基因工程菌、用其製備重組s-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及該酶的應用的製作方法
2023-05-07 06:30:36
專利名稱：基因工程菌、用其製備重組s-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及該酶的應用的製作方法
基因工程菌、用其製備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及該酶的應用技術領域
本發明屬於生物工程領域，涉及的是一種基因工程菌及其表達製備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的生產方法，以及該酶酶學性質的測定和在L-同型半胱氨酸檢測試劑盒中的應用，具體為基因工程菌、用其製備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及該酶的應用。
背景技術：
同型半胱氨酸(Hcy)即2-氨酸_4_巰基丁酸，也稱高半胱氨酸，是一種含硫胺基酸，參與甲硫氨酸的代謝過程，可被甲基化生產蛋氨酸，或被轉硫化作用生成半胱氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中的重要中間產物，並可釋放到血液中。它涉及亞甲基四氫葉酸還原酶、胱氨醚β合成酶和甲硫氨酸合成酶等多種代謝調節酶；也涉及調節酶的多種輔助因子如葉酸、維生素Β6和維生素Β12。當上述酶基因突變或輔助因子缺乏，會導致甲硫氨酸的代謝產物Hcy的轉化受阻，使血漿中Hcy水平升高。目前研究認為，Hcy水平的升高與心、腦血管及周圍血管動脈粥樣硬化病變有關，並與老年痴呆、腎功能衰竭、流產及糖尿病早亡有關，所以Hcy的體外檢測具有重要的臨床價值，可用於預測腦血管疾病發生的危險性。
目前檢測血漿中Hcy的方法很多，主要有高效液相色譜法(HPLC)、酶聯免疫吸附法(ELISA)。HPLC法操作複雜、耗時且費用較高；ELISA法操作方便、快捷、重複性好，但是大部分操作仍需手工操作，不適合臨床大批量標本同時測定。目前循環酶法測定高半胱氨酸 (Hcy)容易自動化，測定時間短，可以在自動生化分析儀上進行，測定靈敏度高。該方法利用的主要技術原理利用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(AdoHcyase)在三乙羧乙基膦(TECP) 作用下，氧化型同型半胱氨酸轉化為游離型Hcy，游離型Hcy與共價底物S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)催化反應形成蛋氨酸和S腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)。AdoHcy被AdoHcyase水解成腺苷(Ado)和Hcy，生成物Ado立即水解為次黃嘌呤和氨，氨在穀氨酸脫氫酶的作用下，使 NADH轉化為NAD+，樣本中的Hcy的濃度與NADH的變化成正比。
AdoHcyase在Hcy的循環酶法檢測中具有重要的作用，然而目前現有的AdoHcyase 催化AdoHcy水解反應的Km值偏高，生產方法繁瑣，導致在試劑盒配方中，所需酶量偏多，試劑盒成本偏高，一定程度上限制了循環酶法在Hcy檢測中的應用。發明內容
本發明針對現有技術的上述不足，提供一種基因工程菌。
該基因工程菌命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏編號為 CGMCCNo. 56M，保藏日期2011. 12.沈，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該工程菌是通過PCR技術從環境基因組文庫中篩選獲得一高活性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶(AdoHcyase)基因，插入到含有T7強啟動子的PED8質粒中，化學轉化導入大腸桿菌BL21中，獲得高效表達AdoHcyase的基因工程菌。
上述的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因具有SEQ ID. No. 1所示核苷酸序列和由上述核苷酸序列編碼的如SEQ ID. No. 2所示的胺基酸序列。
該基因工程菌菌株的典型培養特徵為形態特徵菌落乳白色，圓形，菌落邊緣整齊，表面光滑，表面和背面顏色一致。
生理生化特徵具有大腸桿菌的生理生化特性，同時插入了 AdoHcyase基因，具有高效表達AdoHcyase特性。
本發明上述的基因工程菌是這樣獲得的
(1)用提取試劑盒從環境中直接提取總DNA，並克隆到載體PUC18上，構建環境基因組文庫；
(2)根據AdoHcyase基因序列設計引物，兩條引物分別為
上遊5，-TTCGTCAACCGGATACGTAAACGCTCTT-3，
下遊5，-AACCTGAAGCCCAATCCGACCCGACAT-3，
(3)應用如上所述引物，應用PCR方法從環境基因組DNA文庫中大量篩選克隆，擴增獲得1. 2kb的AdoHcyase基因片段，並通過測序，確定獲得的片段具有如SEQ ID. No. 1所示核苷酸序列和SEQ ID. No. 2所示胺基酸序列；通過BLAST比對，與報導的嗜酸熱硫化葉菌 (Sulfolobus acidocaldarius DSM 639)的 AdoHcyase 基因具有 98% 的同源性;
(4)步驟( 擴增產物利用回收試劑盒純化回收，回收片段，經amH I和Nco I雙酶切的PED8質粒，形成粘性末端，並於同樣酶切的PED8質粒，T4連接，將AdoHcyase基因片段插入到T7啟動子的下遊，獲得含有AdoHcyase基因的質粒PET28 ；
(5)將步驟(4)獲得的質粒通過化學轉化，轉入大腸桿菌BL21中，塗布含有50 100mg/L卡拉黴素(Kana)抗性的LB平板上，篩選含有轉化子的陽性菌落；
(6)培養步驟(5)所得菌落，提取質粒，PCR擴增，電泳分析，確定陽性菌落含有 AdoHcyase編碼基因的質粒PET28 ；
(7)通過如上步驟，即獲得基因工程菌，該工程菌含有AdoHcyase編碼基因，能夠表達高活性的AdoHcyase。
本發明要解決的另一個技術問題是提供一種上述基因工程菌培養誘導表達純化獲得重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法，製備步驟包括
(1)將保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏編號為CGMCC No. 56M，保藏日期:2011. 12. 26的基因工程菌接入到含有50 200mg/L卡拉黴素(Kana)的2YT或LB液體培養基中，10 37°C培養至0D_為0. 4 0. 8時，然後加入終濃度為0. 1 1. Ommol/L(終濃度即加入後在液體培養基中的濃度)IPTG(異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導，10 37°C繼續培養18 32h ；
或將基因工程菌直接接入到乳糖自誘導培養基中，乳糖含量為0. 1 10% (質量體積濃度即0. 1 10g/100ml)，10 37°C培養24 72h ；
(2)將步驟(1)所得培養液於5000 IOOOOrpm離心20 40min，收集菌體，加入菌體體積1 20倍、pH6. 5 8. 0的磷酸緩衝液，破碎菌體；破碎後在10000 18000rpm 離心20 50min，收集上清液，過陽離子交換樹脂，用0 500mmol/L濃度不同梯度NaCl鹽溶液洗脫；或者過疏水層析，用0 400mmol/L濃度不同梯度NaCl鹽溶液洗脫，分部收集， 回收含有酶活的部分；
(3)在收集含有酶活溶液中加入終濃度為0. 1 5% (質量體積濃度即0. 1 5g/100ml)的保護劑，然後置於_20°C預冷10 50h，再在-40 _60°C、30 1001 下冷凍乾燥M 72h，得到酶製劑即含有重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的酶製劑。
本發明步驟(3)中的保護劑為蔗糖、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、甘油中的一種或兩種。
為了提高酶產量，簡化純化步驟，將該基因克隆到大腸桿菌中進行表達，從而應用於同型半胱氨酸檢測試劑盒，降低試劑盒的生產成本。
所獲的重組AdoHcyase的酶學性質測定是通過以下方法實現的
在反應體系中，加入0. Olmmol/L的水解反應底物AdoHcy，加入一定量重組 AdoHcyase，測定酶催化底物水解生產腺苷(Ado)的量來確定酶活。一個酶活單位定義為在最適pH、37°C條件下，催化lymol AdoHcy水解生成腺苷(Ado)和L-同型半胱氨酸 (L-Hcy)。
腺苷的量是通過高效液相色譜法(HPLC)測定的，HPLC測定條件為柱子C18反相柱，洗脫液水甲醇=95 5(體積比)，含有lmol/L醋酸鈉，pH為4.5，流速lml/min， 檢測波長260nm，以0. 01 0. lmmol/L的腺苷作為外標，獲得反應體系中生產腺苷的量。
最適溫度的測定為在pH 7. 2的120mmol/L磷酸鉀緩衝液中，加入2mM EDTA, 0. Olmmol/L AdoHcy，分別孵育至30、35、40、45、50、55、60、65°C，加入一定量的酶製劑，反應 lOmin，立即加入50 μ 1 5Ν HCLO4,終止反應。取20 μ 1反應液，HPLC分析反應產物腺苷的量。得到最適溫度為55°C。
最適pH 值測定是在 pH 分別為 6. 0,6. 4,6. 8,7. 2,7. 6,8. 0,8. 4,8. 8 的 IOOmmol/L 磷酸鉀緩衝液加入2mM EDTA、0. Olmmol/L AdoHcy，孵育至37°C，加入一定量的酶製劑，37°C 反應lOmin，立即加入50 μ 1 5Ν HCLO4,終止反應。取20 μ 1反應液，HPLC分析反應產物腺苷的量。得到最適PH值為7. 2。
Km值測定是在IOOmmol/L磷酸鉀緩衝液(pH 7. 2)，加入2mM EDTA,然後分成十份， 每份 1ml，分別加入 0. 05,0. 04,0. 03,0. 02,0. 01,0. 005,0. 004,0. 003,0. 002,0. 001mmol/L AdoHcy，孵育至37°C，加入一定量的酶製劑，反應lOmin，立即加入50 μ 15N HCLO4,終止反應。取20 μ 1反應液，HPLC分析反應產物腺苷的量，測定反應速度，利用origins. 0軟體耦合曲線。獲得 Km 值為 0. 009 士0. 0009mmol/L。
本發明通過PCR技術從環境中大量篩選獲得一 AdoHcyase基因片段，其中核苷酸編碼序列含有1248個鹼基對，通過BlAST比對，發現它與報導的嗜酸熱硫化葉菌 (Sulfolobus acidocaldarius DSM 639)的 AdoHcyase 基因具有 98% 的同源性，只有 21 個鹼基序列不同。編碼的胺基酸與前者有13處不同，其中25位Met —Lys，58位Val — Asp， 94 位 His — Arg, 156 位 Lys — His，281 位 Met — Thr, 309 位 Thr — Ser, 314 位 Gln — Asn, 332 位 Asp — Glu, 365 位 Lys — His, 375 位 Tyr — Trp, 378 位 Pro — Ser, 392 位 Ala — Gly, 395位Ile — Leu0胺基酸序列的不同導致該酶空間結構和活性位點發生變化，促使該酶催化水解反應具有不同的特性。
本發明的優點和有益效果
1.本發明的重組AdoHcyase催化S-AdoHcy水解反應的Km值為 0. 009士0. 0009mmol/L,遠低於其他方式如從菠菜葉中的提取的AdoHcyase相應Km值為 0. 04ImM、黃花羽扇豆提取的AdoHcyase相應Km值為0. OllmM獲得的AdoHcyase相應Km，而且該重組AdoHcyase生產方法簡單，產量較高。
2.本發明獲得的重組AdoHcyase催化水解反應活性強，特異性好，抗幹擾能力強， 並且在大腸桿菌得到高效表達，純化方式簡單，可以大規模生產，可以減少在Hcy檢測試劑盒中的用量，縮短反應時間，降低了試劑盒生產成本，有利於同型半胱氨酸酶法檢測的推
3.本發明將所獲基因插入到含有T7強啟動子的PET28的質粒中，並導入到大腸桿菌中，構建產AdoHcyase的大腸桿菌基因工程菌。所獲基因工程菌在IPTG或乳糖誘導下能夠高效的表達AdoHcyase，經過疏水純化或陽離子交換樹脂純化，獲得純酶，並製備成酶乾粉。所述的基因工程菌表達製備AdoHcyase的方法簡單，表達量穩定，可以進行產業化擴大，生產試劑盒所需的大量酶源，廣泛應用於L-同型半胱氨酸檢測試劑盒中。
本發明上述的基因工程菌命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏編號為 CGMCC No. 56M，保藏日期2011. 12.沈，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
具體實施方式
下面通過實施例進一步詳細描述本發明，但本發明不僅僅局限於以下實施例
實施例1
根據文獻中發表的AdoHcyase基因序列，設計引物序列
正向引物5，-TTCGTCAACCGGATACGTAAACGCTCTT-3，
反向引物5，-AACCTGAAGCCCAATCCGACCCGACAT-3，
應用上述引物，利用PCR方法從環境基因組文庫中大量篩選克隆PCR反應體系
10*擴增緩衝液 ΙΟμΙ dNTP 混合物 20μιηο1 引物50pmol模板0.5 pgrTaqDNA 聚合酶 2.5U Mg2+0.15mmol/L
加雙蒸水至100 μ 1 ；
PCR 反應條件-MV 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min, 30 個循環；72°C IOmin, 4 °C ；
取PCR產物10 μ 1，1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，發現有1. 2kb的產物條帶，用DNA回收試劑盒回收該條帶，對該條帶進行測序，並通過測序，確定獲得的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因具有SEQ ID. No. 1所示核苷酸序列和SEQ ID. No. 2所示胺基酸序列。通過BLAST比對，與報導的嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius DSM 639)的AdoHcyase基因具有98%的同源性。
實施例2 將實施例1中獲得的片段，與經BamH I和Nco I雙酶切的PED8質粒進行連接，獲得帶有該片段的PED8質粒。
酶切反應體系為
2 X buffer 10 μ 1、
質粒2μ1、
BamHI 1 μ 1、
NcoI Ιμ 、
雙蒸水6 μ 1
酶切反應條件37°C，14 Mh
連接反應體系為
2 X buffer 10 μ 1、
質粒Ιμ 、
回收片段Ιμ 、
Τ4 1 μ 1
雙蒸水7 μ 1
連接反應條件37°C，14 24h。
將獲得的PED8質粒導入大腸桿菌BL21中；轉化條件為50 μ 1感受態細胞加入 2μ 1質粒，冰浴30min，42°C熱擊90s，然後塗布含100mg/L Kana抗性LB平板，37 °C過夜培養，挑選陽性克隆，即獲得含有AdoHcyase基因的大腸桿菌基因工程菌(保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏編號為 CGMCC No. 5654，保藏日期2011. 12. 26 的)。
實施例3 將實施例2得到的菌株從平板上接種到含有100mg/L Kana的2YT液體培養基中，37°C振蕩培養8h，在細胞密度達到0D_為0. 6，加入終濃度為0. 6mmol/L的 IPTG，30°C培養20h後，停止培養；9000rpm離心20min收集菌體，pH7. 2的200mmol/L磷酸鹽緩衝液清洗菌體1次，加5倍緩衝液破碎菌體，IOOOOrpm離心50min，收集上清液，過陽離子交換樹脂，先用50mmol/L NaCl濃度洗脫，然後分別用100、200、300mmol/L的NaCl濃度洗脫，收集濃度為200mmol/L濃度的NaCl洗脫部分，SDS凝膠電泳，鑑定為純酶。
實施例4 將實施例2得到的菌株從平板上接種到含有200mg/L Kana的LB液體培養基中，25°C振蕩培養10h，在細胞密度達到0D_為0. 8，加入終濃度為0. 3mmol/L的IPTG，培養32h後，停止培養；IOOOOrpm離心20min收集菌體，pH7. 8的200mmol/L磷酸鹽緩衝液清洗菌體2次，加3倍緩衝液破碎細胞，12000rpm離心30min，收集上清液，過疏水層析柱，分別用400、300、200、100mmol/L NaCl濃度洗脫，收集200mmol/L濃度的NaCl洗脫部分， SDS凝膠電泳，鑑定為純酶。
實施例5 將實施例2得到的菌株從平板上接種到含有50mg/L Kana的乳糖自誘導液體培養基中，培養基的組成為胰蛋白腖，0.5%酵母提取物，葡萄糖、4%乳糖、0. 6% NaCl，37°C振蕩培養48h，停止培養，IOOOOrpm離心40min收集菌體，pH6. 0的 200mmol/L磷酸緩衝液清洗菌體2次，加20倍緩衝液破碎細胞，IOOOOrpm離心60min，去除沉澱，將上清液過疏水層析柱，分別用400、300、200、1 OOmmo 1 /L NaCl濃度洗脫，收集200mmol/L NaCl濃度的洗脫部分，SDS凝膠電泳，鑑定為純酶。
實施例6 將實施例3、4、5所得的純酶，加入終濃度為5 %聚乙二醇、1 %甘油，-20°C預冷50h;然後在冷阱溫度為-40°C，壓力為100 下冷凍乾燥Mh，得到重組 AdoHcyase 酶制齊LU
實施例7 將實施例3、4、5所得的純酶，加入終濃度為2%海藻糖，_20°C預冷36h ； 然後在冷阱溫度為_50°C，壓力為301 下冷凍乾燥50h，得到重組AdoHcyase酶製劑。
實施例8 將實施例6、7獲得的重組AdoHcyase酶製劑，測定最適反應溫度，測定方法如下
在pH 7. 2 的 120mmol/L 磷酸鉀緩衝液中，加入 2mM EDTA、0. Olmmol/L AdoHcy，分別孵育至30、35、40、45、50、55、60、65°〇，加入一定量的酶製劑，反應lOmin，立即加入50 μ 1 5Ν HCLO4,終止反應。取20 μ 1反應液，HPLC分析反應產物腺苷的量。HPLC測定條件為柱子C18反相柱，洗脫液水甲醇=95 5，含有lmol/L醋酸鈉，pH為4. 5，流速lml/min， 檢測波長260nm，以0. lmmol/L的腺苷作為外標，測定反應體系中生成腺苷的量。求出不同溫度條件下的反應速度和相對酶活如表1
表1 不同溫度下，AdoHcyase催化AdoHcy水解反應速度
權利要求
1.一種基因工程菌，其特徵在於該基因工程菌命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏編號為CGMCC No. 56M，保藏日期:2011. 12. 26，保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心；是通過PCR技術從環境基因組文庫中篩選獲得一高活性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因，插入到含有T7強啟動子的PED8質粒中，化學轉化導入大腸桿菌 BL21中，獲得高效表達AdoHcyase的基因工程菌。
2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特徵在於所述的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因具有SEQ ID. No. 1所示核苷酸序列和由上述核苷酸序列編碼的如SEQ ID.No.2所示的胺基酸序列。
3.一種利用權利要求1或2所述的基因工程菌製備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法，其特徵在於該水解酶的製備步驟包括(1)將保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，命名為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)，保藏編號為CGMCC No. 56M，保藏日期:2011. 12. 26的基因工程菌接入到含有50 200mg/L卡拉黴素的2YT或LB液體培養基中，10 37°C培養至0D600為 0. 4 0. 8時，然後加入終濃度為0. 1 1. Ommol/L IPTG誘導，10 37°C繼續培養18 32h ；或將基因工程菌直接接入到乳糖自誘導培養基中，乳糖含量為0. 1 10%，10 37°C 培養24 72h ；(2)將步驟(1)所得培養液於5000 IOOOOrpm離心20 40min，收集菌體，加入菌體體積1 20倍、pH6. 5 8. 0的磷酸鹽緩衝液，破碎菌體；破碎後在10000 18000rpm離心20 50min，收集上清液，過陽離子交換樹脂，用0 500mmol/L濃度不同梯度NaCl鹽溶液洗脫；或者過疏水層析，用0 400mmol/L濃度不同梯度NaCl鹽溶液洗脫；分部收集，回收含有酶活的部分；(3)在收集含有酶活溶液中加入終濃度為0.1 5%的保護劑，然後置於-20°C預冷 10 50h，再在-40 -60°c、30 1001 下冷凍乾燥M 72h，得到酶製劑。
4.根據權利要求3所述的重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的製備方法，其特徵在於 步驟(3)中所述的保護劑為蔗糖、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、甘油中的一種或兩種。
5.一種權利要求1所述的重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶在L-同型半胱氨酸檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
基因工程菌、用其製備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及該酶的應用.本發明公開一種基因工程菌，該基因工程菌命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)；是通過PCR技術從環境基因組文庫中篩選獲得一高活性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因，插入到含有T7強啟動子的PET28質粒中，化學轉化導入大腸桿菌BL21中，獲得高效表達AdoHcyase的基因工程菌。本發明還公開了利用上述基因工程菌製備水解酶的方法及水解酶的應用。本發明的水解酶具有Km值為0.009±0.0009mmol/L，遠低於其他方式獲得的AdoHcyase相應Km，而且該重組AdoHcyase生產方法簡單，產量較高的優點。
文檔編號C12R1/19GK102559572SQ20121002792
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月9日 優先權日2012年2月9日
發明者章玉勝, 賈江花, 鄒炳德, 鄒繼華 申請人:寧波美康生物科技股份有限公司