統。

本發明提供一種免疫診斷試劑，其包括本發明的異魯米諾衍生物或者由本發明的兩種獨立的異魯米諾衍生物的製備方法製備得到的異魯米諾衍生物。在本文中已證實，上述異魯米諾衍生物能增強現有魯米諾-過氧化物體系的發光強度，同時降低發光標記物對抗體或抗原的標記量，減少過量標記對抗體或抗原活性的影響。

本發明的診斷試劑還包括一種或多種檢測抗原或檢測抗體，其中檢測抗原或檢測抗體可以但不需要一定被上述異魯米諾衍生物標記。可以理解，其中標記可以是直接標記或間接標記，間接標記的方式包括但不限於通過異硫氰酸螢光素(fitc)與抗fitc抗體體系或通過鏈黴親和素(sa)與生物素(biotin)體系與檢測抗原或抗體連接進行標記。所述抗fitc抗體優選為羊抗fitc多克隆抗體。為降低非特異性吸附，且提高測試靈敏度，本發明優選為直接標記，也就是異魯米諾衍生物直接標記檢測抗原或檢測抗體。其中，標記方法為現有技術，在此不加以限定。如上所述，被本發明的異魯米諾衍生物標記的檢測抗原或檢測抗體在溶液中不會沉澱，性質穩定。

優選地，本發明的異魯米諾衍生物可標記檢測抗原或檢測抗體，底物除了至少存在鹼性溶液和h2o2以外，還可包括微過氧化物酶、過氧化氫酶、乳過氧化物酶、次氯血紅素、氯化血紅素、次氯酸鹽、cocl2、過硫酸鹽、過氧化鉀、高碘酸鈉、k3fe(cn)6、黃嘌呤氧化酶、次黃嘌呤氧化酶、叔丁醇鉀中的至少一種，進一步優選為次氯血紅素或者k3fe(cn)6。

本發明更進一步提供一種化學發光試劑盒，其包含含有本發明的異魯米諾衍生物標記的檢測抗原或檢測抗體的診斷試劑。優選地，試劑盒還包括固體支持物，例如微粒、珠子、試管、微孔滴定板、比色皿、膜、支架分子、薄膜、濾紙或晶片。優選為具有超順磁性和高含量表面功能基團的納米磁性微球，且粒徑大小為0.1-5μm，進一步優選為1-3μm。表面功能基團包括但不限於羧基、氨基、羥基等活性基團，但為避免磁性微球表面基團自身發生交聯，基團不能為巰基等基團。可以理解，試劑盒還可以任選地包括捕獲抗原或捕獲抗體，其中捕獲抗原或捕獲抗體可與微粒連接，其中連接可以是直接連接或間接連接，間接連接的方式包括但不限於通過異硫氰酸螢光素(fitc)與抗fitc抗體體系或通過鏈黴親和素(sa)與生物素(biotin)體系與捕獲抗原或捕獲抗體連接。所述抗fitc抗體優選為羊抗fitc多克隆抗體。為降低非特異性吸附，且提高測試靈敏度，本發明優選為直接標記，也就是異魯米諾衍生物直接標記檢測抗原或檢測抗體。其中，標記方法為現有技術，在此不加以限定。所述試劑盒包含的任選的捕獲抗原或捕獲抗體用以與試驗樣本中的待測抗原或抗體接觸，在接觸之前，任選的捕獲抗原或捕獲抗體先與固相支持物結合。

任選地，所述試劑盒包含執行測定必須的所有成分，即試劑、標準物、緩衝液、底物、稀釋液和待測抗體或待測抗原的免疫診斷試劑說明書等。所述試劑盒可以另外包括一種或多種對照物。用於分離和/或處理試驗樣品的其它組分(諸如緩衝液、稀釋液、預處理劑)也可以包括在試劑盒中。所述預處理劑、稀釋液、緩衝液可以是一種或多種溶劑。試劑盒的一種或多種組分可以被低壓凍幹，且試劑盒的一種或多種組分可以是液體或固體。

本發明還進一步提供一種化學發光免疫分析系統，其包含含有本發明的異魯米諾衍生物標記的檢測抗原或檢測抗體的試劑盒和半自動或全自動免疫分析儀。優選為全自動化學發光分析儀，尤其是採用深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司的全自動化學發光測定儀系列。所述分析儀包含執行測定必須的所有模塊，即反應杯加載模塊、加樣模塊、試劑倉、樣品倉、溫育模塊、清洗站、測量室、數據處理模塊、控制系統等。各模塊的結構及其相互位置關係為本領域的公知技術。

本發明還提供了用於確定含有本發明的異魯米諾衍生物標記的檢測抗原或檢測抗體的試劑盒中待測抗原或待測抗體的存在、量或濃度的方法。本領域已知的任意合適的測定可以用在這樣的方法中，只要這樣的測定使用本發明的異魯米諾衍生物。例子包括但不限於免疫測定，諸如夾心免疫測定或酶聯免疫吸附測定、競爭性抑制免疫測定等。通常，以1-步或2-步形式進行免疫測定，但在特定測定中，還可以包括特殊2-步形式進免疫測定，例如在1-步中就形成夾心複合物，後在2-步中再加入標記物(例如採用本發明的異魯米諾衍生物)標記的檢測抗原或檢測抗體。優選直接化學發光免疫測定，尤其是採用深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司的全自動化學發光測定儀系列的免疫測定。

本發明再提供一種含有本發明的異魯米諾衍生物，或者含有由本發明提供的兩種製備方法分別製備得到的異魯米諾衍生物，或者含有本發明的異魯米諾衍生物的免疫診斷試劑，或者包含含有本發明的異魯米諾衍生物標記的檢測抗原或檢測抗體的診斷試劑的試劑盒，或者包含本發明試劑盒和自動化免疫分析儀的化學發光免疫分析系統在化學發光免疫定量分析中的應用。尤其是用於異魯米諾衍生物對人血清中各種激素、腫瘤標誌物、傳染病、心血管及心肌標誌物中的至少一種進行化學發光免疫定量的測定。

任選地，所述激素為：

1)甲狀腺功能系列：其中，用於檢測甲狀腺功能的激素為促甲狀腺素、血清甲狀腺素、血清三碘甲狀腺原氨酸、血清游離四碘甲狀腺原氨酸、血清游離三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺球蛋白、甲狀腺球蛋白抗體、甲狀腺微粒體抗體、促甲狀腺激素受體抗體、抗甲狀腺過氧化物酶抗體、血清反三碘甲狀腺原氨酸；

2)性腺激素：其中，所述性腺激素為卵泡刺激素、黃體生成素、人絨毛膜促性腺激素、催乳素、雌二醇、游離雌三醇、孕酮、睪酮、游離睪酮、抗繆勒氏管激素、17羥基孕酮；

3)糖代謝系列：其中，所述糖代謝系列為c肽、胰島素、抗人胰島素抗體、胰島素原、穀氨酸脫羧酶抗體、抗胰島細胞抗體、抗蛋白酪氨酸磷酸酶樣蛋白質抗體。

任選地，所述腫瘤標誌物為血清甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原、游離前列腺特異性抗原、糖類抗原50、糖類抗原125、糖類抗原153、糖類抗原199、細胞角蛋白十九片段、糖類抗原242、糖類抗原724、sangtec-100蛋白質、胃蛋白酶原i、胃蛋白酶原ⅱ、胃泌素17、幽門螺旋桿菌。

任選地，所述用於檢測傳染病的系列為A型肝炎病毒總抗體、A型肝炎病毒總抗體igm抗體、B肝病毒表面抗原、B肝病毒表面抗體、B肝病毒e抗原、B肝病毒e抗體、B肝病毒核心抗體、C型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒p24抗原、梅毒螺旋體抗體、人類免疫缺陷病毒、人t淋巴細胞病毒1型抗體、人t淋巴細胞病毒2型抗體、克氏錐蟲。

任選地，所述用於檢測心血管及心肌疾病的標誌物為肌鈣蛋白i、腦自然肽n端前體蛋白、d-二聚體、醛固酮、血管緊張素i、血管緊張素ii、腎素、人血清脂蛋白相關磷脂酶a2。

本發明的異魯米諾衍生物通過插入有限長度的間隔臂，且通過優化基團和成倍添加發光單元，不僅降低現有abei發光標記物對抗體或抗原的標記量，減少過量標記對抗體或抗原活性的影響，提高抗原和抗體的結合率；且保證異魯米諾衍生物參與反應時的效率與穩定性，更顯著增強現有魯米諾-過氧化物體系的發光強度，提高測試靈敏度與檢出限。並且，本發明提供的兩種異魯米諾衍生物的製備方法是在現有技術的基礎上大力優化反應體系，且該製備方法簡易可行。此外，本發明提供的免疫診斷試劑能構成穩定性好、檢測範圍寬、靈敏度高的化學發光試劑盒，可應用於實現對人血清中各種激素、腫瘤標誌物、傳染病、心血管及心肌標誌物中的至少一種進行化學發光免疫定量的快速測定。

具體實施方式

下面將通過具體實施例對本發明做進一步說明，但應理解，本發明的範圍並不限於此。

以下實施例採用深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司生產的maglumi2000plus全自動化學發光免疫分析儀進行檢測。

B肝病毒表面抗原(以下簡稱為hbsag)，來源：美國meridian公司。

抗hbsag單克隆抗體1，來源：美國rabiosources公司。

抗hbsag多克隆抗體2，來源：美國rabiosources公司。

反三碘甲狀腺原氨酸抗原，來源：從sigma公司採購。

抗反三碘甲狀腺原氨酸抗體，來源：從biogenesis公司採購。

17α-羥孕酮抗體來源：購自calbioreagents公司。

17α-羥孕酮抗原來源：購自sigma公司。

抗胃泌素-17抗體來源：兩株抗體(第一抗胃泌素-17抗體和第二抗胃泌素-17抗體)均購自芬蘭biohit公司。

血管緊張素i(以下簡稱為aⅰ)抗原：購於sigma公司。

抗aⅰ抗體：購於biogenesis公司。

磁性微球來源：深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司生產。

maglumi2000化學發光分析儀，來源：深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司。

n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾(以下簡稱為abei)，來源：深圳新產業生物醫學股份有限公司生產。

實施例1

異魯米諾衍生物的製備

1)合成abei環內酯；

取500mgabei和200mg丁二酸酐，溶於30ml無水dmso溶劑，通入氬氣保護，50℃水浴攪拌反應30min，轉移到室溫避光繼續反應120min，加入400mgedc，室溫攪拌反應24h，結束反應。加入乙酸乙酯萃取，超純水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋轉蒸乾，矽膠柱分離得到abei環內酯。

2)第一中間產物的製備

將步驟1)中獲得的100mgabei環內酯，34mg3-(n,n-二胺丙基氨基)丙酸，溶於5ml無水dmso，在氬氣保護下，37℃避光反應4h，室溫靜止過夜。加入大量乙酸乙酯萃取，依次用稀鹽酸，飽和氯化鈉和超純水洗滌3次，無水硫酸鈉乾燥得有機相，低溫(<30℃)旋蒸。矽膠柱層析分離得第一中間產物。

3)第二中間產物的製備

取步驟2)中純化得到的第一中間產物100mg，加入25.2mgnhs，45.1mgdcc，置於5ml無水dmf，氬氣保護，室溫攪拌避光反應2h。離心去掉沉澱並取上清溶液，後加入92.9mgca(peg)4(me)2，37℃水浴攪拌避光反應2h。氮氣吹乾反應液，重溶於甲醇，矽膠柱層析分離得到第二中間產物。

4)終產物的製備

取10mg步驟3)中的第二中間產物，1.2mgnhs，2mgdcc，溶於1ml無水dmf，氬氣保護下室溫避光反應2h，得到終產物異魯米諾衍生物，-20℃保存。

實施例2

異魯米諾衍生物的製備

1)合成abei環內酯；

取500mgabei和290mg己二酸酐，溶於30ml無水dmf溶劑，通入氬氣保護，40℃水浴攪拌反應50min，轉移到室溫避光繼續反應3小時，加入440mgdcc，室溫攪拌反應24h，結束反應。加入甲酸乙酯萃取，超純水洗滌，無水硫酸鎂乾燥，旋轉蒸乾，矽膠柱分離得到abei環內酯。

2)第一中間產物的製備

將步驟1)中獲得的100mgabei環內酯，21mg2,4-二氨基戊酸，溶於5ml無水dmf，在氬氣保護下，37℃避光反應3h，室溫靜止過夜。加入大量甲酸乙酯萃取，依次用稀鹽酸，飽和氯化鈉和超純水洗滌3次，無水硫酸鎂乾燥得有機相，低溫(<30℃)旋蒸。矽膠柱層析分離得第一中間產物。

3)第二中間產物的製備

取步驟2)中純化得到的第一中間產物100mg，加入15.3mgnhs，25.8mgdcc，置於5ml無水dmso，氬氣保護，室溫攪拌避光反應2h，離心取上清液，加入35.2mgca(peg)4(me)4，37℃水浴攪拌避光反應2h。氮氣吹乾反應液，重溶於甲醇，矽膠柱層析分離得到第二中間產物。

4)終產物的製備

取10mg步驟3)中的第二中間產物，1.2mgnhs，2mgdcc，溶於1ml無水dmf，氬氣保護下室溫避光反應2h，得到終產物異魯米諾衍生物，-20℃保存。

實施例3

異魯米諾衍生物的製備

1)合成abei環內酯；

取500mgabei和270mg戊二酸酐，溶於30ml無水dmac溶劑，通入氬氣保護，60℃水浴攪拌反應20min，轉移到室溫避光繼續反應60min，加入450mgedc，室溫攪拌反應24h，結束反應。加入乙酸乙酯萃取，超純水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋轉蒸乾，矽膠柱分離得到abei環內酯。

2)第一中間產物的製備

將步驟1)中獲得的100mgabei環內酯，25mg3,5-二氨基戊酸，溶於5ml無水dmac，在氬氣保護下，37℃避光反應4h，室溫靜止過夜。加入大量乙酸乙酯萃取，依次用稀鹽酸，飽和氯化鈉和超純水洗滌3次，無水硫酸鈉乾燥得有機相，低溫(<30℃)旋蒸。矽膠柱層析分離得第一中間產物。

3)第二中間產物的製備

取步驟2)中純化得到的第一中間產物100mg，加入16mgnhs，28mgedc，置於5ml無水dmf，氬氣保護，室溫攪拌避光反應2h，加入60mgca(peg)4(me)12，37℃水浴攪拌避光反應2h。氮氣吹乾反應液，重溶於甲醇，矽膠柱層析分離得到第二中間產物。

4)終產物的製備

取10mg步驟3)中的第二中間產物，1.15mgnhs，1.91mgedc，溶於1ml無水dmf，氬氣保護下室溫避光反應2h，得到終產物異魯米諾衍生物，-20℃保存。

實施例4

異魯米諾衍生物的製備

1)合成abei環內酯；

取500mgabei和250mg丁二酸酐，溶於30ml無水nmp溶劑，通入氬氣保護，50℃水浴攪拌反應30min，轉移到室溫避光繼續反應120min，加入450mgdcc，室溫攪拌反應24h，結束反應。加入乙酸乙酯萃取，超純水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋轉蒸乾，矽膠柱分離得到abei環內酯。

2)第一中間產物的製備

將步驟1)中獲得的100mgabei環內酯，22.5mg4-氨基-3-氨甲基丁酸，溶於5ml無水無水nmp，在氬氣保護下，37℃避光反應4h，室溫靜止過夜。加入大量乙酸乙酯萃取，依次用稀鹽酸，飽和氯化鈉和超純水洗滌3次，無水硫酸鈉乾燥得有機相，低溫(<30℃)旋蒸。矽膠柱層析分離得第一中間產物。

3)第二中間產物的製備

取步驟2)中純化得到的第一中間產物100mg，加入18.4mgnhs，31.5mgdcc，置於5ml無水nmp，氬氣保護，室溫攪拌避光反應2h，離心取上清液，加入66.4mgca(peg)12(me)2，37℃水浴攪拌避光反應2h。氮氣吹乾反應液，重溶於甲醇，矽膠柱層析分離得到第二中間產物。

4)終產物的製備

取10mg步驟3)中的第二中間產物，1.21mgnhs，2.04mgdcc，溶於1ml無水dmf，氬氣保護下室溫避光反應2h，得到終產物異魯米諾衍生物，-20℃保存。

實施例5

異魯米諾衍生物的製備

1)合成abei環內酯；

取500mgabei和330mg庚二酸酐，溶於30ml無水dmso溶劑，通入氬氣保護，50℃水浴攪拌反應30min，轉移到室溫避光繼續反應120min，加入400mgdcc，室溫攪拌反應24h，結束反應。加入甲酸乙酯萃取，超純水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋轉蒸乾，矽膠柱分離得到abei環內酯。

2)第一中間產物的製備

將步驟1)中獲得的100mgabei環內酯，29.4mg2-(n,n-二胺丙基氨基)乙酸，溶於5ml無水dmso，在氬氣保護下，37℃避光反應4h，室溫靜止過夜。加入大量甲酸乙酯萃取，依次用稀鹽酸，飽和氯化鈉和超純水洗滌3次，無水硫酸鈉乾燥得有機相，低溫(<30℃)旋蒸。矽膠柱層析分離得第一中間產物。

3)第二中間產物的製備

取步驟2)中純化得到的第一中間產物100mg，加入16.8mgnhs，28.4mgdcc，置於5ml無水dmso，氬氣保護，室溫攪拌避光反應2h，離心取上清液，加入69.2mgca(peg)12(me)4，37℃水浴攪拌避光反應2h。氮氣吹乾反應液，重溶於乙醇，矽膠柱層析分離得到第二中間產物。

4)終產物的製備

取10mg步驟3)中的第二中間產物，1.15mgnhs，1.94mgdcc，溶於1ml無水dmf，氬氣保護下室溫反應2h，得到終產物異魯米諾衍生物，-20℃保存。

實施例6

異魯米諾衍生物的製備

1)第三中間產物的製備

取100mgabei和61.40mg3-叔丁氧羰基氨基戊二酸，溶於5ml無水dmf，加入45.63mgdcc，氮氣保護下，室溫避光攪拌2h，離心取上清液。氮氣吹乾上清液，重溶於甲酸乙酯，矽膠柱分離得第三中間產物。

2)第四中間產物的製備

取步驟1)中的第三中間產物50mg溶於20ml無水dmf，加入3.7ul三乙胺，氮氣保護下，室溫避光反應1h。氮氣吹乾，矽膠柱分離得第四中間產物。3)終產物的製備

取步驟2)中的第四中間產物100mg，bs(peg)5(me)295.07mg，溶於5ml無水dmf中，氮氣保護下，室溫攪拌避光反應2h，離心取上清液，氮氣吹乾上清液，重溶於乙酸乙酯，得到終產物異魯米諾衍生物，-20℃保存。

實施例7

異魯米諾衍生物的製備

1)第三中間產物的製備

取100mgabei和93.2mgn-芴甲氧羰基氨丙基-n-羧甲基氨基乙酸，溶於5ml無水dmso，加入44.93mgedc，氮氣保護下，室溫避光攪拌1h。氮氣吹乾，重溶於乙酸乙酯，矽膠柱分離得第三中間產物。

2)第四中間產物的製備

取步驟1)中的第三中間產物50mg溶於20ml無水dmso，加入2.2ul吡啶，氮氣保護下，室溫避光反應1h。氮氣吹乾，矽膠柱分離得第四中間產物。

3)終產物的製備

取步驟2)中的第四中間產物100mg，bs(peg)4(me)4156.21mg，溶於5ml無水dmso中，氮氣保護下，室溫攪拌避光1h。氮氣吹乾反應液，重溶於甲酸乙酯，得到終產物異魯米諾衍生物(結構見下式7-3)，-20℃保存。

實施例8

異魯米諾衍生物的製備

1)第三中間產物的製備

取100mgabei和65.2mgn-叔丁氧羰基乙基-n-羧甲基氨基乙酸，溶於5ml無水dmac，加入43.88mgdcc，氮氣保護下，置於室溫避光攪拌30分鐘，離心取上清液，氮氣吹乾上清液，重溶於乙酸乙酯，矽膠柱分離得第三中間產物。

2)第四中間產物的製備

取步驟1)中的第三中間產物50mg溶於20ml無水dmac，加入7.3ul三丁胺，氮氣保護下，室溫避光反應1h。氮氣吹乾，矽膠柱分離得第四中間產物。3)終產物的製備

取步驟2)中的第四中間產物100mg，bs(peg)4(me)12122.49mg，溶於5ml無水dmac中，氮氣保護下，室溫攪拌2h，離心取上清液，氮氣吹乾上清液，重溶於乙酸乙酯，得到終產物異魯米諾衍生物，-20℃保存。

實施例9B肝病毒表面抗原的檢測

按照專利cn104698172b中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的B肝病毒表面抗原含量，區別在於：將該專利cn104698172b實施例1中的標記物替換為本實施例1製備的異魯米諾衍生物。具體區別如下，以下為本實施例標記物體系的製備步驟：

標記物體系的製備。

1)透析液的配製：在5000ml燒杯中加入na2co314.31g，nahco326.46g，加水定容至4500ml，即得0.1mol/l的碳酸緩衝液。

2)選用截留量為14000的透析袋，量取合適的尺寸,取1mg抗hbsag多克隆抗體2用透析液調整到1ml，放入透析液中，室溫攪拌透析2小時將透析好的溶液加入本實施例1製備的異魯米諾衍生物404μg，37℃反應2小時。

3)以g-25凝膠柱純化上述反應得到的標記異魯米諾衍生物的抗hbsag多克隆抗體2。

4)在純化後的標記異魯米諾衍生物的抗hbsag多克隆抗體2溶液中加入等體積的5g/ml的bsa保護液，即得。

實施例10B肝病毒表面抗原的檢測

按照專利cn104698172b中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的B肝病毒表面抗原含量，區別在於：將該專利cn104698172b中實施例1的「加入300μgabei-半琥珀醯胺酸n-羥基琥珀醯亞胺酯」替換為「加入本實施例2製備的異魯米諾衍生物403μg」。

實施例11B肝病毒表面抗原的檢測

按照專利cn104698172b中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的B肝病毒表面抗原含量，區別在於：將該專利cn104698172b實施例1的「加入300μgabei-半琥珀醯胺酸n-羥基琥珀醯亞胺酯」替換為「加入本實施例3製備的異魯米諾衍生物440μg」。

實施例12B肝病毒表面抗原的檢測

按照專利cn104698172b中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的B肝病毒表面抗原含量，區別在於：將該專利cn104698172b實施例1的「加入300μgabei-半琥珀醯胺酸n-羥基琥珀醯亞胺酯」替換為「加入本實施例4製備的異魯米諾衍生物410μg」。

實施例13B肝病毒表面抗原的檢測

按照專利cn104698172b中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的B肝病毒表面抗原含量，區別在於：將該專利cn104698172b實施例1的「加入300μgabei-半琥珀醯胺酸n-羥基琥珀醯亞胺酯」替換為「加入本實施例5製備的異魯米諾衍生物500μg」。

實施例14B肝病毒表面抗原的檢測

按照專利cn104698172b中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的B肝病毒表面抗原含量，區別在於：將該專利cn104698172b實施例1的「加入300μgabei-半琥珀醯胺酸n-羥基琥珀醯亞胺酯」替換為「加入本實施例6製備的異魯米諾衍生物321μg」。

實施例15B肝病毒表面抗原的檢測

按照專利cn104698172b中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的B肝病毒表面抗原含量，區別在於：將該專利cn104698172b實施例1的「加入300μgabei-半琥珀醯胺酸n-羥基琥珀醯亞胺酯」替換為「加入本實施例7製備的異魯米諾衍生物427.8μg」。

實施例16B肝病毒表面抗原的檢測

按照專利cn104698172b中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的B肝病毒表面抗原含量，區別在於：將該專利cn104698172b實施例1的「加入300μgabei-半琥珀醯胺酸n-羥基琥珀醯亞胺酯」替換為「加入本實施例8製備的異魯米諾衍生物380.8μg」。

實施例17rt3的檢測

按照專利cn104730257a中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的反三碘甲狀腺原氨酸含量，區別在於：將該專利cn104730257a實施例1中的「加入300μgabei-半琥珀醯胺酸n-羥基琥珀醯亞胺酯」替換為「加入本實施例1製備的異魯米諾衍生物404μg」。

實施例1817α-羥孕酮的檢測

按照專利cn105651990a中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的17α-羥孕酮的含量，區別在於：將該專利cn105651990a實施例1中製備3的「加入300μgabei活化酯」替換為「加入本實施例1製備的異魯米諾衍生物404μg」。

實施例19胃泌素-17的檢測

按照專利cn104614536a中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的胃泌素-17抗原的含量，區別在於：將該專利cn104614536a實施例1中的「300μgabei-半琥珀醯胺酸n-羥基琥珀醯亞胺酯」替換為「加入本實施例1製備的異魯米諾衍生物404μg」。

實施例20血管緊張素i的檢測

按照專利cn104634965a中實施例1的試劑盒和實施例9的檢測方法檢測樣本中的血管緊張素i的含量，區別在於：將該專利cn104634965a實施例1中的「300μgabei活化酯」替換為「404μg本實施例1製備的異魯米諾衍生物」。

實施例21rt3的檢測

按照專利cn104730257a中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的反三碘甲狀腺原氨酸的含量，區別在於：將該專利cn104730257a實施例1中的「加入300μgabei-半琥珀醯胺酸n-羥基琥珀醯亞胺酯」替換為「加入本實施例6製備的異魯米諾衍生物321μg」。

實施例2217α-羥孕酮的檢測

按照專利cn105651990a中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的17α-羥孕酮的含量，區別在於：將該專利cn105651990a實施例1中製備3的「加入300μgabei活化酯」替換為「加入本實施例6製備的異魯米諾衍生物321μg」。

實施例23胃泌素-17的檢測

按照專利cn104614536a中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的胃泌素-17抗原的含量，區別在於：將該專利cn104614536a實施例1中的「300μgabei-半琥珀醯胺酸n-羥基琥珀醯亞胺酯」替換為「加入本實施例6製備的異魯米諾衍生物321μg」。

實施例24血管緊張素i的檢測

按照專利cn104634965a中實施例1的試劑盒和實施例9的檢測方法檢測樣本中的血管緊張素i的含量，區別在於：將該專利cn104634965a實施例1中的「300μgabei活化酯」替換為「321μg本實施例6製備的異魯米諾衍生物」。

對比例1B肝病毒表面抗原的檢測

按照專利cn104698172b中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的B肝病毒表面抗原含量，區別在於：標記物體系不同，具體如下：

標記物體系的製備：1)透析液的配製：在5000ml燒杯中加入na2co314.31g，nahco326.46g，加水定容至4500ml，即得0.1mol/l的碳酸緩衝液。

2)選用截留量為14000的透析袋，量取合適的尺寸,取1mg抗hbsag多克隆抗體用透析液調整到1ml，放入透析液中，室溫攪拌透析2小時將透析好的溶液加入169μgabei，37℃反應2小時。

3)以g-25凝膠柱純化上述反應得到的標記abei的抗hbsag多克隆抗體。

4)在純化後的標記abei的抗hbsag多克隆抗體溶液中加入等體積的的5g/ml的bsa保護液，即得。

對比例2B肝病毒表面抗原的檢測

與對比例1基本相同，區別在於：標記物不同，即abei替換為abei-環內酯，具體步驟如下：

1)透析液的配製：在5000ml燒杯中加入na2co314.31g，nahco326.46g，加水定容至4500ml，即得0.1mol/l的碳酸緩衝液。

2)選用截留量為14000的透析袋，量取合適的尺寸,取1mg抗hbsag多克隆抗體用透析液調整到1ml，放入透析液中，室溫攪拌透析2小時將透析好的溶液加入226μgabei-環內酯，37℃反應2小時。

3)以g-25凝膠柱純化上述反應得到的標記abei的抗hbsag多克隆抗體。

4)在純化後的標記abei的抗hbsag多克隆抗體溶液中加入等體積的的5g/ml的bsa保護液，即得。

對比例3B肝病毒表面抗原的檢測

按照專利cn104698172b中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的B肝病毒表面抗原含量。

對比例4rt3的檢測

按照專利cn104730257a中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的反三碘甲狀腺原氨酸含量。

對比例517α-羥孕酮的檢測

按照專利cn105651990a中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的17α-羥孕酮的含量。

對比例6胃泌素-17的檢測

按照專利cn104614536a中實施例1的試劑盒和檢測方法檢測樣本中的胃泌素-17含量。

對比例7血管緊張素i的檢測

按照專利cn104634965a中實施例1的試劑盒和實施例9的檢測方法檢測樣本中的血管緊張素i的含量。

測量結果及分析：

1、靈敏度分析

1)按照實施例9～16和對比例1-3中所示的檢測B肝病毒表面抗原的試劑盒及其檢測方法進行實驗，測試樣本包括：採購自中國藥品生物製品檢定所的hbsag定量參考品和定性參考品(批號：300003-201002)，測量結果如下表一～二所示。其中，按照上述試劑盒提供的hbsag標準品的十點曲線(a-j點)，其中a點為稀釋液，b點為1iu/ml，c點為3.162iu/ml，j點為10000iu/ml，對a,b,j點進行檢測，rlu:相對光單位。

2)按照實施例17、實施例21和對比例4中所示的檢測反三碘甲狀腺原氨酸的試劑盒和及其檢測方法進行實驗，測試結果如下表三所示。

3)按照實施例18、實施例22和對比例5中所示的檢測17α-羥孕酮的試劑盒和及其檢測方法進行實驗，測試結果如下表四所示。

4)按照實施例19、實施例23和對比例6中所示的檢測胃泌素-17的試劑盒和及其檢測方法進行實驗，測試結果如下表五所示。

5)按照實施例20、實施例24和對比例7中所示的檢測血管緊張素i的試劑盒和及其檢測方法進行實驗，測試結果如下表六所示。

2、加速穩定性分析

採用B肝病毒表面抗原標準品，用購買自美國scantibody公司的去激素人血清為溶劑配製成濃度為4ng/ml和12ng/ml的兩份樣品，其中，樣本1為低濃度樣品，樣本2為高濃度樣品。為驗證試劑的穩定性，將本實施例9、實施例14、對比例1～3提供的試劑盒分別置於37℃環境下，對樣本1和樣本2連續監測7天，記錄其rlu值的變化，結果如表七所示。

表一、B肝病毒表面抗原十點曲線rlu光強度檢測數據

按照實施例9～16中所示的檢測B肝病毒表面抗原的試劑盒及其檢測方法進行實驗，測試樣本包括：採購自中國藥品生物製品檢定所的hbsag定量參考品和定性參考品(批號：300003-201002)，測量結果如上表所示。

其中，按照上述試劑盒提供的hbsag標準品的十點曲線，其中0點為稀釋液，rlu:相對光單位。

從上表可以看出採用新方案合成的八種abei衍生物標記的抗體，具有更高的靈敏度，其中實施例12的靈敏度最高，a/j點的比例達到了1514，從abc三點可以看出實施例9-16在低點的靈敏度均優於對比例(1-3)，同時相對於對比例2和對比例3,本發明abei衍生物的用量(物質的量)比前兩者的用量少一半左右，說明對比例2和對比例3過多的標記也會對抗體的活性產生影響，從而導致靈敏度的降低。

表二、國家參考品測定結果

從上述結果可以看出，在5.9-100iu/ml濃度範圍內，對比例2和對比例3與實施本發明實施例9-16比較，並沒有明顯差異，而對比例1的測試結果遠偏離國家參考品的標準濃度，說明edc法直接標記abei時，既存在abei偶聯抗體，也有可能會導致抗體與抗體之間的偶聯，從而影響檢測結果的準確性。本發明實施例9-16和對比例2、對比例3均屬於定向與抗體偶聯，其檢測結果無明顯差異。

表三、rt3十點曲線rlu光強度檢測數據

從上述十點曲線結果可以看出，在0-10ng/ml濃度下，實施例17和實施例21比對比例4的的曲線範圍更大，其中實施例17的曲線範圍最大，rlu從692546到32253，有利於測試精確度，本發明中實施例17在低值區域(0、0.2、0.236)的靈敏度要明顯優於對比例4，這說明採用第一製備方法獲得的異魯米諾衍生物親水性更好，且增加一定長度的手臂能提高檢測的靈敏度。

表四、17α-oh孕酮十點曲線rlu光強度檢測數據

從上述十點曲線結果可以看出，在0-20ng/ml濃度下，實施例18和實施例22比對比例5的的曲線範圍更大，其中實施例18的曲線範圍最大，有利於測試精確度，本發明中實施例18在低值區域(0、0.25、0.433)的靈敏度要明顯優於對比例5，這說明採用第一製備方法獲得的異魯米諾衍生物親水性更好，且增加一定長度的手臂能提高檢測的靈敏度。

表五、胃泌素-17十點曲線rlu光強度檢測數據

從上述十點曲線結果可以看出，在0-500pmol/l濃度下，實施例19和實施例29比對比例6的的曲線範圍更大，其中實施例19的曲線範圍最大，有利於測試精確度，本發明中實施例19在低值區域(0、1、2.174)的靈敏度要明顯優於對比例5，這說明採用第一製備方法獲得的異魯米諾衍生物來標記抗體，能有效改善胃泌素-17測試的靈敏度。

表六、血管緊張素i十點曲線rlu光強度檢測數據

從上述十點曲線結果可以看出，在0-24ng/ml濃度下，實施例20和實施例24比對比例7的曲線範圍大，其中實施例19的曲線範圍最大，有利於測試精確度，本發明中實施例20在低值區域(0、1、2.174)的靈敏度要明顯優於對比例7，說明採用第一製備方法獲得的異魯米諾衍生物有效改善ai測試的靈敏度。

表七B肝病毒表面抗原試劑盒穩定性

註：相對偏差＝(第七天rlu-第一天rlu)/第一天rlu

表七中，實施例9和實施例14的相對偏差均小於10％，說明在37℃條件下，試劑相對穩定。而對比例1的相對偏差約在34％到37％之間，可知對比例1的試劑盒對於溫度已經非常敏感；對比例2的相對偏差約20％，對比例3的相對偏差在23％-26％。說明在37℃條件下，對比例2和對比例3相對於實施例9和實施例14，試劑較不穩定，這對於對周圍環境要求非常高的直接化學發光檢測(測量結果往往達到納克級別甚至皮克級別)而言影響是非常大的。而對比例1中的試劑對溫度相當敏感，可能是由於在37℃下，對比例1中抗體穩定性會發生較大的變化，導致測試結果出現很大的偏差。

綜上，上述實施例1-24結果表明，通過優化異魯米諾衍生物的結構，各實施例製備獲得的異魯米諾衍生物在標記各抗原或抗體後組成的不同試劑盒在用於檢測時不僅增強現有魯米諾-過氧化物體系的發光強度，提高測試靈敏度與檢出限，且標記的抗原或抗體穩定性好。而且還降低現有abei發光標記物對抗體或抗原的標記量，減少過量標記對抗體或抗原活性的影響。

雖然本發明已作了詳細描述，但對本領域技術人員來說，在本發明精神和範圍內的修改將是顯而易見的。此外，應當理解的是，本發明記載的各方面、不同具體實施方式的各部分、和列舉的各種特徵可被組合或全部或部分互換。在上述的各個具體實施方式中，那些參考另一個具體實施方式的實施方式可適當地與其它實施方式組合，這是將由本領域技術人員所能理解的。此外，本領域技術人員將會理解，前面的描述僅是示例的方式，並不旨在限制本發明。