利用大腸桿菌yiat蛋白質的靶蛋白的表面表達方法

2023-05-07 13:46:06 2

利用大腸桿菌yiat蛋白質的靶蛋白的表面表達方法
【專利摘要】本發明涉及靶蛋白的表面表達載體、將利用上述載體的靶蛋白表達在細胞表面的方法及利用上述表面表達載體的靶蛋白的改性方法，上述載體包含DNA，上述DNA中的對已去除C-末端的作為表面錨定基序的YiaT蛋白質進行編碼的基因和對靶蛋白進行編碼的基因以表達成融合蛋白形態的方式相結合。根據本發明，能夠以穩定且高效的方式使高分子量的外源蛋白表達在細胞表面，從而有用地利用於蛋白質陣列、抗體製備、生物轉化過程及外源蛋白的改性。
【專利說明】利用大腸桿菌YIAT蛋白質的靶蛋白的表面表達方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及靶蛋白的表面表達載體、將利用上述載體的靶蛋白表達在細胞表面的方法及利用上述表面表達載體的靶蛋白的改性方法，上述載體包含DNA，上述DNA中的對已去除C-末端的作為表面錨定基序的YiaT蛋白質進行編碼的基因和對靶蛋白進行編碼的基因以表達成融合蛋白形態的方式相結合。
【背景技術】
[0002]細胞表面表達指， 使蛋白質或肽等與適當的表面錨定基序(ancho ring motif)相融合，並從原核細胞至真核細胞表達在各種細胞的表面的一種技術(Lee S.Y.etal.，Trends Biotechnol.,21:45，2003)。這種細胞表面表達的應用範圍非常多樣。例如，能夠將特定蛋白質表達在細胞表面，從而簡單執行肽或抗體、受體(receptor)等的篩選(Franc isco J.A.et al., Proc.Nat 1.Acad.Sc1.USA., 90:10444, 1993)，並能夠使抗原表位(epitope)表達在細胞表面，從而生成能表示強有力的免疫反應的活疫苗(livevaccine)。並且，能夠將精密化學、農藥、醫藥等所需的特定酶表達在細胞表面，從而用作細胞生物催化劑，或者用於分解汙染物質，或者表達能吸附金屬離子的蛋白質，從而也用於生物修復(bioremediation) (Sousa C.et al., Nat.Biotechnol., 14:1017, 1996 ；Chen ff.andMulchandani A., Trends Biotechnol., 16:71，1998)。
[0003]要想通過細胞的複雜的內膜結構成功地表達在細胞表面，首先開發一種能夠穩定且有效地將待表達在細胞表面的外源蛋白移動至細胞表面的表面錨定基序尤為重要。優選地，基序具有如下的理想的性質:(I)具有能通過細胞內膜的分泌信號序列(Signalsequence) ； (2)具有能穩定地附著於細胞外膜表面的祀序列(targeting sequence)或錨定基序(anchoring motif) ； (3)應在不阻礙細胞的生長的範圍內大量表達在細胞表面,從而呈現高的蛋白質的活性；(4)應與蛋白質的大小無關地穩定表達，從而利用於各種領域。
[0004]細胞表面表達方法根據將插入於基序的外源蛋白的位置大致分為N-末端、C-末端或夾心(中央位置)形態。到目前為止使用於大腸桿菌的表面錨定基序有外膜蛋白(LamB> OmpA> OmpC> OmpS> Opr F、PhoE)、脂蛋白(lipoprotein ；Lpp)、自主轉運蛋白(autotransporte r)、表面附屬物(surface appendage)的亞基(subunit)、3層(S-laye r)蛋白質等。尤其，其中，外膜蛋白能夠在三維結構中的向細胞外露出的結構部分展示外源蛋白，因而多用作表面錨定基序。
[0005]但是,大部分細胞表面表達系統具有表達在表面的蛋白質的大小相對受限的限制。據報告，大部分基序用於分子量相對小的肽、抗體、域(domain)、受體等的表達。這應使已插入的外源蛋白的C-末端和N-末端以立體方式位於接近的位置，因而在蛋白質大的情況下，蛋白質的穩定性變低。實際上，在LamB或PhoE的情況下，若插入由50至60種以上的胺基酸組成的外源蛋白，則在結構上受限，從而無法穩定地形成外膜蛋白，在使用大腸桿菌的孔蛋白(porin)的情況下,局限於表位或金屬結合基序(metal bindingmotif)等而被使用，而不是局限於由最高150種的胺基酸組成的蛋白質(Stahl S.andUhlen Μ.，Tren ds Biοtechno1.15:185，1997 ；Kjaergaard K.et al.,App1.Environ.Microbiol.，66:10，2000)。
[0006]最近，正在開發一種能夠將分子量相對大的外源蛋白表達在細胞表面的基序(Lee S.H., et al., Appl.Environ.Microbiol.70:5074, 2004 ；Lee S.H.et al., Biotechnol.Bioeng.90:223, 2005)。但存在表達在細胞表面的量少的缺點。因此，要想以穩定、高活性、高效的方式使分子量大的外源蛋白表達在細胞表面，開發一種新的細胞表面錨定基序是當務之急。
[0007]對此，本發明人為了使高分子量的外源蛋白以穩定且高效的方式表達在細胞表面而銳意研究，其結果，確認了使用如下設計的表面表達用載體的情況下，能夠將高分子量的外源蛋白穩定且有效地表達在細胞表面，上述表面表達用載體將大腸桿菌的YiaT蛋白質的C-末端被去除的片段用作表面錨定基序，來使YiaT蛋白質的C-末端被去除的片段和靶蛋白相融合而表達，從而完成了本發明。

【發明內容】

[0008]本發明的目的在於，提供找出能使高分子量的外源蛋白以穩定且高效的方式表達在細胞表面的表面錨定基序，並包含上述表面錨定基序的表面表達用載體。
[0009]本發明的再一目的在於，提供由上述表面表達用載體進行轉化的細胞。
[0010]本發明的另一目的在於，提供將靶蛋白表達在細胞表面的方法，其特徵在於，對上述細胞進行培養。 [0011]為了達到上述目的，本發明提供靶蛋白的表面表達載體，其包含DNA，上述DNA中的對已去除C-末端的作為表面錨定基序的YiaT蛋白質進行編碼的基因和對靶蛋白進行編碼的基因以表達成融合蛋白形態的方式相結合。
[0012]本發明還提供由上述表面表達用載體進行轉化的細胞。
[0013]本發明還提供將靶蛋白表達在細胞表面的方法，其特徵在於，對上述轉化的細胞進行培養。
[0014]本發明還提供將靶蛋白表達在細胞表面的方法，上述方法包括:步驟(a)，製備包含DNA的靶蛋白的表面表達載體，上述DNA中的對已去除C-末端的作為表面錨定基序的YiaT蛋白質進行編碼的基因和對靶蛋白進行編碼的基因以表達成融合蛋白形態的方式相結合；步驟(b)，使上述表面表達載體轉化在宿主細胞；以及步驟(C)，對轉化的上述細胞進行培養，並將靶蛋白表達在細胞表面。
[0015]本發明還提供靶蛋白的改性方法，上述改性方法包括:步驟(a)，構建對靶蛋白進行編碼的基因的突變體文庫(mutant library);步驟(b),製備祀蛋白的基因突變體文庫和包含對已去除C-末端的YiaT蛋白質進行編碼的基因的基因重組體，使得上述靶蛋白的突變體以與已去除C-末端的YiaT蛋白質相融合的狀態進行表達；步驟(C)，由上述基因重組體或包含上述基因重組體的載體來對宿主細胞進行轉化；步驟(d)，對轉化的上述宿主細胞進行培養，並將上述基因突變體文庫表達在細胞表面；以及步驟(e)，對具有改性的形質的靶蛋白被表達的細胞進行篩選。
【專利附圖】

【附圖說明】[0016]圖1表示確認YiaT蛋白質表達在細胞外膜的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯氨凝膠電泳(SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate-polyacryIami de gelelectrophoresis)結果，T表不總蛋白(total protein), M表不外膜蛋白(outer membrane protein),箭頭表不YiaT蛋白質。
[0017]圖2為作為本發明的重組質粒重組載體的PTrcYR181、PTrcYR232、pTrcY、PTrcYR181PL,PTrcYR232PL,pTrcYPL,pTrcYR181PLFG,PTrcYR232PLFG 及 pTrcYPLFG 的遺傳圖譜。
[0018]圖3為表示根據本發明表達在細胞表面的脂肪酶(lipase)是否具有活性的固體平板照片。
[0019]圖4為表不根據本發明表達在細胞表面的脂肪酶的有無的蛋白質印跡(Westernblot)照片。
[0020]圖5表示根據pH變化的表達在細胞表面的脂肪酶活性。
[0021]圖6表示根據溫度變化的表達在細胞表面的脂肪酶活性。
【具體實施方式】
[0022]只要不以其他方式定義，那麼在本說明書中所使用的所有技術性術語及科學術語就具有與本發明所屬【技術領域】的普通技術人員通常所理解的含義相同的含義。通常，在本說明書中所使用的命名法為本領域中眾所周知且通用的。
[0023]本發明涉及6?]?64(匪_201591、糖蛋白M6A、glycoprotein M6A)基因，以下對本發明進行詳細說明。
[0024]在本發明中，「靶蛋白」作為本發明所屬【技術領域】的普通技術人員想要生產的蛋白質，意味著向重組表達載體插入對上述蛋白質進行編碼的多核苷酸(polynucleotide),並在轉化體中可表達的所有蛋白質。
[0025]在本發明中，「融合蛋白」意味著原來的外源蛋白的序列的N-末端或C-末端與其他蛋白質相連接，或者追加其他胺基酸而由一個多肽(polypeptide)表達的蛋白質。
[0026]根據一觀點，本發明涉及靶蛋白的表面表達載體，該表面表達載體包含DNA，上述DNA中的對已去除C-末端的作為表面錨定基序的YiaT蛋白質進行編碼的基因和對靶蛋白進行編碼的基因以表達成融合蛋白形態的方式相結合。
[0027]到目前為止，沒有大腸桿菌的YiaT蛋白質的細胞內的功能及細胞內位置相關的實驗報告。在本發明中，在製作細胞表面表達系統之前，為了確認YiaT蛋白質在細胞內的準確的位置，從大腸桿菌W3110 (A TCC 39936)染色體克隆YiaT基因，在大腸桿菌XLl-Blue中進行超表達之後，分離細胞外膜蛋白質分餾，確認在上述細胞外膜蛋白質分餾中是否存在YiaT蛋白質，並確認了 YiaT蛋白質可用作表達在細胞表面的表面錨定基序。
[0028]在本發明的一實施例中，製備包含至YiaT蛋白質的整個胺基酸序列(序列號9)中的第232位胺基酸的YiaT蛋白質片段或包含至第181位胺基酸的表面錨定基序，並製備載體，使得上述表面錨定基序和作為祀蛋白的來源於突光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的脂肪酶能夠分別表達成融合蛋白形態，並轉化在大腸桿菌之後，確認了脂肪酶成功地實現表面表達。
[0029]術語「載體(vector) 」意味著包含以可操作的方式與能在適合的宿主內使DNA表達的適合的調控序列相連接的DNA序列的DNA製備物。載體可以為質粒、噬菌體粒子或簡單的潛在基因組插入物。若轉化成適當的宿主，則載體能夠與宿主基因組無關地複製並起到作用，或者在一些情況下，能夠與基因組其本身合併。質粒為當前載體的最通常所使用的形態，因而在本發明的說明書中，「質粒(plasmid)」及「載體(vector)」有時相互交換地被使用。但是，本發明包含本領域中已公知的或具有與已公知的等同的功能的載體的其他形態。
[0030]「表達調控序列(expression control sequence) 」意味著在特定的宿主生物中以可操作的方式連接的編碼序列的表達所需的DNA序列。這種調控序列包含用於實施轉錄的啟動子、用於調節這種轉錄的任意操縱子序列、對適合的mRNA核糖體結合位點進行編碼的序列以及調節轉錄及解讀的結束的序列。例如，適合於原核生物的調控序列包含啟動子、任意的操縱子序列及核糖體結合位點。真核細胞包含啟動子、多聚腺苷酸化信號(polyadenylation signal)及增強子。在質粒中，對基因的表達量最有影響的因素為啟動子。作為高表達用的啟動子，優選地使用SRa啟動子和來源於巨細胞病毒(cytomegalovirus)的啟動子等。
[0031]為了使本發明的DNA序列表達，能夠將在非常多樣的表達調控序列中的任意一個使用於載體。作為有用的表達調控序列的例，例如包含SV40或腺病毒的初期或後期啟動子、Iac系統、trp系統、TAC或TRC系統、T3及T7啟動子、λ噬菌體的主要操縱子及啟動子區域、fd代碼蛋白的調節區域、3-磷酸甘油酸激酶(3-Phosphoglycerate kinase)或其他甘醇分解酶相關啟動子、上述磷酸酶的啟動子、例如Pho5、酵母α -交配系統的啟動子及原核細胞或真核細胞或用於調節它們的病毒的基因表達的結構和誘導的其他不同序列及它們的多個組合。T7RNA聚合酶啟動子Φ10能夠在Ε.coli中有用地用於使蛋白質NSP表達。
[0032]當核酸和其他核酸序列以功能性關係配置時，核酸「以可操作的方式連接(operably linked)」。這可以為當適當的分子(例如，轉錄活性化蛋白質)與(多個)調控序列相結合時，以能表達基因的方式連接的基因及(多個)調控序列。例如，前序列(pre-sequence)或分泌前導(leader)序列相關DNA在作為參與多肽的分泌的前蛋白質(pro protein)被表達的情況下，以可操作的方式與多肽相關DNA相連接；啟動子或增強子在對序列的轉錄產生影響的情況下，以可操作的方式與編碼序列相連接；或者核糖體結合位點在對序列的轉錄產生影響的情況下，以可操作的方式與編碼序列相連接；或者核糖體結合位點在以容易翻譯的方式配置的情況下，以可操作的方式與編碼序列相連接。通常，「以可操作的方式連接的」意味著連接的DNA序列相接觸，並且，在分泌前導序列的情況下，相接觸且存在於前導框內。但是，增強子(enhancer)無需相接觸。在方便的限制性酶位點，藉助連接(li gation)來執行這些序列的連接。在不存在這種位點的情況下，使用基於通常的方法的合成寡核苷酸銜接物(oligonucleotide adaptor)或接頭(linker)。
[0033] 在本說明書中所使用的術語「表達載體」通常為插入有異種的D NA的片段的重組運載體(recombinant carrier),通常意味著雙鏈的D NA的片段。其中，異種DNA意味著在宿主細胞中未被天然地發現的DNA即異源DNA。表達載體一旦位於宿主細胞內，就能夠與宿主染色體DNA無關地進行複製，能夠複製數個載體，並生成插入的(異種)DNA。
[0034]在本領域中，眾所周知，要想在宿主細胞中提高轉染基因的表達水平，就需要以可操作的方式將相關基因與在所選擇的表達宿主內起到作用的轉錄及解讀表達調控序列相連接。優選地，表達調控序列及相關基因包含在將細菌選擇標記及複製起點(replicationorigin) 一同包含的一個表達載體內。在表達宿主為真核細胞的情況下，表達載體還需要包括在真核表達宿主內有用的表達標記。
[0035]在本發明中，上述已去除C-末端的YiaT蛋白質優選為第232位胺基酸以後的已去除C-末端的蛋白質或第181位胺基酸以後的已去除C-末端的蛋白質。
[0036]尤其，在本發明的一實施例中，在將YiaT蛋白質的整個序列用作表面錨定基序的情況下，如表1所示，因作為靶蛋白的脂肪酶而發生細胞分裂，或者與將已去除C-末端的YiaT蛋白質片段用作表面錨定基序時相比，表面表達的脂肪酶效率明顯下降。
[0037]在本發明中，靶蛋白可以為本發明所屬【技術領域】的普通技術人員所需的所有蛋白質，尤其為醫療、研究用及產業用蛋白質，例如，能夠使選自包含激素、激素類似物、酶、酶抑制劑、信號轉導蛋白質或其一部分、抗體、抗原或其一部分、單鏈抗體、細胞受體、結合蛋白質、結合域、肽、附著蛋白質、結構蛋白質、調節蛋白質、毒素蛋白質、細胞因子、轉錄調節因子、凝血因子及植物生物防禦衍生蛋白質的組中的具有生物學活性的各種外源蛋白表達成靶蛋白。
[0038]根據再一觀點，本發明涉及由上述表面表達載體進行轉化的細胞和將靶蛋白表達在細胞表面的方法，上述方法的特徵在於，對轉化的上述細胞進行培養。
[0039]根據另一觀點，本發明涉及將靶蛋白表達在細胞表面的方法，上述方法包括:步驟(a)，製備包含DNA的靶蛋白的表面表達載體，上述DNA中的對已去除C-末端的作為表面錨定基序的YiaT蛋白質進行編碼的基因和對靶蛋白進行編碼的基因以表達成融合蛋白形態的方式相結合；步驟(b)，使上述表面表達載體轉化在宿主細胞；以及步驟(C)，對轉化的上述細胞進行培養，並將靶蛋白表達在細胞表面。
[0040]在本發明中，開發了一種使大量的靶蛋白穩定地表達在細胞表面的系統，這能夠利用於蛋白質陣列、抗體製備、生物轉化過程及外源蛋白改性等各種生命工程領域。
[0041]根據還一觀點，本發明涉及靶蛋白的改性方法，上述改性方法包括:步驟(a)，構建對靶蛋白進行編碼的基因的突變體文庫；步驟(b)，製備靶蛋白的基因突變體文庫和包含對已去除C-末端的YiaT蛋白質進行編碼的基因的基因重組體，使得上述靶蛋白的突變體以與已去除C-末端的YiaT蛋白質相融合的狀態進行表達；步驟(C)，由上述基因重組體或包含上述基因重組體的載體來對宿主細胞進行轉化；步驟(d)，對轉化的上述宿主細胞進行培養，並將上述基因突變體文庫表達在細胞表面；以及步驟(e)，對具有改性的形質的靶蛋白被表達的細胞進行篩選。
[0042]本發明的特徵在於，上述宿主細胞可選自包含革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、放線菌、酵母菌的組，在上述篩選步驟中，能夠利用靶蛋白的活性、識別標記在靶蛋白的物質的蛋白質、與靶蛋白相結合的被標記的配體或與靶蛋白特異性結合的抗體。
[0043]在本發明的靶蛋白的改性方法中，構建基因庫的步驟能夠利用D NA改組法(Stemmer, Nature, 370:389-91，1994)、StEP 法(Zhao, H., et al., Nat.Biotechnol., 16:258-61，1998)、RPR 法(Shao, Z., et al., Nucleic Acids Res.，26:681-3，1998)、分子育種法(Ness, J.E., et a l., Nat.Biotechnol.17:893-6，1999)、ITCHY 法(Lutz S., et al., Cur.0p1.Biotechnol., 11: 319-24, 2000) > 易錯(error-prone) PCR(Cad well, R.C.，etal., PCR Methods App1., 2:28-33，1992)、點突變法(S ambrook, et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spri ng Harbor, N.Y., 1989)來使野生型革巴蛋白的基因發生變異而得到，但並不局限於此。
[0044]在本發明的靶蛋白的改性方法中，本發明的特徵在於，在上述篩選步驟中，能夠利用靶蛋白的活性、識別標記在靶蛋白的物質的蛋白質、與靶蛋白相結合的被標記的配體或與靶蛋白特異性結合的抗體。並且，在上述篩選步驟中，還可以利用流式細胞儀(Georgiou, G., Ad v Protein Chem.，55:293-315，2000)來實施，在利用蛋白質的活性的情況下，能夠測定蛋白質被表達的宿主的生長，或者測定藉助蛋白質來催化的顯色反應並進行篩選。
[0045]在利用具有如上所述的特徵的本發明的蛋白質的改性方法的情況下，能夠從野生型酶迅速獲得通過現有的方法無法容易獲得的將沒有在生物學上發生的化學反應進行催化的酶(如:狄爾斯-阿爾德(Die ls-Alder)縮合反應)、具有非自然的立體選擇性或區域選擇性(regios electivity)的酶、能夠在有機溶劑或有機溶劑-水溶液以上的溶液中將反應進行催化的酶及在高溫高壓等極端條件下將反應進行催化的酶等。
[0046]實施例
[0047]以下，通過實施例對本發明進行更為詳細的說明。這些實施例僅用於例示本發明，本發明的範圍不能被解釋為受這些實施例的限制，這對於本發明所屬【技術領域】的普通技術人員來說是顯而易見的。即，以下步驟作為一個例示而被說明，本發明的範圍並不局限於此。
[0048]實施例1:確認YiaT蛋白質在細胞內的位置
[0049]到目前為止，沒有 YiaT蛋白質在細胞內的功能和細胞內位置的實驗報告。因此，在製作細胞表面表達系統之前，為了確認YiaT蛋白質在細胞內的準確的位置，使YiaT蛋白質超表達，並分離總蛋白和外膜蛋白，從而用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯氨凝膠電泳進行了分析。為了獲得來源於大腸桿菌的yiaT基因，將大腸桿菌W3110(ATCC39936)染色體(chromosomal DNA)作為模板,並使用序列號I和序列號2的引物，執行了聚合酶鏈式反應(PCR, polymerase chain reaction)(第一次變性在95°C溫度下進行5分鐘,第二次變性在95°C溫度下進行30秒鐘，雜交在55°C溫度下進行I分鐘，延伸在72°C溫度下進行I分30秒鐘，如此反覆30次)。
[0050]序列號1:5-ggaattcATGTTAATTAATCGCAATATTGTG[0051 ]序列號 2: 5-cccaagcttTTAAAAACGCCAGCTCACCCCG
[0052]在利用瓊脂糖凝膠電泳法(agarose gel electrophoresis)來對上述聚合酶鏈式反應的產物進行電泳之後，從瓊脂糖凝膠中分離大小約為741bp的DNA切片，並切割成限制性酶EcoRI和Hindlll。將如此獲得的最終產物與以如下方式獲得的DNA切片相連接，來獲得重組質粒，上述DNA切片是將具有trc啟動子的質粒pTrc99A(Pharmacia Biotech.，Uppsala, Sweden)切割成與上述相同的作為限制性酶的EcoRI和H indIII來獲得的，並且，在利用熱休克(heat shock)方法來導入大腸桿菌XLl-Blue並進行轉化之後，從添加有氨苄青黴素(50 μ g/L)的L B平板培養基中篩選，由此成功地獲得了重組質粒pTrcYE。
[0053]將轉化菌株XLl-Blue (pTrcYE)和作為對照組的XLl-Blue (pTr c99a)接種於添加有氨苄青黴素(50 μ g/L)的IOOmL的LB液體培養基並在37°C溫度下進行培養，當培養液的吸光度在600nm波長下測定為0.4時，以濃度為ImM的方式添加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG, Is opropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside)並誘導了 YiaT 蛋白質的表達。在表達誘導經過4小時之後，在4°C溫度且6000rpm轉速條件下將培養液離心分離5分鐘，來獲得了細胞，在用IOmM Na2HPO4 (pH7.2)溶液清洗之後，用0.2mL的IOmM Na2HPO4 (pH7.2)溶液重新懸浮。利用超聲波法來破壞被懸浮的細胞之後，在室溫條件下以1000Orpm的轉速離心分離2分鐘，從而去除未被破壞的細胞，並重新在18°C溫度且1000Orpm的轉速條件下將上清液離心分離30分鐘，從而將顆粒(pell et)懸浮於0.5mL的0.5%十二烷基肌氨酸鈉(sarcosyl)溶液。在4°C溫度且12000rpm轉速條件下,將該懸浮液離心分離30分鐘,來獲得顆粒之後，用0.5mL的IOmM Na2HPO4 (pH7.2)溶液來重新懸浮，並以相同的條件進行了離心分離。將顆粒懸浮於蒸餾水，來最終獲得細胞的外膜蛋白，並在_20°C條件下保管。利用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯氨凝膠電泳來將這些外膜蛋白和總蛋白按不同分子量大小進行分離，其結果，可知YiaT蛋白質(約27kDa)位於細胞外膜(圖1)。
[0054]實施例2:重組載體pTrcYR232、pTrcYR181及pTrcY的製備
[0055]為了使細胞外膜蛋白表達，製備了三種形態的基序。去除大腸桿菌yiaT基因的C-末端，將大腸杆 菌W3110(ATCC39936)染色體(c hromosomal DNA)用作模板，使用序列號I和序列號3及序列號I和序列號4的引物，來執行聚合酶鏈式反應(第一次變性在95°C溫度下進行5分鐘，第二次變性在95°C溫度下進行30秒鐘，雜交在55°C溫度下進行I分鐘，延伸在72°C溫度下進行I分30秒鐘，如此反覆30次)。並且，利用序列號I和序列號5的引物，來對僅去除終止信號序列(終止密碼子(stop codon))的正常的整個yiaT基因執行了聚合酶鏈式反應。
[0056]序列號3: 5-gctctagaACGATCAATCATCGGGCTGTCGGT [Arg_232]
[0057]序列號4:5-gctctagaACGACGGGACTCACTCTCTGAAAT[Arg_181]
[0058]序列號5: 5-gctctagaAAAACGCCAGCTCACCCCG [f ul I gene]
[0059]用上述聚合酶鏈式反應的產物來執行瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖切片中分別分離大小為約696bp、543bp、741bp的DNA切片，並切割成限制酶EcoRI和Xbal。將如此獲得的最終產物與以如下方式獲得的DNA切片相連接，來獲得重組質粒，上述DNA切片是將具有trc啟動子的質粒pTrc99A(Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)切割成與上述相同的限制酶EcoRI和XbaI來獲得的，並且,在利用熱休克(he at shock)方法來導入大腸桿菌XLl-Blue並進行轉化之後，從添加有氨苄青黴素(SOyg/L)的LB平板培養基中篩選，來去除C末端，插入有對YiaT蛋白質序列中的第232位Arg為止的片段進行編碼的基因片段的重組質粒PTrcYR232及C末端被去除，從而成功地獲得了插入有對YiaT蛋白質序列中的第181位Arg為止的片段進行編碼的基因片段的重組質粒PTrcYR181及插入有對YiaT蛋白質整體進行編碼的基因的重組質粒pTrcY(圖2)。
[0060]實施例3:表達脂肪酶的重組載體 pTrcYR232PL、pTrCYR181PL、pTrcYPL、PTrcYR232PLFG、pTrCYR181PLFG 及 pTrcYPLFG 的製備
[0061]將來源於突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)的脂肪酶表達在細胞表面的重組質粒的製備方法如下:將螢光假單胞菌(Ahn J.H.et al.，J.Bacteriol., 181:1847，1999)的染色體(chromosomal DNA)用作模板，並使用序列號6和序列號7及序列號6和序列號8的引物，來執行了聚合酶鏈式反應(第一次變性在95°C溫度下進行5分鐘，第二次變性在95°C溫度下進行30秒鐘，雜交在55°C溫度下進行30秒鐘，延伸在72°C溫度下進行I分30秒鐘，如此反覆30次)。
[0062]序列號6:5-gctctagaATGCTTCATGCCTTCGAACGC
[0063]序列號7:5_cccaagctttcaactgatcagcacacc
[0064]序列號8:5_cccaagcttttacttgtcgtcatcgtccttgtagtcACTGATCAGCACACC
[0065]用上述聚合酶鏈式反應的產物來執行瓊脂糖凝膠電泳，並從瓊脂糖凝膠分別獲得了大小為約1.4kb和1.5kb的DNA切片即脂肪酶基因和脂肪酶與FLAG尾相融合的形態的基因。這些基因切割成XbaI和H indlll，使在實施例2中製成的質粒插入於pTrcYR232、PTrcYR181 及 pT rcY，來分別製備了重組表達載體 pTrcYR232PL、pTrcYR181PL、pTrcYP L、PTrcYR232PLFG、pTrcYR181PLFG及pTrcYPLFG，並利用熱休克方法來導入大腸桿菌XLl-Blue，從而進行了轉化(圖2)。轉化的菌株是從添加有氨苄青黴素(50 μ g/L)的LB平板培養基中篩選的，將被篩選的菌株培養在LB液體培養基，並保管在_80°C溫度的冰櫃。並且，向其他宿主細胞 XLlO-Gold (Stratagene Cloning System, La Jolla, CA)和 W3110 導入製成的重組表達載體 pTrcYR232PL、pTrcYR181PL、pTrc YPL、pTrCYR232PLFG、pTrCYR181PLFG 及 pTrcYPLFG並進行轉化，從而最終篩選轉化細胞來獲得。
[0066]實施例4:測定表達在細胞表面的脂肪酶的活性
[0067]將在實施例3 中製成的轉化菌株 XLl-Blue (pTrcYR232PL) ,XLl-Blue (pTrcYR181PL)、XLl-Blue (pTrcYPL)、XL I O-Go I d (pTr c YR232P L)、XL I O-Go I d (pTrc YR181PL)、XLlO-Gold (pTrcYPL)、W3110 (pT rcYR232PL)、W3110 (pTrcYR181PL) R W3110 (pTrcYPL)接種於添加有氨苄青黴素(50 μ g/L)的IOOmL的LB液體培養基，並在37 °C溫度下進行了培養。當培養液的吸光度在600nm波長下測定為0.4時，以最終濃度為ImM的方式添加異丙基硫代半乳糖苷，並誘導了脂肪酶基因表達。在表達誘導經過4小時之後，回收培養液，並在4°C溫度且6000rpm轉速條件下離心分離5分鐘，來獲得細胞，在用磷酸鹽緩衝液(PBS，phosphate buffer saline)清洗細胞之後，對於脂肪酶的活性而言，將對硝基苯基癸酸酯(p-nitrophenyl decanoate)用作底物(substr ate),並用分光光度計來測定了生成物的顯色程度(Lee SH, et al., B iotechnol.Bioeng.，90:223，2005)。以 1:4:95 的容積比率分別混合將IOmM對硝基苯基癸酸酯溶解於乙腈(acetonitrile)的溶液、乙醇、50mM三羥甲基氨基甲燒鹽酸鹽(Tris-HCl, Tris (hydroxymethyl) aminome thane-HCl (pH8.0),來製備了底物溶液。向脂肪酶被表達的細胞添加3mL的底物溶液，並在37°C溫度下反應10分鐘之後，添加 2 μ I 的 0.5m M 乙二胺四乙酸(EDAT, Ethylene Diamine Tetraacetic Acid),從而結束了反應。最終，對於脂肪酶活性而言，在405nm波長條件下測定吸光度並進行分析。其結果，XLlO-Gold(pTrcYPL)和W3110(pTrc YPL)在誘導脂肪酶表達之後，細胞生長受到阻礙，且因細胞裂解(c ell lysis)而無法再執行實驗。並且可知，就XLl-Blue (pTrcYPL)而言，雖然在細胞生長方面沒有問題，但表達在細胞表面的脂肪酶非常弱(表1)。
[0068]相反，將yiaT基因片段用作轉化基序的轉化菌株XLl-Blue (pTr c YR232PL)、XLl-Blue (pTrcYR181PL)、XLlO-Gold (pTrcYR232PL)、X LlO-Gold (pTrcYR181PL)、W3110 (pTrcYR232PL)及 W3110 (pTrcYR 181PL)與將整個 yiaT 基因用作基序(pTrcY)的情況相t匕，呈現非常高的脂肪酶活性。可知，在細胞表面表達菌株中，XLlO-Gold呈現為最好，在製成的基序中，YiaTR232最有效且穩定地使脂肪酶展示在細胞表面。
[0069] 並且，可知，在本發明中製成的系統與現有技術中報告的細胞表面表達系統所使用的由OprF及FadL的基序進行轉化的菌株XLl-Blue (pTrcOprFPL)、XLl-Blue(pTrcFadLPL)、XLlO-Gold(pTrcOprFPL)、XLlO-Gold(pTrcFadLPL)、W3110 (pTrcOprFPL)及W3110 (pTrcFa dLPL)相比，非常有效地使脂肪酶表達。
[0070]表1
[0071]脂肪酶表達在表面的重組菌株的脂肪酶活性
[0072]
【權利要求】
1.一種祀蛋白的表面表達載體,其特徵在於,包含DNA,上述DNA中的對已去除C-末端的作為表面錨定基序的YiaT蛋白質進行編碼的基因和對靶蛋白進行編碼的基因以表達成融合蛋白形態的方式相結合。
2.根據權利要求1所述的靶蛋白的表面表達載體，其特徵在於，已去除C-末端的YiaT蛋白質為第232位胺基酸以後的C-末端被去除的蛋白質。
3.根據權利要求1所述的靶蛋白的表面表達載體，其特徵在於，已去除C-末端的YiaT蛋白質為第181位胺基酸以後的C-末端被去除的蛋白質。
4.一種細胞，其特徵在於，由權利要求1至3中任一項所述的載體進行轉化。
5.一種將靶蛋白表達在細胞表面的方法，其特徵在於，對權利要求4所述的轉化的細胞進行培養。
6.—種將革巴蛋白表達在細胞表面的方法,其特徵在於,包括: 步驟(a)，製備包含DNA的靶蛋白的表面表達載體，上述DNA中的對已去除C-末端的作為表面錨定基序的YiaT蛋白質進行編碼的基因和對靶蛋白進行編碼的基因以表達成融合蛋白形態的方式相結合； 步驟(b)，使上述表面表達載體轉化在宿主細胞；以及 步驟(c)，對轉化的上述細胞進行培養，並將靶蛋白表達在細胞表面。
7.根據權利要求6所述的將靶蛋白表達在細胞表面的方法，其特徵在於，已去除C-末端的YiaT蛋白質為第232位胺基酸以後的C-末端被去除的蛋白質。
8.根據權利要求6所述的將靶蛋白表達在細胞表面的方法，其特徵在於，已去除C-末端的YiaT蛋白質為第181位胺基酸以後的C-末端被去除的蛋白質。
9.一種靶蛋白的改性方法，其特徵在於，包括: 步驟(a)，構建對靶蛋白進行編碼的基因的突變體文庫； 步驟(b)，製備靶蛋白的基因突變體文庫和包含對已去除C-末端的YiaT蛋白質進行編碼的基因的基因重組體，使得上述靶蛋白的突變體以與已去除C-末端的YiaT蛋白質相融合的狀態進行表達； 步驟(C)，由上述基因重組體或包含上述基因重組體的載體來對宿主細胞進行轉化； 步驟(d)，對轉化的上述宿主細胞進行培養，並將上述基因突變體文庫表達在細胞表面；以及 步驟(e)，對具有改性的形質的靶蛋白被表達的細胞進行篩選。
10.根據權利要求9所述的靶蛋白的改性方法，其特徵在於，在上述篩選步驟中，利用靶蛋白的活性、識別標記在靶蛋白的物質的蛋白質、與靶蛋白相結合的被標記的配體或與靶蛋白特異性結合的抗體。
【文檔編號】G01N33/53GK104011212SQ201180075951
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2011年12月28日 優先權日:2011年12月27日
【發明者】韓美正 申請人:東洋大學產學協力團