甘薯胚性細胞懸浮培養方法及通過該方法得到的胚性細胞的製作方法
2023-05-07 00:50:11
專利名稱：甘薯胚性細胞懸浮培養方法及通過該方法得到的胚性細胞的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種甘薯胚性細胞的懸浮培養方法及通過該方法得到的胚性細胞。
背景技術：
傳統的甘薯轉基因受體大多採用葉片、葉柄等外植體，但這些外植體再生率較低，不適合做生物工程材料。在2003年出版的《中國農業科學》第36卷第5期第487-491頁披露了一種甘薯胚性細胞懸浮培養系，是一種較理想的生物工程材料，但是這種甘薯胚性懸浮培養系培養效率還不高。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種高效的甘薯胚性細胞懸浮培養方法。 將在含2. 0mg/L2，4_D的MS培養基上誘導得到的甘薯胚性愈傷組織，按接種密度0.5 25-4. O 25，放入置於100r/min搖床含2，4-D濃度為2. Omg/LMS液體培養基的培
養瓶中培養。通過此種方法培養的胚性懸浮細胞在7天後即可增殖到原來的I. 6-3. 96倍，且胚性懸浮細胞質量較好，並且，這個接種密度可以作為甘薯細胞懸浮培養中試放大的重要參考數據。優選方案是在接種密度2· O : 25 (SCV total ml of suspension culture)放入置於lOOr/min搖床含2，4_D濃度為2. Omg/LMS液體培養基的培養瓶中培養。通過此種方法培養的胚性懸浮細胞7天後可增殖到原來的3. 96倍。
具體實施例方式本發明的優點在於與其它懸浮細胞培養方法相比，培養所得的胚性細胞質量相當，但培養的效率顯著提高。下面以甘薯徐55-2為例，詳細介紹本發明的實施例。實施例I :取苗床生長旺盛、長Icm的徐55-2莖尖，用70%的酒精表面殺毒30s後立即轉入0. 1% HgC123min，而後勇無菌蒸餾水充分洗淨。在解剖顯微鏡下剝取約0. 5-1. Omm的莖尖分省組織，而後接種在含2. 0mg/L2，4-D的MS培養基上(3%蔗糖，0. 8%瓊脂，pH = 5. 8)，在28 ± 2°C、黑暗條件下進行培養，誘導胚性愈傷組織。培養8周後，將誘導得到的胚性愈傷組織破碎成小細胞團，轉入IOOmL三角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液體培養基，該培養基的成分同上述胚性愈傷組織誘導培養基，但是不加瓊脂。將三角瓶放在水平搖床上進行振蕩培養，培養條件為28±2°C，每天13h、5001x光照。懸浮培養7-10天繼代一次。將0. 5mLSCV(SCV :total ml of suspension culture)胚性懸浮培養細胞接Λ 25mL含2. 0mg/L2，4-D的MS液體培養基中，置於100r/min搖床上培養，培養條件為28±2°C，每天 13h、5001x 光照。通過這種培養方法培養的胚性懸浮細胞7天後即可增殖到原來的I. 67倍，且胚性懸浮細胞質量較好。實施例2:
取苗床生長旺盛、長Icm的徐55-2莖尖，用70%的酒精表面殺毒30s後立即轉入O. 1% HgC123min，而後勇無菌蒸餾水充分洗淨。在解剖顯微鏡下剝取約O. 5-1. Omm的莖尖分省組織，而後接種在含2. 0mg/L2，4-D的MS培養基上(3%蔗糖，O. 8%瓊脂，pH = 5. 8)，在28±2°C、黑暗條件下進行培養，誘導胚性愈傷組織。培養8周後，將誘導得到的胚性愈傷組織破碎成小細胞團，轉入IOOmL三角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液體培養基，該培養基的成分同上述胚性愈傷組織誘導培養基，但是不加瓊脂。將三角瓶放在水平搖床上進行振蕩培養，培養條件為28±2°C，每天13h、5001x光照。懸浮培養7-10天繼代一次。將O. 6mLSCV(SCV :total ml of suspension culture)胚性懸浮培養細胞接Λ 25mL含2. 0mg/L2，4-D的MS液體培養基中，置於100r/min搖床上培養，培養條件為28±2°C，每天 13h、5001x 光照。通過這種培養方法培養的胚性懸浮細胞7天後即可增殖到原來的I. 95倍左右，且胚性懸浮細胞質量較好。實施例3 取苗床生長旺盛、長Icm的徐55-2莖尖，用70%的酒精表面殺毒30s後立即轉入O. 1% HgC123min，而後勇無菌蒸餾水充分洗淨。在解剖顯微鏡下剝取約O. 5-1. Omm的莖尖分省組織，而後接種在含2. 0mg/L2，4-D的MS培養基上(3%蔗糖，O. 8%瓊脂，pH = 5. 8)，在28±2°C實、黑暗條件下進行培養，誘導胚性愈傷組織。培養8周後，將誘導得到的胚性愈傷組織破碎成小細胞團，轉入IOOmL三角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液體培養基，該培養基的成分同上述胚性愈傷組織誘導培養基，但是不加瓊脂。將三角瓶放在水平搖床上進行振蕩培養，培養條件為28±2°C，每天13h、5001x光照。懸浮培養7-10天繼代一次。將I. OmLSCV(SCV :total ml of suspension culture)胚性懸浮培養細胞接Λ 25mL含2. 0mg/L2，4-D的MS液體培養基中，置於100r/min搖床上培養，培養條件為28±2°C，每天 13h、5001x 光照。通過這種培養方法培養的胚性懸浮細胞7天後即可增殖到原來的2. 86倍，且胚性懸浮細胞質量非常好。實施例4 取苗床生長旺盛、長Icm的徐55-2莖尖，用70%的酒精表面殺毒30s後立即轉入0. 1% HgC123min，而後勇無菌蒸餾水充分洗淨。在解剖顯微鏡下剝取約0. 5-1. Omm的莖尖分省組織，而後接種在含2. 0mg/L2，4-D的MS培養基上(3%蔗糖，0. 8%瓊脂，pH = 5. 8)，在28 ± 2°C實、黑暗條件下進行培養，誘導胚性愈傷組織。培養8周後，將誘導得到的胚性愈傷組織破碎成小細胞團，轉入IOOmL三角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液體培養基，該培養基的成分同上述胚性愈傷組織誘導培養基，但是不加瓊脂。將三角瓶放在水平搖床上進行振蕩培養，培養條件為28±2°C，每天13h、5001x光照。懸浮培養7-10天繼代一次。將2. OmLSCV(SCV :total ml of suspension culture)胚性懸浮培養細胞接Λ 25mL含2. 0mg/L2，4-D的MS液體培養基中，置於100r/min搖床上培養，培養條件為28±2°C，每天 13h、5001x 光照。通過這種培養方法培養的胚性懸浮細胞7天後即可增殖到原來的3. 96倍，且胚性懸浮細胞質量非常好。實施例5 取苗床生長旺盛、長Icm的徐55-2莖尖，用70%的酒精表面殺毒30s後立即轉入0. 1% HgC123min，而後勇無菌蒸餾水充分洗淨。在解剖顯微鏡下剝取約0. 5-1. Omm的莖尖分省組織，而後接種在含2. 0mg/L2，4-D的MS培養基上(3%蔗糖，0. 8%瓊脂，pH = 5. 8)，在28±2°C實、黑暗條件下進行培養，誘導胚性愈傷組織。 培養8周後，將誘導得到的胚性愈傷組織破碎成小細胞團，轉入IOOmL三角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液體培養基，該培養基的成分同上述胚性愈傷組織誘導培養基，但是不加瓊脂。將三角瓶放在水平搖床上進行振蕩培養，培養條件為28±2°C，每天13h、5001x光照。懸浮培養7-10天繼代一次。將3. 9mLSCV(SCV :total ml of suspension culture)胚性懸浮培養細胞接Λ 25mL含2. 0mg/L2，4-D的MS液體培養基中，置於100r/min搖床上培養，培養條件為28±2°C，每天 13h、5001x 光照。通過這種培養方法培養的胚性懸浮細胞7天後即可增殖到原來的I. 95倍，且胚性懸浮細胞質量較好。實施例6 取苗床生長旺盛、長Icm的徐55-2莖尖，用70%的酒精表面殺毒30s後立即轉入0. 1% HgC123min，而後勇無菌蒸餾水充分洗淨。在解剖顯微鏡下剝取約0. 5-1. Omm的莖尖分省組織，而後接種在含2. 0mg/L2，4-D的MS培養基上(3%蔗糖，0. 8%瓊脂，pH = 5. 8)，在28 ± 2°C實、黑暗條件下進行培養，誘導胚性愈傷組織。培養8周後，將誘導得到的胚性愈傷組織破碎成小細胞團，轉入IOOmL三角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液體培養基，該培養基的成分同上述胚性愈傷組織誘導培養基，但是不加瓊脂。將三角瓶放在水平搖床上進行振蕩培養，培養條件為28±2°C，每天13h、5001x光照。懸浮培養7-10天繼代一次。將4. OmLSCV(SCV :total ml of suspension culture)胚性懸浮培養細胞接Λ 25mL含2. 0mg/L2，4-D的MS液體培養基中，置於100r/min搖床上培養，培養條件為28±2°C，每天 13h、5001x 光照。通過這種培養方法培養的胚性懸浮細胞7天後即可增殖到原來的I. 7倍，且胚性懸浮細胞質量較好。比較例I :取苗床生長旺盛、長Icm的徐55-2莖尖，用70%的酒精表面殺毒30s後立即轉入0. 1% HgC123min，而後勇無菌蒸餾水充分洗淨。在解剖顯微鏡下剝取約0. 5-1. Omm的莖尖分省組織，而後接種在含2. 0mg/L2，4-D的MS培養基上(3%蔗糖，0. 8%瓊脂，pH = 5. 8)，在28±2°C、黑暗條件下進行培養，誘導胚性愈傷組織。
培養8周後，將誘導得到的胚性愈傷組織破碎成小細胞團，轉入IOOmL三角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液體培養基，該培養基的成分同上述胚性愈傷組織誘導培養基，但是不加瓊脂。將三角瓶放在水平搖床上進行振蕩培養，培養條件為28±2°C，每天13h、5001x光照。懸浮培養7-10天繼代一次。將O. 2mLSCV(SCV :total ml of suspension culture)胚性懸浮培養細胞接Λ 25mL含2. 0mg/L2，4-D的MS液體培養基中，置於100r/min搖床上培養，培養條件為28±2°C，每天 13h、5001x 光照。通過這種培養方法培養的胚性懸浮細胞7天後即可增殖到原來的I. 25倍左右，且胚性懸浮細胞質量較差。比較例2 取苗床生長旺盛、長Icm的徐55-2莖尖，用70%的酒精表面殺毒30s後立即轉入 O. 1% HgC123min，而後勇無菌蒸餾水充分洗淨。在解剖顯微鏡下剝取約O. 5-1. Omm的莖尖分省組織，而後接種在含2. 0mg/L2，4-D的MS培養基上(3%蔗糖，O. 8%瓊脂，pH = 5. 8)，在28 ± 2°C、黑暗條件下進行培養，誘導胚性愈傷組織。培養8周後，將誘導得到的胚性愈傷組織破碎成小細胞團，轉入IOOmL三角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液體培養基，該培養基的成分同上述胚性愈傷組織誘導培養基，但是不加瓊脂。將三角瓶放在水平搖床上進行振蕩培養，培養條件為28±2°C，每天13h、5001x光照。懸浮培養7-10天繼代一次。將O. 3mLSCV(SCV :total ml of suspension culture)胚性懸浮培養細胞接Λ 25mL含2. 0mg/L2，4-D的MS液體培養基中，置於100r/min搖床上培養，培養條件為28±2°C，每天 13h、5001x 光照。通過這種培養方法培養的胚性懸浮細胞7天後即可增殖到原來的I. 34倍左右，且胚性懸浮細胞質量較差。比較例3 取苗床生長旺盛、長Icm的徐55-2莖尖，用70%的酒精表面殺毒30s後立即轉入0. 1% HgC123min，而後勇無菌蒸餾水充分洗淨。在解剖顯微鏡下剝取約0. 5-1. Omm的莖尖分省組織，而後接種在含2. 0mg/L2，4-D的MS培養基上(3%蔗糖，0. 8%瓊脂，pH = 5. 8)，在28±2°C、黑暗條件下進行培養，誘導胚性愈傷組織。培養8周後，將誘導得到的胚性愈傷組織破碎成小細胞團，轉入IOOmL三角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液體培養基，該培養基的成分同上述胚性愈傷組織誘導培養基，但是不加瓊脂。將三角瓶放在水平搖床上進行振蕩培養，培養條件為28±2°C，每天13h、5001x光照。懸浮培養7-10天繼代一次。將0. 4mLSCV(SCV :total ml of suspension culture)胚性懸浮培養細胞接Λ 25mL含2. 0mg/L2，4-D的MS液體培養基中，置於100r/min搖床上培養，培養條件為28±2°C，每天 13h、5001x 光照。通過這種培養方法培養的胚性懸浮細胞7天後即可增殖到原來的I. 46倍左右，且胚性懸浮細胞質量一般。比較例4 取苗床生長旺盛、長Icm的徐55-2莖尖，用70%的酒精表面殺毒30s後立即轉入O. 1% HgC123min，而後勇無菌蒸餾水充分洗淨。在解剖顯微鏡下剝取約O. 5-1. Omm的莖尖分省組織，而後接種在含2. 0mg/L2，4-D的MS培養基上(3%蔗糖，O. 8%瓊脂，pH = 5. 8)，在28 ± 2°C、黑暗條件下進行培養，誘導胚性愈傷組織。培養8周後，將誘導得到的胚性愈傷組織破碎成小細胞團，轉入IOOmL三角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液體培養基，該培養基的成分同上述胚性愈傷組織誘導培養基，但是不加瓊脂。將三角瓶放在水平搖床上進行振蕩培養，培養條件為28±2°C，每天13h、5001x光照。懸浮培養7-10天繼代一次。將4. ImLSCV(SCV :total ml of suspension culture)胚性懸浮培養細胞接Λ 25mL含2. 0mg/L2，4-D的MS液體培養基中，置於100r/min搖床上培養，培養條件為28±2°C，每天 13h、5001x 光照。通過這種培養方法培養的胚性懸浮細胞7天後即可增殖到原來的I. 65倍，且胚性懸浮細胞質量一般。 比較例5 取苗床生長旺盛、長Icm的徐55-2莖尖，用70%的酒精表面殺毒30s後立即轉入0. 1% HgC123min，而後勇無菌蒸餾水充分洗淨。在解剖顯微鏡下剝取約0. 5-1. Omm的莖尖分省組織，而後接種在含2. 0mg/L2，4-D的MS培養基上(3%蔗糖，0. 8%瓊脂，pH = 5. 8)，在28±2°C、黑暗條件下進行培養，誘導胚性愈傷組織。培養8周後，將誘導得到的胚性愈傷組織破碎成小細胞團，轉入IOOmL三角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液體培養基，該培養基的成分同上述胚性愈傷組織誘導培養基，但是不加瓊脂。將三角瓶放在水平搖床上進行振蕩培養，培養條件為28±2°C，每天13h、5001x光照。懸浮培養7-10天繼代一次。將4. 2mLSCV(SCV :total ml of suspension culture)胚性懸浮培養細胞接Λ 25mL含2. 0mg/L2，4-D的MS液體培養基中，置於100r/min搖床上培養，培養條件為28±2°C，每天 13h、5001x 光照。通過這種培養方法培養的胚性懸浮細胞7天後即可增殖到原來的I. 60倍左右，且胚性懸浮細胞質量較差。比較例6 取苗床生長旺盛、長Icm的徐55-2莖尖，用70%的酒精表面殺毒30s後立即轉入0. 1% HgC123min，而後勇無菌蒸餾水充分洗淨。在解剖顯微鏡下剝取約0. 5-1. Omm的莖尖分省組織，而後接種在含2. 0mg/L2，4-D的MS培養基上(3%蔗糖，0. 8%瓊脂，pH = 5. 8)，在28±2°C、黑暗條件下進行培養，誘導胚性愈傷組織。培養8周後，將誘導得到的胚性愈傷組織破碎成小細胞團，轉入IOOmL三角瓶中，加入20mL含2，4-D的MS液體培養基，該培養基的成分同上述胚性愈傷組織誘導培養基，但是不加瓊脂。將三角瓶放在水平搖床上進行振蕩培養，培養條件為28±2°C，每天13h、5001x光照。懸浮培養7-10天繼代一次。將4. 3mLSCV(SCV :total ml of suspension culture)胚性懸浮培養細胞接Λ 25mL含2. 0mg/L2，4-D的MS液體培養基中，置於100r/min搖床上培養，培養條件為28±2°C，每天 13h、5001x 光照。通過這種培養方法培養的胚性懸浮細胞7天後即可增殖到原來的I. 58倍左右，且胚性懸浮細胞質量較差。
上述的實施例對本發明優選方式作了詳細說明，但本發明不限於上述實施方式，在本領域普通技術人員所具備的知識範圍內，還可以不脫離本發明宗旨的前提下作出各種變化。
權利要求
1.一種甘薯胚性細胞的懸浮培養方法，其特徵在於將甘薯胚性愈傷組織按接種密度0.5 25-4. O 25放入含2.0mg/L2，4-D的MS液體培養基的培養瓶中培養，該培養瓶置於100r/min搖床上。
2.根據權利要求I所述的甘薯胚性細胞懸浮培養方法，其特徵在於所述甘薯品種為徐 55-2。
3.根據權利要求I或2所述的甘薯胚性細胞懸浮培養方法，其特徵在於培養瓶為IOOmU培養瓶中的MS液體培養基為25mL。
4.根據權利要求I或2所述的甘薯胚性細胞懸浮培養方法，其特徵在於接種密度為2.O 25。
5.根據權利要求3所述的甘薯胚性細胞懸浮培養方法，其特徵在於接種密度為2.0 25。
6.根據權利要求I或2培養方法培養所得的甘薯胚性細胞。
7.根據權利要求3培養方法培養所得的甘薯胚性細胞。
8.根據權利要求4培養方法培養所得甘薯胚性細胞。
9.根據權利要求5培養方法培養所得甘薯胚性細胞。
全文摘要
本發明涉及一種甘薯胚性細胞的懸浮方法，其主要特徵是將甘薯胚性愈傷組織按接種密度0.5∶25-4.0∶25(SCVtotal ml of suspension culture)放入置於100r/min搖床的、含2.0mg/L2，4-D的MS液體培養基的培養瓶中培養。通過這種培養方法培養的胚性懸浮細胞7天後即可增殖到原來的1.6-3.96倍左右，且胚性懸浮細胞質量非常好；特別是當接種密度為2.0∶25時，其培養的效率最高，7天後可增殖到原來的3.96倍。
文檔編號C12N5/04GK102864120SQ20121038297
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月11日 優先權日2012年10月11日
發明者顧向華 申請人:顧向華