涉及穩定化聚合矽酸鹽組合物的材料和方法與流程
2023-05-07 20:18:48
本發明涉及關於穩定化聚合矽酸鹽組合物的材料和方法，並且特別地涉及用於生產穩定化聚合矽酸鹽組合物的方法、使用所述方法可獲得的組合物及其用途，特別是在治療中的用途。
背景技術：
矽是環境中普遍存在的元素，並且目前西方世界的成年人每天攝取約15mg至50mg。其天然地作為矽酸鹽存在，其中矽與氧原子相連。矽酸與二氧化矽也是用於該結構的術語。其範圍從最簡單的單矽酸(也稱為正(ortho))到二氧化矽顆粒。其精確的生物學作用尚未被理解，但許多證據指向其在結締組織健康中的重要作用(Jugdaohsingh等，2008)。儘管典型的結締組織包括骨、關節、血管、皮膚、毛髮以及指/趾甲，也有關於可溶性或聚合矽酸鹽在一系列廣泛的醫療病症中的飲食、補充劑(supplement)或治療益處的值得注意的證據，所述醫療病症包括但不限於骨質疏鬆症、骨質減少以及其他肌肉骨骼和關節疾病；所有類型的癌症；多種皮膚病症；血管病、心血管病和冠心病；炎性疾病；自身免疫病；阿爾茨海默病和不同類型的認知障礙；多種類型的感染；外傷和潰瘍；胃腸疾病；肝、腎和免疫相關疾病以及激素相關的變化與疾病。矽酸鹽有益的營養和醫療作用看來擴展至其他動物，尤其是其他哺乳動物。
矽酸鹽已經用作經口的營養補充劑，儘管不能獲得在給藥之後得以直接有效獲取(吸收)的製劑。二氧化矽在其天然存在的無機形式下是可溶的，如同正矽酸。然而，其濃度(例如在飲用水中)需要相對地低(≤1.7mM)，因為在自然條件下，這是在pH＜9下水的矽酸鹽的最大平衡溶解度，以防止顆粒不可逆的聚合的起動，在聚合過程中顆粒會逐漸縮合和/或尺寸增大並且之後不容易重新溶解。該表現已經困擾了矽酸鹽補充劑的開發，因為濃縮形式在腸中不會溶解以使其可吸收，而稀釋形式導致需要攝入大量的補充劑(例如，20ml/天至100ml/天)。
正常地，特定的化學部分如配體可用於結合併使其成為可溶性陽離子/陰離子(否則，其在生理學pH下本會沉澱)，但對矽酸鹽不便如此，因為其單體通常對其自身比對任何其他分子具有更高的親和性(即進行自組裝)，並且在水性溶液中二氧化矽的濃度越高，停止其自組裝就變得越困難。這導致尋求用於生產可生物利用的並且醫療上可用的矽酸鹽組合物的替代策略。
US 5,807,951(Nippon Zoki Pharmaceutical Co.，Ltd)描述了通過向矽酸鹽溶液中添加酸生產矽酸鹽聚合物的方法。任選地，可向矽酸鹽組合物中添加糖或糖醇，以使用乳糖或甘露醇為例。然而，US 5,807,951中描述的方法需要最後的乾燥步驟(在150℃和250℃之間)，以產生乾燥的凍幹組合物。然而，如在下文中另外描述的，加熱的使用，以及任何其他乾燥成粉末的形式，具有顯著的缺點，即引發具有相應不良吸收性的縮合矽酸鹽的形成。
US 2011/0229577(Kerek)公開了具有殼狀結構的矽酸顆粒，其中該顆粒在反應混合物的pH先降低並且之後升高的條件下縮合，導致據說在pH 2.1或pH大於9.2的組合物。
Kim等(Macromolecules，45：4225-4237，2012)描述了納米複合熔融物的產生，其形成自矽酸鹽納米顆粒和乙醇與限定質量PEG的混合物。將樣品在真空爐中加熱以去除殘留的乙醇。之後將真空爐如下若干次以去除氧，以氮氣淨化隨後將腔室排空，產生聚合納米複合物。重要的是，該矽酸鹽納米顆粒相對較大(44±5nm)。而且，這些是基於鹼催化的水解和產生縮合矽酸鹽的正矽酸四乙酯(TEOS)的縮合合成的。
Gao等(Colloids and Surfaces A：Physicochem.Eng.Aspects 350：33-37，2009)在PEG的存在下沉澱矽酸鹽，但所利用的方法需要首先在550℃煅燒，產生了高度縮合的材料，其與本文中所描述的那些有所區別。
鑑於現有技術在矽酸鹽組合物製劑、用於配製其的條件以及實施其需要的方式中的缺陷，在本領域中改善穩定化聚合矽酸組合物的性質仍然是未解決的問題。提供這樣的組合物是有優勢的，其中矽酸鹽為可再吸收的(resorbable)，即能夠進行高效的溶解以提供生物可用的可溶性矽酸，並且其中所述組合物不傾向於形成矽酸鹽的縮合形式(如現有技術中當乾燥組合物時所發生的)。作為替代或補充，如果所述穩定化聚合矽酸鹽組合物的其他組分適合用於施用於人或動物對象(例如不需要現有技術的矽酸鹽補充劑所需要的稀釋或其他步驟)，這也會是有利的。作為替代或補充，相對於僅含有低水平的生物可利用矽酸鹽(呈現為適合可再吸收的聚合矽酸鹽)的現有技術組合物，如果該組合物能夠提供適合用於治療量的穩定化聚合矽酸鹽組合物，這也會是有利的。
發明簡述
寬泛地說，本發明解決了本領域對以下的需要：提供穩定的並且水合的聚合矽酸鹽，使用該方法可獲得的組合物及其用途(該組合物適用於作為醫療藥劑和補充劑施用)。特別地，本發明闡明了穩定的並且水合的聚合矽酸鹽的供應，所述聚合矽酸鹽能夠靜脈內遞送或用於表面施用，例如，以固體或半固體軟膏劑的形式。這些製劑可用於外傷的治療。
如本領域中公知的，在可溶性矽酸與逐漸縮合的矽酸鹽組合物之間存在平衡。因此，在本發明中，「穩定化聚合矽酸鹽組合物」包括聚合矽酸和具有此處所描述的性質的納米矽酸顆粒，以及矽酸的可溶形式和聚矽酸，它們在組合物中或包含其的製劑中處於平衡。
本領域中出現的證據表明，在人和其他動物中，矽酸對於健康和疾病的預防或治癒是有益的。大體上說，本發明的組合物包含聚合矽酸鹽組合物，其中通過包含某些物質(如能夠充當生長阻滯劑起的有機化合物)抑制了聚合矽酸鹽生長以形成更有序的聚矽酸鹽和矽酸鹽顆粒的天然傾向，即其抑制聚矽酸生長以形成凝膠以及更加縮合的矽酸鹽顆粒或較所需尺寸更大的聚合物和顆粒的天然傾向。此外，在一些方面中，本發明人發現了該方法意味著該組合物在生理學可接受的pH下是穩定的，尤其是中性或弱酸性pH或弱鹼性pH下。
本文所描述的方法的另外的優勢在於，通過在合成中選擇性控制pH、矽濃度以和穩定劑濃度，可根據所需顆粒尺寸調整顆粒尺寸，從直徑小於1nm至直徑20nm的小聚合物，並且之後可根據本發明所概述的將其穩定化，以使得以所選擇的顆粒尺寸施用於對象或動物。對本領域技術人員顯而易見的是，顆粒尺寸指尺寸的範圍，並且本文中所引用的數字指平均直徑，最通常地是該範圍顆粒的平均直徑。
本發明人發現了聚亞烷基二醇例如PEG和/或糖類例如蔗糖是縮合不良之納米矽酸鹽的有優勢的尺寸穩定劑和/或穩定性調節劑，之後發現該矽酸鹽可用於經口、腸胃外或表面施用。蔗糖對於經口或腸胃外施用尤其有優勢，因為其是公認的有悠久歷史的極度安全的分子，其用於例如靜脈內鐵產品。相對地，PEG尤其良好地適用於局部遞送二氧化矽，因為其形成乳膏劑或軟膏劑，並可用於各種不同分子量，允許調整粘度和其他在最終的軟膏劑中可能需要的物理參數。本發明對局部產品的應用具有對外傷癒合以及如在抗感染組合物中的治療用途。
因此，在第一個方面中，本發明提供了用於生產穩定化聚合矽酸鹽組合物的方法，所述組合物包含聚合矽酸和平均直徑為20nm或更小的納米矽酸鹽顆粒，所述方法包括以下步驟：
(a)提供可溶性矽酸鹽的水性溶液，其pH大於或等於9.5；
(b)降低所述矽酸鹽溶液的pH以引發所述矽酸鹽的聚合，以形成聚合矽酸和納米矽酸鹽顆粒；並且
(c)與步驟(a)和/或(b)同時或先後地向所述矽酸鹽溶液添加包含聚亞烷基二醇和/或糖的穩定劑，從而產生穩定化矽酸鹽組合物，其中所述穩定劑抑制縮合矽酸鹽的形成；
其中所述穩定化聚合矽酸鹽組合物為水合的，並且其中所述方法不包括乾燥所述組合物或將其加熱至100℃以上。
在另一個方面中，本發明提供了穩定化聚合矽酸鹽組合物，其包含聚合矽酸和平均直徑為20nm或更小的納米矽酸鹽顆粒，其可通過前述權利要求任一項所述的方法獲得。
在體內瞬時穩定的矽酸鹽納米顆粒可具有適合於重激活免疫系統的作用，以幫助治療例如感染和癌症。癌症包括黑色素瘤、皮膚癌、肺癌、胰腺癌、結腸直腸癌和其他內臟癌症、胃癌、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、子宮癌、前列腺癌、食管癌、骨癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮內膜癌、腦癌、眼癌、卵巢癌、睪丸癌、肝癌、腎癌、頭頸癌並包括轉移和原發性癌症。感染包括，但不限於：病毒、逆轉錄病毒和細菌如分支桿菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，以及蠕蟲、寄生蟲和其他感染性病原體(agent)的感染。
該瞬時穩定矽酸鹽納米顆粒還可充當用於釋放矽酸的儲庫，矽酸自身有效地增強結締組織健康並可用於骨質疏鬆症、骨折癒合、關節疾病、皮膚病、血管疾病或用於營養補充以確保充足的矽酸鹽供應。
因此，施用可以是通過局部應用、經口施用或腸胃外施用，後者尤其是通過靜脈內施用。
在另一個方面中，本發明提供了如本文所限定的用於治療方法的穩定化聚合矽酸鹽組合物，其包含聚合矽酸和平均直徑為20nm或更小的納米矽酸鹽顆粒。
在另一個方面中，本發明提供了如本文所限定的穩定化聚合矽酸鹽組合物，其包含聚合矽酸和平均直徑為20nm或更小的納米矽酸鹽顆粒，其用於促進外傷癒合和/或治療或防止細菌感染的方法，其中所述組合物配製成用於表面施用。
在另一個方面中，本發明提供了如本文所限定的含有矽酸鹽的補充劑，其包含穩定化聚合矽酸鹽組合物，所述組合物包含聚合矽酸和平均直徑為20nm或更小的納米矽酸鹽顆粒，其用於向人或動物對象遞送矽酸。該組合物可用於治療通過矽酸鹽的施用而得到緩解的病症。
在另一個方面中，本發明提供了如本文所限定的穩定化聚合矽酸鹽組合物在製造用於治療通過矽酸鹽的施用而得到緩解之病症的藥物中的用途，所述組合物包含聚合矽酸和平均直徑為20nm或更小的納米矽酸鹽顆粒。
在另一個方面中，本發明提供了如本文所限定的穩定化聚合矽酸鹽組合物作為含有矽酸鹽的補充劑的用途，所述組合物包含聚合矽酸和平均直徑為20nm或更小的納米矽酸鹽顆粒。
在另一個方面中，本發明提供了組合物，其包含如本文所限定的用於治療的穩定化聚合矽酸鹽組合物，所述穩定化聚合矽酸鹽組合物包含聚合矽酸和平均直徑為20nm或更小的納米矽酸鹽顆粒。
在另一個方面中，本發明提供了治療通過矽酸鹽的施用而得到緩解之病症的方法，該方法包括向需要治療的對象施用治療有效量的組合物，所述組合物包含如本文所限定的穩定化聚合矽酸鹽組合物，其包含聚合矽酸和平均直徑為20nm或更小的納米矽酸鹽顆粒。
在另一個方面中，本發明提供了含有矽酸鹽的補充劑，其包含如通過本文所述方法可獲得的穩定化聚合矽酸鹽組合物，所述組合物包含聚合矽酸和平均直徑為20nm或更小的納米矽酸鹽顆粒，用於向人或動物對象遞送瞬時穩定的矽酸。
在另一個方面中，本發明提供了用於治療方法的穩定化聚合矽酸鹽組合物，其中所述組合物包含聚合矽酸和平均直徑為20nm或更小的納米矽酸鹽顆粒和穩定劑，所述穩定劑包含蔗糖和/或聚亞烷基二醇，其中組合物配製成用於經由靜脈內滴注的靜脈內(IV)施用。
在另一個方面中，本發明提供了用於治療方法的穩定化聚合矽酸鹽組合物，其中所述組合物包含聚合矽酸和平均直徑為20nm或更小的納米矽酸鹽顆粒和穩定劑，所述穩定劑包含聚亞烷基二醇，其中組合物配製為用於表面施用，所述組合物用於促進外傷癒合和/或治療或防止細菌感染的方法。
本發明的實施方案現將通過實施例的方式進行描述，並且不限於所參照的附圖。然而，鑑於本公開內容，本發明的多種其他方面和實施方案對於本領域技術人員將是顯而易見的。
本文所使用的「和/或」應看作兩個具體的特徵或組分中的每一個與或不與另一個的具體公開。例如，「A和/或B」應看作(i)A，(ii)B以及(iii)A與B中每一個的具體公開，就如同此處每一種被單獨地提出。
除非上下文另有說明，上文提出的特徵的描述與限定不限於本發明任何特定的方面或實施方案，並且同等地應用於所描述的所有方面和實施方案。
附圖簡述
圖1.處在由虛線表示的三種理論合成方法中不同階段的顆粒尺寸的示意圖。
圖2.乾燥之前的含有乳糖之矽酸鹽的顆粒尺寸。上圖展示了合成之後材料缺乏穩定性(70mM；pH 8)，並且下圖展示了在模擬的生理學條件下缺乏穩定性(40mM，pH 7.0)。該圖中所報導的材料是根據US 5,807,951合成的，用於與本發明的穩定化聚合矽酸鹽組合物相比較。
圖3.在60℃下加熱不同時間後，小無定形納米矽酸鹽(small amorphous nano-silicates，SANS)的溶解速率。注意加熱未導致顆粒尺寸的變化(未展示)。
圖4.高壓滅菌(121℃持續15分鐘)之前和之後小無定形納米矽酸鹽(SANS)的溶解速率。
圖5.A)小無定形納米矽酸鹽(SANS)和市售的縮合矽酸鹽(Ludox)在水中(pH 7.2±0.3)的溶解速率。B)小無定形納米矽酸鹽(SANS)、經高壓滅菌的SANS，與PEG穩定化的超小無定形納米矽酸鹽(ultra small amorphous nano-silictes，uSANS)以及非穩定化uSANS的溶解速率。
圖6.將超小無定形納米矽酸鹽之非穩定化混懸液(40mM)的pH提升至7.0後顆粒尺寸的變化。
圖7.將超小無定形納米矽酸鹽之非穩定化混懸液(0.5M)的pH提升至pH 4.0後顆粒尺寸的變化。
圖8.用蔗糖(1.5)穩定的超小無定形納米矽酸鹽(uSANS)混懸液(0.5M)在pH 4.0下的瞬時顆粒尺寸穩定性。
圖9.超小無定形納米矽酸鹽混懸液(1.4％Si；即0.5M)的穩定性。通過多種化合物在pH 3.5穩定納米顆粒矽酸鹽(A)。還在(B)中示出了pH的影響。將形成凝膠所需的天數用作穩定性的代表。在pH 3.5下所示出的結果包括經蔗糖穩定化的材料和非穩定化材料的比較。
圖10.經蔗糖穩定化的超小無定形納米矽酸鹽(uSANS)在生理學pH下的顆粒尺寸穩定性。
圖11.小無定形納米矽酸鹽(SANS)顆粒在冷凍之前和之後的尺寸。
圖12.在PEG軟膏劑中由分散的且附聚的小無定形納米矽酸鹽(SANS)顆粒(兩者均為5mM)釋放矽。
圖13.在每一種圖12的PEG軟膏劑中由小無定形納米矽酸鹽顆粒(SANS；5mM Si)和超小無定形納米矽酸鹽(uSANS，40mM至60mM Si)釋放矽。
圖14.在pH 3下由經PEG 200穩定化的矽酸鹽釋放矽，其中在PEG乳膏劑形成的不同階段進行調節至pH 7的步驟。注意，首先將矽酸鹽材料用PEG 200穩定化，之後添加PEG 400和PEG 3350以形成軟膏劑。
圖15.峰值波長的隨著[Si]的升高而下降，這表明在穩定化矽酸鹽材料存在下DMHP自Fe-DMHP絡合物中釋放。虛線指示不存在Fe時游離DMHP所獲得的峰值。
圖16.通過穩定化和非穩定化超小無定形納米矽酸鹽(兩者均為1.5mM)將鐵螯合(sequestration)後的峰值波長隨時間的偏移。
圖17.在不同Si超小無定形納米矽酸鹽存在下的大腸桿菌(E.coli)相對時間的生長曲線。
圖18.進行如美國專利No：5,807,951所述的實驗以示出在200℃下乾燥含有乳糖的矽酸鹽的影響。在乾燥4小時後形成大的黑色可見附聚物，其急劇地改變了所產生的材料。
圖19.小無定形納米矽酸鹽和Ludox在水中的顆粒尺寸。SANS顆粒尺寸增長至接近Ludox的顆粒尺寸，因此可獨立於尺寸比較溶解性。通過在調整pH後立即向納米矽酸鹽分散體添加濃縮鹽溶液(1-2mL，1.54M)使其尺寸增長。完成這個步驟後使得Ludox的顆粒尺寸大體上與SANS的顆粒尺寸相近，因而溶解性不受顆粒尺寸的作用。在使用前將該分散體在室溫下孵育大約24小時。
圖20.對uSANS分散體(500mM Si，pH 1.5)添加可溶性金屬離子之前和之後通過鉬酸測定(molybdate assay)確定的溶解速率。
圖21.對與在pH 10下孵育不同時間後的uSANS分散體(500mM Si，pH 1.5)，通過鉬酸測定確定的溶解速率。
詳細描述
矽的生物學作用和矽酸鹽的化學性質
證據表明，無論單體或聚合的矽酸對於人和其他動物的健康及疾病預防或治癒是有益的。然而，如上文所述，本領域的基礎問題是矽酸(其單體表示為Si(OH)4)進行自組裝，並且在pH≤9.0以及濃度超過水性矽酸鹽的最大溶解度(在25℃為1.7mM，見Jugdaosingh等，同上，圖1)的情況下其形成不可溶的物質。本領域公知的是，在可溶性矽酸及漸進式縮合的矽酸種類(即單-、雙-、三-矽酸，聚矽酸及矽酸鹽顆粒)之間存在平衡。從矽酸溶液中生長的過程包括離析(evolution)，其中單一單元在尺寸上生長並變得越來越離析(即更小的不穩定、可溶性和/或可溶解性)並且因此在不存在添加的鹼的情況下更難以變回Si(OH)4。生長可包括聚合、附聚、聚集或由於可溶性物質的表面沉積導致的尺寸的增長。在適合條件下聚矽酸的生長最終導致了凝膠形成。這些因素使得在這些水性矽酸鹽的濃度之上以及在生理學相關的pH下極其難以使矽酸鹽組合物穩定化。
因此，矽酸鹽的給藥是一種挑戰，因為劑量必須在濃度與化學形式兩方面按照所需效果的要求遞送矽，並且在與生理學健康相容的pH下並以避免持久的矽酸鹽納米顆粒(其對健康可能有不利影響)的方法進行。特別注意的是，在應用某劑量時，由於生理環境，通常會發生三個值得注意的變化。第一，將會有通過生理學流體的稀釋，第二，將會有pH改變，以及第三，將會有離子強度的改變。這些影響的淨效應將決定所給藥的矽酸鹽的特性。在這些方面中，本發明人發現可達到特定的條件以產生亞穩態的矽酸鹽劑量，在與對人或動物應用兼容的pH下且一旦化學環境發生變化(如可通過生理學相關系統所帶來的)，便會獲得或保持該矽酸鹽劑量的所需性質。
穩定化聚合矽酸鹽組合物
本發明提供了用於生產穩定化聚合矽酸鹽組合物的方法，所述組合物包含聚合矽酸及納米矽酸鹽顆粒，尤其是平均直徑為20nm或更小的顆粒。在本發明的方法中，通過矽酸鹽濃度、pH和/或穩定劑的組合，矽酸鹽的聚合和顆粒尺寸的增長是受控制的，並且使所得的顆粒被賦予了尺寸的穩定性。這在圖1中示意性地示出。在一些實施方案中，該組合物可額外地摻雜金屬陽離子，因為本發明人發現，這些可誘導顆粒尺寸增長並可為該組合物提供另外的有用性質。摻雜銅(Cu2+)或銀(Ag+)是優選的，因為這可為該製劑提供抗微生物性質。
該穩定化並水合的聚合矽酸鹽組合物可隨後根據該組合物的預期應用進行配製。若預期用於表面施用，可將該組合物併入軟膏劑(例如，PEG乳膏劑)，其中其自身可賦予額外的穩定性。對於靜脈內施用，在施用前調整該穩定性混懸液的pH和濃度(例如通過在靜脈注射緩衝液中稀釋)是有利的。該情況下，其主要目標可以是在於治療窗口期間(其間對個體施用該組合物)在生理條件下的尺寸穩定性，而非長期穩定性。在一些環境中，可利用稀釋來彌補一些由pH改變導致的穩定性的損失，因為矽酸組合物在矽的低濃度下更加穩定。因此，所述穩定化通過在使用時的稀釋可為待使用的材料提供充足的時間。
本發明的一個優選的特徵在於，可獲得穩定性及尺寸的控制而在該方法的任何階段中不使用高溫。這可與美國專利No：5,807,951中所採用的方法進行對比，其中在200℃乾燥矽酸鹽導致矽酸鹽縮合形式的形成，之後其生物可用性更弱。優選地，這意味著本發明的方法以低於100℃進行，並且更優選地低於70℃。作為替代或補充，優選獲得穩定性而不必去除溶劑(即乾燥)，因為這也有利於形成縮合形式的矽酸鹽。存在本領域已知的生產穩定膠體矽酸鹽方法，但這些使用了熱誘導的老化、和/或有機溶劑、和/或在超過100℃或甚至200℃下的乾燥過程的組合。然而，這些策略產生的納米顆粒相對地較大(通常大於20nm)並且重要的是，其表現為高水平的縮合。總之，這種高水平的縮合與本發明的穩定化聚合矽酸鹽組合物的縮合不良形式相比導致更加持久的顆粒，其具有長期毒性的潛能。
優選地，本發明的聚合矽酸鹽組合物具有可再吸收的性質，即其是縮合不良的無定形矽酸鹽，一旦施用其能夠在治療有用的時間尺度內經歷溶解。聚合矽酸組合物的無定形屬性和不同水平的縮合以及由無定形礦物質相表現的固相之相應結構排布可能難以通過XRD分析(或等效分析)區分。因此，本發明中，縮合水平可通過適當的體外溶解性測定確定，其中縮合不良的無定形納米矽酸鹽相對於相等顆粒尺寸的縮合無定形納米矽酸表現出更快的溶解速率。
在一個實施例中，溶解性測定可包括獲得聚合矽酸鹽組合物樣品並將其以緩衝液稀釋。可使用鉬酸測定確定隨著測定的時間進程存在於一份緩衝液中的可溶性矽酸鹽的濃度。如實施例中所示，該組合物可在10mM HEPES緩衝液中稀釋並調整至pH 6.7-pH 7.0。示例性鉬酸測定利用100μL的受試溶液或標準物(製備自Sigma Aldrich Si ICP標準物，1000mg/L)以及200μL鉬酸顯色溶液(0.6105g NH4Mo74H2O，15mL 0.5N H2SO4，85mL H2O)。將該試驗溶液轉移至孔板中並混合10分鐘。孵育後，可檢測吸光度(405nm)並使用標準曲線測定可溶性矽酸的濃度。通過舉例，「縮合不良的」聚合矽酸鹽組合物將是可再吸收的，例如，如在體外溶解性測定中所確定的，其中至少25％所述的組合物，且更優選地至少35％所述的組合物，更優選地至少50％所述的組合物，且更優選地至少75％所述的組合物在24小時內溶解於HEPES緩衝液中。
本發明的聚合矽酸鹽組合物包含可溶性聚矽酸和平均直徑為20nm或更小的聚合矽酸納米顆粒，並且在一些情況下其平均直徑更優選為小於10nm，更優選為小於5nm、4nm、3nm、2nm或1nm。在一些實施方案中，所述顆粒可在約1nm至約2nm，或約1nm至約3nm，或約1nm至約4nm，或約1nm至約5nm，或約1nm至約10nm，或約1nm至約15nm，或約1nm至約20nm，或約5nm至約20nm，或約5nm至約15nm，或約5nm至約10nm，或約10nm至約15nm，或約10nm至約20nm，或約15nm至約20nm的範圍內。
聚合矽酸和/或納米矽酸鹽顆粒的不可溶屬性可間接地通過上述鉬酸測定確定，因為這確定了可溶性矽酸成分。大體上，該材料將與可溶性矽酸平衡，在pH＜9.0下其通常的可溶性矽酸濃度為約＜2mM。本發明的聚合矽酸鹽組合物可與更加縮合形式的矽酸鹽對比，其包括更大的納米顆粒(例如，優選地具有大於50nm，並且更優選為大於20nm的平均尺寸)、聚矽酸凝膠以及二氧化矽(SiO2)，矽酸的完全縮合形式，其中-OH基團實際上不存在。聚矽酸顆粒的尺寸可使用動態光散射測定，並且優選地如果是非穩定化的，則在新鮮製備的樣品上進行測量。本領域技術人員將理解的是，該聚矽酸將於其他矽酸鹽物質形成平衡。例如，並且依據目前的準確條件，這可包括更少量的可溶性矽酸。
本發明的聚合矽酸鹽組合物為水合的，即水存在於其整個合成中，並且至少在一定程度上(例如，至少5wt％，更優選為至少10wt％，至少20wt％的水)，優選地也在最終的製劑中，即該材料在配製及隨後的施用之前不經乾燥或顯著加熱。然而，將會是明顯的，穩定劑或其他配製試劑可以這樣的高濃度使用，使得從該矽酸鹽顆粒中置換水分子。如此，儘管該製劑未經乾燥，水可被置換。
本發明的聚合矽酸鹽組合物的穩定優選地從其合成延伸至其儲存、配製和/或施用(例如，不期望缺乏附聚)。
本發明的聚合矽酸鹽組合物為亞穩態的，即該組合物具有的穩定性對於其預期使用的保質期目的是適合的，並且不生長至任何顯著的程度。通過舉例說明，優選地，本發明的聚合矽酸鹽組合物為儲藏穩定的，例如穩定3個月或更久，更優選6個月或更久，更優選12個月或更久，且更優選24個月或更久。因此，本發明的聚合矽酸鹽組合物可通過矽酸(或矽酸鹽)分子的部分縮合生產。這些材料作為分散的、非聚集的簇或膠體為亞穩態的。
在本發明中，聚合矽酸鹽組合物包含穩定劑，優選為糖和/或聚亞烷基二醇。糖包括由8個或更少單糖構成的寡糖，如單體、二聚體或三聚體糖類。優選的糖為蔗糖。所述糖中的單體單位最大數量是這樣選擇的以使其施用不引起施用個體的免疫反應。聚亞烷基二醇為聚醚化合物家族，其包括聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇。是糖(糖類)的穩定劑的實例包括單體、二聚體、三聚體及多聚體糖(糖類)，或對應的糖醇，如葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、蘇糖醇、赤蘚糖醇、山梨糖醇、甘露醇、半乳糖醇或核糖醇。在其中穩定劑為糖的一些實施方案中，其是除乳糖外的寡糖。在其中使用了糖醇的一些實施方案中，其不是甘露糖醇。在本發明中，使用糖作為穩定劑對於內部施用的組合物是優選的，因為其對於向人和動物對象施用是安全的。
在一些實施方案中，利用超過一種不同的糖或聚亞烷基二醇的組合物是可能的，例如2、3、4或5或更多種糖或聚亞烷基二醇，例如在步驟(a)和/或步驟(b)中添加它們。通常以0.01M至3.0M，更優選0.03M至2.0M，並且最優選0.1M至1.5M的濃度添加糖或聚亞烷基二醇穩定劑。技術人員可進行常規測試以確定哪種糖和/或聚亞烷基二醇的組合在任意給定條件下工作最好。
本發明的穩定化聚合矽酸鹽組合物可與公開於美國專利公布No：2003/0206967(Choi等)的組合物相區分，其描述了包含偏矽酸鈉、硼砂、硫代硫酸鈉、碳酸鉀和精製糖於水中的組合物。這導致產生非常鹼性的組合物，其pH約為pH 13，對比本發明的穩定化聚合矽酸鹽組合物的pH，其優選為pH 3.0至pH 9.0，更優選為pH 3.0至pH 8.0，且更優選為pH5.5至pH 7.5。獲得Choi等的組合物所使用的方法與本發明不同，因為本發明通過降低pH以產生穩定的矽酸鹽聚合物從而生產所述組合物。鑑於上述情況，優選地，本發明的穩定化聚合矽酸鹽組合物不包含偏矽酸鈉、硼砂、硫代硫酸鈉、碳酸鉀的一種或更多種，並且優選地不包含硼砂。
在另一些方面中，本發明可使用羧酸作為穩定劑並且所述羧酸可為C2-10羧酸，例如二羧酸，如草酸、丙二酸、戊二酸、酒石酸、琥珀酸、己二酸或庚二酸，或其離子化形式(即對應的羧酸鹽)，如己二酸鹽。或例如單羧酸，如葡糖酸。穩定劑的另一些實例為化學式HOOC-R1-COOH表示的二羧酸(或其離子化形式)，其中R1為任選地替換的C1-10烷基、C1-10烯基或C1-10炔基。大體上，優選使用其中R1為C1-10烷基，並且更優選為C2-6烷基的雙羧酸。
在一些實施方案中，可將所述聚合矽酸組合物與金屬陽離子接觸，如Ca2+、Mg2+、Ag+、Al3+、Cu2+、Fe3+和/或Zn2+，因為本發明人發現，其幫助穩定所述組合物抵抗溶解(其在一些應用中是可以有優勢的)或賦予另外的功能性益處(例如，抗微生物作用，例如通過包括Ag+和/或Cu2+)。不希望被任何具體的理論束縛，本發明人認為陽離子通過與存在於材料中的自由矽烷醇基團(-OH)相互作用包覆所述納米矽酸鹽顆粒。通過引導的方式，優選添加金屬陽離子以提供0.01M至1.0M的終濃度，並且更優選添加金屬陽離子以提供0.05M至0.5M的終濃度。優選地，添加金屬陽離子以提供100∶1至10∶1的Si與金屬的比例，並且任選地提供20∶1的Si與金屬的比例。
本發明人還出人意料地發現，本發明的聚合矽酸鹽組合物可通過添加非水性溶劑(例如醇)進一步穩定化。醇的優選實例為乙醇。通過舉例說明的方式，可添加所述非水性溶劑至10％v/v至50％v/v，或20％v/v至50％v/v，或10％v/v至20％v/v。此外，本發明人發現在一些情況下蔗糖與醇的組合對於穩定所述組合物是特別有效的。
在以下對本發明方法之步驟的討論中，將對本領域技術人員明顯的是，重排上述方法中的一些步驟和/或使一些步驟同時進行是可能的。上文提到的另外的步驟是任選的，並且在下文進一步解釋。
在導致本發明的工作中，發明人發現一些有助於聚合矽酸鹽組合物之穩定性的因素，包括起始鹼性矽酸鹽溶液的pH降低的速率、包含穩定劑、顯著地糖或聚亞烷基二醇、金屬陽離子的添加和/或非水性溶劑的添加。因此，本發明的方法可單獨或以任何組合地利用這些手段，以產生具有充足穩定性的聚合矽酸鹽組合物以用作例如補充劑或治療劑。金屬陽離子也可服務於為組合物提供抗微生物的性質(例如通過添加Ag+或Cu2+)和/或抑制該組合物的溶解，如圖20所證明。
在一些情況下，特別是對於生產超小納米矽酸鹽顆粒(「uSANS」)，鹼性矽酸鹽溶液pH降低的速率對所得聚合矽酸鹽組合物的穩定性具有顯著影響。優選地，在少於60秒，更優選少於30秒，更優選少於10秒，或最優選少於5秒的時間內使pH降低(例如降低至小於或等於pH 4.0或pH 3.0的pH)。
在步驟(a)中，優選所述鹼性矽酸鹽溶液的濃度為0.05M至1.5M，且更優選為0.03M至2.0M，其最優選為0.1M至1.0M。為了維持矽酸鹽的穩定性，還優選使用高於9.5的pH，並且優選地在步驟(a)中所述鹼性矽酸鹽溶液的pH為約pH 10.5或以上，並且仍然更優選地為約pH 11.5或以上。在最終的聚合矽酸鹽組合物中，矽的濃度可為2.5mM或更高、5.0mM或更高、25mM或更高、30mM或更高、40mM或更高、50mM或更高、100mM或更高、250mM或更高、500mM或更高。在最終的穩定化聚合矽酸鹽組合物中，矽的濃度可為1.5M或更低、1.0M或更低、500mM或更低，以及這些下限和上限之間的範圍。
在一些實施方案中，在步驟(b)中降低的pH對可產生的穩定化矽酸鹽納米顆粒的類型有影響。如實施例中所示，通過迅速地將pH從大於10的pH降低至pH 3.0或更小可形成平均直徑為5nm或更小的uSANS或者非常小的顆粒，並且將使得待使用的矽的濃度高達1M。或者，通過將pH降低至約7.4可形成平均直徑為10nm或更小的SANS或小納米顆粒。在這種情況下，可使用約50mM或更小的較低的濃度。因此，降低的pH可為7.4或更低，或pH 3.0或更低。這使得可以在低pH下製備uSANS，如所描述的，這將需要將pH提升以生長確定顆粒尺寸的uSANS至SANS，並通過再次降低pH使其尺寸穩定化。穩定劑在該方法的一些步驟中是需要的。這些方法是本領域的重要部分。
在一些情況下，可降低pH和/或稀釋該混懸液以用於穩定化水性混懸液的長期保存。作為替代或補充，在非生理pH下長期保存後以及向個體施用之前，可將所述納米矽酸鹽混懸液調整至生理pH，和/或稀釋和/或添加穩定劑。
在將所述矽酸鹽組合物配製為軟膏劑或乳膏劑的情況下，或在所述混懸液被稀釋從而使其矽濃度為100mM或更低的情況下，可優選地，將所述組合物或含有該組合物的製劑的pH升高至生理pH，優選為pH 3.0至pH 8.0，更優選為pH 5.5至pH 7.5。方便地，這可通過添加鹼如氫氧化鈉或碳酸鈉完成。大體上所述組合物的pH應適於施用，即與生理接近，例如pH 7.4±1.5。這樣的目的是使得向個體施用不會導致意外的臨床結果，如疼痛或炎症。然而，根據施用的途徑，如果含有所述穩定化聚合矽酸鹽組合物的最終製劑的pH在pH 3至pH9的範圍內是可接受的。
所述組合物應得到合適地穩定化，從而使得納米矽酸鹽的顆粒尺寸將保持充分穩定(＜20nm)以用於預期的應用。例如，在用於靜脈內施用的製劑的情況下，第一儲存溶液(例如pH＜3且100mM Si)的顆粒尺寸將在儲存期期間穩定，之後一旦以緩衝的靜脈注射溶液稀釋，其首先在施用前的幾個小時內保持穩定並且之後，一旦施用，其將不會發生附聚。在局部應用中PEG的穩定化還意味著在儲存期間及應用後，軟膏劑中的顆粒尺寸將足夠恆定。
組合物的配製和用途
本發明的穩定化聚合矽酸鹽組合物可配製為用於各種生物學相關應用，包括用作藥物或營養組合物的製劑，並且特別是作為含有矽酸鹽的補充劑或治療劑。本發明的組合物不僅可包含本發明的一種或更多固相材料，還可包含可藥用賦形劑、載質、緩衝劑、穩定劑或其他為本領域技術人員所熟知的材料。這樣的材料應為無毒性的並且依據其預期用途，不應幹擾所述穩定化聚合矽酸鹽組合物的效力。與在人對象中具有用於治療或預防病症的應用一樣，本發明在獸醫學領域也有應用。
本發明提供了適合各種不同應用的組合物，在所述應用中向對象提供矽酸。
在一項應用中，穩定化聚合矽酸鹽組合物可用於經胃腸道向對象經口遞送矽酸，特別是其中穩定劑為糖。在本發明的該方面中，優選地所述組合物大體上用於向對象直接施用，即不需要由對象在施用之前進行稀釋步驟。優選地，所述穩定劑選自本文所列出的糖類。通常，所述糖以如下的量使用：0.01M至3.0M，且更優選為0.03M至3.0M，甚至更優選為0.1M至3.0M，且最優選為0.01M至1.5M。更優選地，所述組合物的pH為1.0至6.0、1.5至5.0、或2.2至4.0、或2.4至4.0。在另一些實施方案中，所述組合物的pH在1.5或2.0或2.5至6.0或5.5或5.0或4.5或4.0或3.5之間。矽的濃度為0.1M至1.5M。這些組合物可用於補充矽或用於遞送治療性矽酸鹽，即治療通過治療性或營養矽酸鹽的遞送而緩解的病症。優選地，穩當配製為用於經口遞送時定化聚合矽酸鹽組合物為液體填充的膠囊。這可治療胃腸道的病症或用於補充矽的目的。前者可包括鐵結合以改善鐵在結腸中的毒性影響。這與其他經口遞送的實施方案可需要腸包衣或專用包衣以用於延遲釋放。
在另一個應用中，穩定化聚合矽酸鹽組合物可通過稀釋成滴液向對象靜脈內施用，所述滴液通常為葡萄糖或鹽水或蔗糖滴液，具有或不具有緩衝液或試劑達到適於施用的pH。在本發明的該方面中，適用於在循環中提供給定水平的矽酸鹽的劑量測定可通過醫生使用本領域所熟知的方法測定。
在一個作為替代的應用中，所述穩定化聚合矽酸鹽組合物可配製為用於表面施用例如用於應用到皮膚或外傷表面。
液體藥物組合物一般包括液體載劑如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。生理鹽溶液、右旋糖或其他糖類溶液或二醇類如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇可包括於此。當所述含有矽酸鹽的補充劑需要保持在固體形態，例如用以控制所述材料組分的遞送，從而選擇所述製劑的組分可能是必需的，例如在製造所述材料之液體製劑的情況下。根據需要，可包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑和/或其他添加劑，例如在本發明的一些實施方案中，其中所述聚合矽酸鹽組合物適於經由滴注向對象施用。
在治療性應用中，本發明的穩定化聚合矽酸鹽組合物優選地以「預防有效量」或「治療有效量」給藥於個體(根據可能的情況，儘管預防可以當做治療)，這足以向個體表現出益處(例如，生物可用性)。實際施用量，以及施用的速度與時程將取決於所治療疾病的屬性與嚴重程度。治療的處方，例如對劑量等的決定，屬於全科醫生及其他醫生的責任，並且通常考慮待治療的疾病、個體患者的病症、遞送的位點、施用的方式以及臨床醫師所知的其他因素。以上提到的技術及方案的實例可在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第20版，2000，Lippincott，Williams&Wilkins中找到。根據待治療的病症，可以單獨地或與其他治療組合地(或者同時或者先後地)施用組合物。
本發明的組合物可用於治療性應用中，其中矽酸鹽的遞送是所需的，其包括各種各樣的醫學病症，所述病症包括但不限於骨質疏鬆症、骨質減少、肌肉骨骼和關節疾病、所有類型的癌症、皮膚病症、血管疾病、心血管疾病、冠心病、炎性疾病、自身免疫病、阿爾茨海默病、認知障礙、所有類型的感染、外傷、潰瘍、胃腸疾病、肝病、腎病、免疫相關疾病或激素相關疾病。本發明的美容方面包括毛髮、皮膚或指/趾甲的美容改善，例如為其提供改善的外觀。本發明的組合物也可用於獸醫學治療性應用，其中矽的遞送是所需的，其包括但不限於外傷、潰瘍和癌症的治療。矽酸鹽的醫療用途公開於WO 2009/052090、美國專利公布No：2009/0130230及美國專利公布No：2013/0149396，這些文獻通過引用整體併入，並且特別地，本發明的組合物可以額外的優勢用於治療公開於這些參考文獻中的病症，所述優勢為本發明的組合物是穩定化的。
在另一個方面中，本發明的聚合矽酸鹽組合物可經口遞送卻不作為生物可用的矽，而是使其保持於遠端腸腔中(此處吸收較低)，並利用聚矽酸對特定陽離子(尤其是鐵)的強結合親和性。最近的證據表明，結腸中的鐵容許在敏感對象中結腸癌的發展(13)。因此，在另一個實施方案中，穩定化聚合矽酸鹽組合物靶向結腸，以一旦處於該環境則有利於聚矽酸僅逐漸溶解或甚至縮合的濃度，將導致腔內鐵的絡合/失活，而預防或減少該局部環境中的腫瘤生成。這可用於治療或預防結腸中的癌症。
在感染及慢性疾病，如癌症期間，軀體部分地經由對鐵的動員減弱以及鐵在不同細胞和胞外區室之間的運輸減弱誘發貧血狀態。鐵鎖定於鐵蛋白中。這是因為鐵的丟失可增強感染及慢性疾病狀態，並且因此需要將其螯合。事實上，在疾病治療中一個經常被提出的策略是以螯合劑對鐵進行螯合，所述螯合劑將其鎖定為固定的狀態。發現本發明的聚合矽酸鹽組合物(例如SANS和uSANS)可肅清鐵，這意味著當其適當地配製為用於施用於對象時，其可具有螯合鐵和幫助對抗疾病臨床作用。這可通過結合在胃腸道腔中的鐵從而防止鐵進入身體和/或對腸道細胞的毒性(如在結腸直腸區域中)，或可以是腸胃外施用之後在細胞和/或胞外區室的全身性效果。
在體內瞬時穩定的矽酸鹽納米顆粒可具有適合於重新激活免疫系統以幫助治療例如感染與癌症的作用。癌症可包括但不限於：黑色素瘤、皮膚癌、肺癌、胰腺癌、結腸直腸癌和其他內臟癌症、胃癌、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、子宮癌、前列腺癌、食管癌、骨癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮內膜癌、腦癌、眼癌、卵巢癌、睪丸癌、肝癌、腎癌、頭頸癌並包括轉移和原發性癌症。感染包括但不限於：病毒、逆轉錄病毒及細菌如分支桿菌、革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌，以及蠕蟲、寄生蟲及其他感染性病原體的感染。
該瞬時穩定矽酸鹽納米顆粒還可作用為用於釋放矽酸的儲庫，矽酸自身對於增強結締組織健康是有效的，並可用於骨質疏鬆症、骨折癒合、關節疾病、皮膚疾病、血管疾病或用於營養補充以確保充足的矽酸鹽供應。
如此，施用可以是通過局部應用、經口施用或腸胃外施用，後者尤其是通過靜脈內施用。
本發明的組合物的其他醫療用途包括治療高血壓、糖尿病、骨疾病、心血管疾病、神經退行性病理、所有上文未提到的類型的癌症、胃酸過多、骨質疏鬆、牙結石、阿爾茨海默病、克-雅病的治療以及用於外傷癒合。
本發明組合物的另外的醫療用途包括治療由燒傷、外傷或病原體作用或腐蝕性化學物質影響的皮膚，包括治療日光灼傷，或任何皮膚疾病，包括銀屑病、溼疹及其他類型的皮炎。
聚亞烷基二醇如PEG尤其良好地適用於矽酸鹽的局部遞送，因為其形成軟膏劑並可用於各種不同的分子量，允許調整粘度及其他在最終的軟膏劑中可能需要的物理參數。
將對本領域人員明顯的是，局部應用遞送可利用非基於PEG或僅部分基於PEG的軟膏劑實現。在此種情況下，一旦如本文描述以EPG啟動穩定化，則將矽酸鹽併入非基於PEG的軟膏劑，例如將PEG穩定化的納米矽酸鹽組合物併入另一種不同的載劑，如羥乙基纖維素。
一種或更多種本文所述的穩定化聚合矽酸鹽組合物的有效量可配製成用於表面施用，例如對皮膚、牙齒、指/趾甲或毛髮施用。這些組合物可為乳膏劑、洗劑、凝膠劑、混懸劑、分散體、微乳劑、納米分散體、微球、水凝膠劑、乳劑(水包油及油包水，以及多重乳劑)及多層凝膠及類似的形式(見，例如，The Chemistry and Manufacture of Cosmetics，Schlossman等，1998)，並且可配製為水性或矽酮組合物或可配製為一種或更多種油相在水性連續相中(或水相在油相中)的乳劑。在本發明中使用的載體類型取決於局部組合物的性質。載體可為固體、半固體或液體。合適載體為液體或半固體，如乳膏劑、洗劑、凝膠、棒、軟膏劑、貼劑、噴劑和摩絲(mousses)。特別地，載體為乳膏劑、軟膏劑、洗劑或凝膠形式，更特別地為一種具有足夠厚度或屈服點(yield point)以防止顆粒沉澱的載體。該載體自身可為惰性的或其可具有其自身的益處。載體也應當與在載體中配製的穩定化聚合矽酸鹽組合物或其他成分在物理和化學上相容。載體的實例包括水、羥乙基纖維素、丙二醇、丁二醇和聚乙二醇，或其組合。
材料及方法
小無定形納米矽酸鹽(SANS)的製備
從濃縮的矽酸鈉儲液中製備25±5mM的矽酸鹽溶液。之後，使用HCl溶液將pH調節至6.8±0.2。pH下降導致無定形膠質矽酸鹽的形成。使溶液靜置以平衡16小時至24小時，期間其增長至pH 7.1±0.2。該過程導致本發明的穩定化聚合矽酸鹽組合物的形成，其示意性地展示於圖1中。
方法學
在起始SANS儲液製備後25小時，將等分試樣在10mM HEPES緩衝液中稀釋至約1mM並調節pH(如需要)為pH 6.7至7。使用鉬酸測定來測定可溶性矽酸鹽隨時間的濃度。
鉬酸測定
將100μL的受試溶液或標準物(製備自Sigma Aldrich Si ICP標準物，1000mg/L)以及200μL鉬酸顯色溶液(0.6105g NH4Mo74H2O，15mL0.5N H2SO4，85mL H2O)轉移至96孔板中並混合10分鐘。孵育後，測量吸光度(405nm)，使用標準曲線確定可溶性矽酸的濃度。
由PEG穩定化的超小無定形納米矽酸鹽(uSANS)
通過首先將濃縮的矽酸鈉溶液稀釋(所得pH大於10.5)並且之後在少於5秒內通過推注添加濃HCl使pH降低至約pH 1.0製備納米顆粒矽酸鹽混懸液(0.5M Si)。然後將pH提升至pH 3.0，並添加1M的PEG 200。之後將該混懸液稀釋至1mM Si(24小時後)以用於溶解性測定。
非穩定化超小無定形納米矽酸鹽(uSANS)
對PEG穩定化的材料(0.5mM；pH 3)使用相同的方法，但不添加PEG。
當提升超小無定形納米矽酸鹽(uSANS；0.5M)的非穩定化混懸液至pH 7.0時的顆粒尺寸變化
通過以下製備uSANS的非穩定化混懸液(0.5M Si)：首先將濃縮的矽酸鈉溶液稀釋(所得pH大於10.5)，然後在少於5秒內通過推注添加濃HCl降低使pH降低至1.0，然後將其提升至pH 3.5。隨後將混懸液稀釋至40mM並將pH提升至pH 7.0以誘導受控的顆粒生長。
當提升超小無定形納米矽酸鹽(uSANS)的非穩定化混懸液(0.5M)至pH 4.0時的顆粒尺寸變化
方法：通過以下製備uSANS(0.5M Si)的非穩定化混懸液，首先將濃縮的矽酸鈉溶液稀釋(所得pH大於10.5)，之後在少於5秒內通過推注添加濃HCl使pH降低至約1.0。之後將pH提升至pH 4.0以誘導受控的顆粒生長。
以PEG穩定化的uSANS混懸液(0.5M)在pH4.0下的瞬時顆粒尺寸穩定性
通過以下製備納米顆粒矽酸鹽的非穩定化混懸液(0.5M Si)：首先將濃縮的矽酸鈉溶液稀釋(所得pH大於10.5)，之後在少於5秒內通過推注添加濃HCl使pH降低至約1.0。之後將pH提升至pH 4.0並添加1M PEG。
經蔗糖穩定化的超小無定形納米矽酸鹽(uSANS)混懸液在生理pH下的顆粒尺寸穩定性
通過將濃縮的矽酸鈉溶液稀釋(所得pH大於10.5)並添加蔗糖(從而使最終組合物含有1.5M蔗糖)製備以蔗糖穩定化的uSANS混懸液(0.5M Si)。然後在少於5秒內通過推注添加濃HCl使pH降低至約1.0。這之後通過添加氫氧化鈉以獲得pH 3.5。然後將該混懸液稀釋至40mM的Si並將pH調節至7以模擬靜脈內施用。
在冷凍之前和之後小無定形納米矽酸鹽(SANS)顆粒的尺寸
將新鮮SANS混懸液(30mM，如圖3中製備)在-20℃保持16小時，且在併入PEG乳膏劑前解凍1小時至3小時。
由PEG乳膏劑中的分散的和附聚的小無定形納米矽酸鹽(SANS)顆粒(兩者均為5mM)釋放矽
釋放測定：將含有Si的PEG乳膏劑(10g)轉移至並使其固定於Falcon試管底部至少12小時。然後，在乳膏劑層之上添加10mL的50mM重碳酸鹽緩衝液(pH 7)，並通過ICP-OES隨時間測定矽的釋放。該測定在室溫(約20℃)下進行。通過如上所述的冷凍及解凍產生附聚的材料。
併入PEG乳膏劑
將PEG 3350(5.25g)熔融。將SANS混懸液(2.3g的30mM混懸液)與PEG 400(6.15g)在65℃至70℃混合，並添加至PEG熔融物中。將所得混合物均質化並使其冷卻至室溫。
在PEG乳膏劑中由SANS顆粒(5mM Si)及uSANS顆粒(40mM及60mM Si)釋放矽
方法學：與圖12中描述的相同。
將uSANS併入PEG乳膏劑
方法1：將PEG 3350(5.25g)熔融並添加氫氧化鈉以確保一旦形成乳膏劑其pH高於pH 6。將經PEG 200穩定化的矽酸鹽納米顆粒(2.3g的0.5M混懸液)與PEG 400(6.15g)在65℃至70℃混合，並添加至PEG熔融物中。將所得混合物均質化並使其冷卻至室溫。
方法2：將PEG 3350(5.25g)熔融並添加氫氧化鈉以確保一旦形成乳膏劑其pH高於pH 6。將經PEG 200穩定化的矽酸鹽納米顆粒(2.3g的0.5M混懸液)與PEG 400(6.15g)在室溫下混合，並添加至PEG熔融物中。將所得混合物均質化並使其冷卻至室溫。
由PEG軟膏劑中的經PEG 200穩定化的聚合矽酸鹽釋放矽
將矽酸鹽在pH 3下穩定化，其中在PEG乳膏劑形成的不同階段進行調節至pH 7的步驟。
方法學：PEG軟膏劑的製備包括將經PEG200穩定化的混懸液(0.5M Si；pH 3.0)併入PEG乳膏劑，其進一步穩定所述材料。通過以下製備所述乳膏劑：首先將混懸液PEG 400混合，隨後加熱至60℃至70℃，之後添加PEG 3350。通過在1)PEG 200穩定化(在PEG 400之前)，或2)添加PEG 400之後，或3)與添加PEG3350同時添加NaOH以進行pH中和。
生產並測試本發明的穩定化聚合矽酸鹽組合物之特徵的實驗
無定形的縮合不良的材料
無定形納米矽酸鹽可表現出不同水平的縮合，其不易通過標準技術(如XRD)區分。本發明人觀察到暴露於甚至溫和的溫度(例如60℃)可導致隨時間的縮合的提升，這導致較低的溶解速率(圖3)。該不想要的變化在更高的溫度下特別明顯，如在乾燥中或滅菌過程中所使用的那些，其中甚至短的暴露導致易變性的嚴重降低(圖4)。相對地，本文所描述的合成方法產生穩定的納米顆粒，其是易變的，即在內體是非持續性的(圖5)。用於參照，Ludox為縮合矽酸鹽納米顆粒的實例。圖19示出，雖然Ludox與本發明的納米矽酸鹽具有相近的顆粒尺寸，但其各自不同的溶解速率意味著溶解速率不依賴於尺寸。
小無定形納米矽酸鹽(SANS)的製備
從矽酸鈉的濃縮儲液製備30±3mM的矽酸鹽溶液。然後，使用HCl溶液調節pH至6.8±0.2。pH降低導致無定形聚合矽酸鹽的形成。使該溶液靜置以平衡16小時至24小時，期間將其提升至pH 7.1±0.2。
方法學：當製備時，製備SANS混懸液並立即加熱至60℃。在特定的時間點，將等分試樣收集並使其冷卻至室溫。在初始SANS儲液配製後25小時，將等分試樣在10mM的HEPES緩衝液中稀釋至約1mM並調節到pH 6.7至pH 7。使用鉬酸測定以測定可溶性矽酸鹽隨時間的濃度。
鉬酸測定：將100μL的受試溶液或標準物(製備自Sigma Aldrich Si ICP標準物，1000mg/L)以及200μL鉬酸顯色溶液(0.6105g NH4MO7 4H2O，15mL 0.5N H2SO4，85mL H2O)轉移至96孔板中並混合10分鐘。孵育後，檢測吸光度(405nm)使用標準曲線確定可溶性矽酸的濃度。
經PEG穩定化的超小無定形納米矽酸鹽(uSANS)
通過以下製備納米顆粒矽酸鹽的混懸液(0.5M Si)：首先將濃縮的矽酸鈉溶液稀釋(所得pH大於10.5)，之後在少於5秒內通過推注添加濃HCl使pH降低至約1.0。然後將pH提升至pH 3.0並添加1M PEG。然後將這種混懸液稀釋至1M Si(24小時之後)以用於溶解測定。
非穩定化超小無定形納米矽酸鹽(uSANS)
採用與對經PEG穩定化的材料(0.5mM；pH 3)相同的方法，但不添加PEG。
尺寸的可修整性
使用此處所描述的方法，當pH降低時，形成小顆粒(＜5nm；通常＜3.5nm)。然而，可通過提升pH獲得較大的顆粒尺寸。圖6示出了當提升納米顆粒混懸液的pH時顆粒尺寸增長。有用地，可通過選擇合適的pH和濃度確定生長速度。圖7展示了如何通過僅將pH提升至4獲得較慢的生長速率。如上文所陳述的，可通過添加穩定劑(例如PEG，圖8)或稀釋該混懸液停止尺寸的增長。
瞬時尺寸穩定性
生長阻滯劑以依賴於pH的方式(圖9B)提升了亞穩態(圖9A)。這種穩定性提升使得濃縮的無定形矽酸鹽的加工及配製(例如併入凝膠或乳膏劑)成為可能。
在生理條件下的尺寸穩定性
本文所描述的增強的矽酸鹽分散性及穩定性允許在生理pH下的施用高濃度的納米顆粒，而沒有聚集的風險。這使得各種依賴於腸胃外的應用成為可能，如靜脈內(i.v.)或經口遞送，並通過以蔗糖穩定化的矽酸鹽NP說明，當暴露於生理pH下時其保持為分散並較小(圖10)。
併入固體或半固體基質
由乳膏劑中的矽酸鹽顆粒有效釋放矽要求顆粒保持為非附聚的。為了證明這點，通過在併入PEG乳膏劑前的冷凍(圖11)誘導了非穩定化無定形矽酸鹽的附聚。結果是，對於附聚的顆粒，其向與乳膏劑接觸的模擬生理流體釋放的矽顯著較少(圖12)。
如上文所陳述的，為了保持矽酸鹽處於縮合不良的形式，其應保存為水性混懸液。然而，將水性混懸液併入乳膏劑導致顯著的矽酸鹽活性的稀釋因數(通常5至7倍)。另外，鑑於在生理pH(pH 6至pH 8)下非穩定化無定形矽酸鹽在40mM以上不穩定，其在乳膏劑中的最終濃度限制為約8mM。然而，使用本文所描述的穩定化策略，可將高濃度的無定形縮合不良納米顆粒併入PEG乳膏劑並導致更強的活性劑釋放(圖13)。本發明人還發現為了阻止附聚，當通過所有PEG組分將顆粒完全穩定化時，可有利地進行材料的pH調節(圖14)。
TEM分析
使用利用圖14中的合成所製成的軟膏劑進行TEM分析，其中在PEG3350之後添加NaOH。將少量的軟膏劑懸於乙醇中。經超聲後，將一滴此種混懸液置於柵極(grid)上，並在乾燥後，在FEI Tecnai F20場發射槍(field emission gun，FEG)透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)中檢測。在200kV操作Tecnai F20FEG-TEM並為其配備Gatan Orius SC600A CCD照像機及Oxford Instruments X-Max能量色散X射線(energy dispersive X-ray，EDX)光譜儀。利用EDX光譜儀測定的最終Si濃度為83mmol/kg，其指明二氧化矽以及Cu的存在。TEM圖像示出穩定化聚合矽酸鹽的納米顆粒被使其穩定的PEG 3350基質包圍。
鐵的螯合
矽酸鹽穩定化的材料從Fe-DMHP絡合物中移除Fe；在5mM Si(比例1∶625，Fe∶Si)下，所有DMHP從Fe絡合物中解放(圖15)。然而，在穩定化及非穩定化矽酸鹽中，隨著時間DMHP似乎再次與鐵絡合，如通過向Fe-DMHP的波長(289.2nm)的偏移所見(圖16)。
負載銅的Si NP的抗微生物作用
負載銅的矽酸鹽聚合物表現出抗微生物活性，但生長阻滯劑不會消極地影響銅的細菌活性。在穩定化及非穩定化的材料之間沒有明顯區別(圖17)。實踐中，穩定化允許負載銅的矽酸鹽濃度更高，並且穩定劑對效力沒有影響。
用於GI施用的穩定化聚合矽酸鹽組合物
本發明的組合物可經測試以確認其在胃腸道中的表現。暴露於模擬的消化之後，該組合物經歷迅速的變化從而釋放一些矽酸，所述矽酸將會被身體吸收並利用，而存留的矽酸鹽形成更大的顆粒，其會在糞便中安全排出。因此避免了持續性的納米顆粒及同時發生的毒性的風險。
用於i.v.施用的穩定化聚合矽酸鹽組合物
逐步稀釋的穩定化聚合矽酸鹽組合物，所述組合物利用蔗糖在pH 4.0下進行穩定化，將納米顆粒在含有鹽水的試管中於pH 7.4測試，並用更大體積的鹽水平衡，從而模擬靜脈注射。矽酸非常迅速地形成，使得可以安全的腸胃外遞送。在這些條件下為觀察到顆粒形成。但即使發生這種情況，網狀內皮組織系統也會有效地將其清除。對潛在的毒性納米顆粒矽酸鹽的暴露最小。
將穩定化聚合矽酸鹽組合物配製到固體或半固體基質中以用於表面施用
將本發明的穩定化聚合矽酸鹽組合物(任選地摻雜銅)併入羥乙基纖維素凝膠(2％w/w)並用於覆蓋外傷。任選地在乳膏劑中可包括金屬離子如Cu2+或Ag+，以用於提升其抗菌性質。
根據US 5,807,951通過加熱的乳糖處理及顆粒尺寸穩定性
將0.91g的五水和偏矽酸鈉溶解於10ml的UHP水中。在50℃下將9.6g的乳糖溶解於30ml的UHP水中，持續30分鐘。將兩種溶液混合併用0.5M HCl調節至pH 8。將含有約70mM Si的最終材料通過DLS(A)對其顆粒尺寸進行分析。收集一份等分試樣，稀釋至40mM並調節至pH 7以模擬生理條件。還對該稀釋混懸液的顆粒尺寸進行表徵(B)。以在圖2中的相同實驗方案，將最終混懸液(在pH 8下約70mM Si)在200℃下乾燥。
使用金屬離子的溶解性的控制
將可溶性金屬離子加入uSANS分散體(500mM Si，pH 1.5)並在室溫下孵育1小時。圖20示出通過鉬酸測定確定了低水平的金屬抑制uSANS溶解性。
參考文獻
在本說明書中提及的所有文獻通過引用以其整體併入於此。
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