一種透明質酸修飾的新型三元結構非病毒基因傳輸系統及其應用的製作方法
2023-10-05 11:41:54
專利名稱：一種透明質酸修飾的新型三元結構非病毒基因傳輸系統及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術基因治療領域，涉及基因傳輸系統，具體來說涉及一種三元結構的 非病毒基因傳輸系統、製備方法及其應用。
背景技術：
隨著人類基因組計劃對人類基因測序的順利完成，目前己經能夠確定許多的先天性或者 後天性疾病的致病基因，這為人類能夠預防、治療甚至是徹底治癒這些疾病帶來了希望。比 如某些遺傳性疾病的致病基因在發生畸變後，在個體自身無法正常修復的情況下，最佳的辦 法就是將外源性的修復基因或者治療基因導入至病變細胞，通過與宿主細胞核中的染色體DNA
進行整合，穩定長效的表達出相應的功能蛋白，最終治療或者治癒各種疾病。基因治療包括 三個方面的內容，即治療基因、基因傳輸載體和標靶細胞，而其中的基因傳輸載體又是基因 治療中最關鍵的部分。根據來源的不同，常見的基因傳輸載體可分為病毒和非病毒載體兩大 類。儘管病毒載體轉染效率高，是體內基因治療的主要工具，但病毒載體製備工藝複雜，基 因的有效荷載率低，以及一系列的潛在安全性問題(比如機體產生免疫原性反應等等)，使得 病毒載體的發展受到限制。而非病毒載體作為新一代的基因傳輸系統，最近10年發展的很快， 甚至被稱為"人工病毒"。它易於製備和修飾，目的基因荷載量大，免疫原性反應也更低。
非病毒載體分為陽離子脂質載體和陽離子聚合物載體兩大類。作為第一代的陽離子脂質 載體系統，由於它在內含體逃逸以及進入細胞核等關鍵步驟的效果不理想，人們開發了第二 代的非病毒載體系統——陽離子聚合物(polycation)載體。自從上世紀90年代報導聚合物 作為基因載體以來，聚賴氨酸(PLL)，聚乙烯亞胺(PEI)和殼聚糖(Chitosan)等已陸續成 為多聚物基因載體研究的熱門研究領域。陽離子聚合物不含有陽離子脂質體的長脂肪烷鏈， 它有一些特殊的性質，在PEI, PLL等聚合物的骨架單體中含有可質子化的氮原子，荷有大 量的正電荷，有很強的濃縮DNA能力和細胞黏附能力，同時能保護DNA不被血液調理素等成 分降解。陽離子聚合物與DNA所形成的polycation/DNA 二元結構複合物被攝取進入細胞的內 含體後，內含體不斷酸化(pH值約為4.5 5.0)，陽離子聚合物中多數的氨基團可被質子化(比 如25KDa的PEI表觀pKa值為8.5)，使得陽離子聚合物在內含體中有較大的質子緩衝能力， 能發揮"質子海綿"作用，最終成功從內含體中逃逸，並能促進DNA進入細胞核，為提高治療 基因的轉染效率提供了前提保障。但是陽離子聚合物與DNA所形成的二元複合物往往帶有過剩的正電荷，與細胞表面的 粘附沒有特異性，而且大量的正電荷也可能給細胞帶來急性以及延遲的毒副作用。為了解決 陽離子聚合物等非病毒基因傳輸系統的靶向性以及安全性問題，研究人員進行了大量的研究。 譬如在陽離子聚合物上連有針對特定細胞耙向配體(比如葉酸，轉鐵蛋白，半乳糖等等)，提 高polycation/DNA複合物的靶向攝取能力，或者對陽離子聚合物用一些親水性物質進行修飾 (比如PEG)，降低陽離子聚合物外周的正電荷分布，提高複合物的血槳穩定性和降低細胞毒 性等等。
但是非常遺憾，尚沒有一種非病毒基因傳輸系統同時兼有靶向性和親水性，且細胞毒性 較低。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是，克服現有技術的缺點，提供一種同時具有靶向性和親水 性而且細胞毒性低的非病毒基因傳輸系統。同時，本發明還提供該非病毒基因傳輸系統的制 備方法和應用。
我們發現，內源性物質透明質酸(HyaluronicAcid ， HA)是以葡糖醛酸-N-乙醯氨基葡糖為 雙糖單位組成的直鏈高分子多糖，平均分子量為105 10703 ，廣泛存在於機體的多種組織。 HA分子中的每一雙糖單位均含有一個羧基，在生理條件下均可解離成負離子並可與金屬離 子成鹽(比如說透明質酸鈉)，具有水溶性。根據HA分子量以及濃度的不同，HA分子在生 理條件下的水溶液中形成一定的線團網狀結構，可以附著在細胞等物體的周圍。而且許多細 胞表面(比如上皮細胞，巨噬細胞，單核吞噬細胞等)存在有HA的特異性受體(比如CD44 和RHAMM)，且在肺癌等多種腫瘤細胞的表面HA的特異性受體CD44也過量表達，HA可 通過與細胞表面的HA受體發生特異性結合，介導物質進入細胞，並調節細胞的移動以及吞 飲過程。由於HA具有良好的生物相容性，並同時具備親水性和一定的靶向性，利用其對陽 離子聚合物與質粒DNA所形成的二元複合物進行適當的物理修飾，可以同時解決減少細胞 毒性和提高靶向性等關鍵難題。
為解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案
一種非病毒基因傳輸系統，該系統由透明質酸(HA)、陽離子聚合物(polycation)和質 粒DNA組成，其中含有可質子化的氨基單元的陽離子聚合物與含有的可電離的磷酸根離子 的DNA形成二元結構複合物粒子，然後用含有可以電離的羧基的透明質酸進行物理修飾形成三元結構複合物，三者之間通過靜電作用結合。
所述的透明質酸分子量為5~3000KDa，優選範圍為10~1500 KDa。
所述的質粒DNA是各種含報告基因、抗癌基因或細胞因子基因的能在真核細胞中重組 表達的質粒DNA。
所述陽離子聚合物為含有可質子化的氨基的聚合物，選自聚乙烯亞胺、殼聚糖或聚賴氨 酸，聚乙烯亞胺的分子量為1.8-100 KDa(優選範圍為1.8-25 KDa)，殼聚糖的分子量為5-200 KDa (優選範圍為10~100 KDa)，聚賴氨酸的分子量為1~200 KDa (優選範圍為2~100 KDa)。
本發明的非病毒基因傳輸系統的製備方法，包括如下步驟將透明質酸、陽離子聚合物
和質粒DNA分別用適當溶媒溶解，配製成所需濃度的溶液，陽離子聚合物與質粒DNA的按 合適的比例混勻，陽離子聚合物和DNA通過靜電作用力自組裝形成二元結構複合物溶液， 然後按照合適的比例加入透明質酸溶液，混勻後即得三元結構的微^t。
所適當溶媒選自磷酸鹽緩衝溶液、氯化鈉溶液、葡萄糖溶液或HBS緩衝液，溶媒pH 值5.0-9.0;透明質酸、陽離子聚合物和質粒DNA的濃度為0.1 10 mg/ml;陽離子聚合物與 DNA的N/P比例(陽離子聚合物中氮原子與DNA中磷酸根的摩爾比例)為0.01-100;透明 質酸與陽離子聚合物的重量比(w/w)為0.05-50;陽離子聚合物與質粒DNA室溫下混勻後 靜置15 60min，後與透明質酸溶液混勻後靜置15~60min。所得微粒粒徑在2微米以下。
其中優選的陽離子聚合物與DNA的N/P為1~50，透明質酸與陽離子聚合物的重量比 (w/w)為1~20。
本發明提供的非病毒基因傳輸系統可以用在轉染包括人體以及動物來源的內皮細胞、上 皮細胞以及腫瘤細胞。
本發明提供的非病毒基因傳輸系統用於製備基因治療藥物。
本發明提供的非病毒基因傳輸系統的給藥方法，可採用口服、注射或者黏膜途徑給藥， 進行體內轉基因實驗。
本發明通過透射電鏡(TEM)以及動態光散射(DLS)表徵載體與DNA複合物的形態 及粒子表面特徵，考察其是否能滿足被細胞內吞的要求。具體步驟見實施例4和5。
本發明通過凝膠阻滯實驗驗證該新型的基因傳輸系統對質粒DNA的荷載及包裹效果， 並通過DNA酶解實驗考察該基因傳輸系統對抗核酸酶降解的能力，進而進一步驗證複合物 在轉染條件下的穩定性。具體實驗步驟見實施例6和7。
本發明用體外細胞轉染實驗，驗證該新型三元結構非病毒基因傳輸系統的細胞轉染性能。 通過與未加修飾的PE]/DNA 二元複合物的轉染效果進行對比，說明該新型基因傳輸系統的靶向性和提高基因轉染效率的有效性。具體步驟見實施例8。
本發明測試了載體的細胞毒性。聚乙烯亞胺細胞毒性較高，為考察該新型三元結構的非 病毒基因傳輸載體的細胞毒性，採用MTT實驗測試。具體步驟見實施例9。
本發明還將該新型三元結構非病毒基因傳輸載體用於動物的轉基因試驗，結果表明該載 體能有效地將目的基因遞送至靶細胞並能表達出相應的蛋白，發揮基因治療的作用。具體歩 驟參見實施例10和11。
木發明的有益效果包括-
(1) 本發明的非病毒基因傳輸系統同時具有靶向性和親水性，細胞毒性低，大大提高基 因傳輸系統的安全性；
(2) 本發明提供的非病毒基因傳輸系統能將外源性的治療基因更加有效地導入高表達有 HA受體的腫瘤細胞系和腫瘤組織(比如說肺癌和肝癌)，能夠抑制惡性腫瘤的生長，使得該 新型基因傳輸系統更加具有腫瘤靶向性和腫瘤治療的有效性；
(3) 本發明提供的聚合物具有廣泛的基因適應性，有效荷載的外源DNA大小範圍可以 從幾十bp到幾千kb，克服了病毒載體荷載外源基因量較小的缺點，可用於製備多基因的聯 合轉移以治療腫瘤等疾病的新型基因傳輸載體，同時也可作為平臺技術用於製備治療其他疾 病的基因傳輸系統。
(4) 本發明提供的非病毒基因傳輸系統製備工藝簡便可行，無需特殊的儀器設備，可直 接用於細胞和動物試驗。
說明書附圖
圖1是新型的三元結構非病毒基因傳輸系統——HA/polycation/DNA製備後，用TEM觀 測，所得複合物的物理形態和粒子大小。
其屮，A為三元結構複合物，HA/PEI/DNA=30:3:1
B為二元結構複合物，PE1/DNA=3:1
圖2是新型的三元結構非病毒基因傳輸系統——HA/polycation/DNA製備後，用DLS測 定，所得複合物的粒徑大小。
其中，A為三元結構複合物，HA/PEI/DNA=30:3:1B為二元結構複合物，PEI/DNA=3:1
圖3是新型的三元結構非病毒基因傳輸系統——HA/polycation/DNA製備後，凝膠電泳阻 滯實驗結果。
圖中的點樣順序為(右起)
HA/PEI/DNA=5:0.5:1， HA/PE1/DNA= 10:1.0:1, HA/PEI/DNA=15:1.5:1,
HA/PEI/DNA=20:2.0:1, HA/PEI/DNA=25:2.5:1， HA/PEI/DNA=30:3.0:1，
HA/PEI/DNA=40:4.0:1, DNA
圖4是HA/polycation/DNA新型的三元結構非病毒基因傳輸系統轉染H鄰G2細胞後螢光 顯微鏡視圖。
其中，A為三元複合物組，HA/PEI/DNA= 120:12:1; B為陽離子脂質體Lipofectamine2000組； C為裸DNA組;
D為二元複合物組，PEI/DNA=12:1。 圖5是MTT實驗數據圖表，包括PEITHA組和PEI組。
具體實施例
以下內容將結合具體實施例進一步闡述本發明。應充分說明的是，應充分說明的是，這 些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。例如本發明所描述的陽離子聚合物 除聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和殼聚糖外，還應包括其他的具有類似性質的陽離子聚合物，比如 聚醯胺-胺型分枝狀聚合物(PAMAM)和聚精胺酸等，所述陽離子聚合物的分子量也不應局 限於所採用的分T量範圍。作為物理修飾物的透明質酸，其分子量範圍也不局限於實施例中 釆用的範圍，應具備更廣闊的選擇尺度，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明 的適用範圍。
實例1: HA/PE1/DNA三元結構基因傳輸系統的製備
將聚乙烯亞胺，pIRES2-EGFP質粒和透明質酸用PBS緩衝液配成濃度分別為0.1mg/ml， O.lmg/ml和2mg/ml的溶液。將聚乙烯亞胺溶液與pIRES2-EGFP-p53質粒溶液按合適的比例 渦旋混勻10s後，製得PEI/DNA 二元複合物溶液，室溫放置30min後按合適的比例將透明質 酸溶液加入至PEI/DNA二元複合物溶液中，渦旋10s後，即可得三元複合物溶液。實例2: HA/Chitosan/DNA三元結構基因傳輸系統的製備
將殼聚糖適量用PBS溶解，pH值調至5.0，濃度為O.lmg/ml。將pIRES2-EGFP質粒和 透明質酸用PBS緩衝液配成濃度分別為O.lmg/ml和2mg/ml的溶液。將殼聚糖溶液與 pIRES2-EGFP質粒溶液按合適的比例渦旋混勻10s後，製得Chitosan/DNA 二元複合物溶液， 室溫放置30min後按合適的比例將透明質酸溶液加入至Chitosan/DNA 二元複合物溶液中，渦 旋10s後，即可得三元複合物溶液。
實例3: HA/PLL/DNA三元結構基因傳輸系統的製備
將聚賴氨酸，pIRES2-EGFP質粒和透明質酸用PBS緩衝液配成濃度分別為0.1mg/ml， O.lmg/ml和2mg/ml的溶液。將聚乙烯亞胺溶液與pEGFP-Cl質粒溶液按合適的比例渦旋混 勻10s後，製得PLL/DNA 二元複合物溶液，室溫放置30min後按合適的比例將透明質酸溶 液加入至PEI/DNA二元複合物溶液中，渦旋10s後，即可得三兀複合物溶液。
實施例4: HA/PEI/DNA三元結構基因傳輸系統透射電鏡(TEM)觀察
HA/PEI/DNA三元結構複合物的大小和形態可通過負染透射電鏡檢測。按 HA/PEI/DNA=50:5:1以及PEI/DNA=5:1的比例分別製備三元和二元結構複合物，渦旋混合後 室溫靜置30min後，取少量樣品輕輕地滴在專用銅網上。lmin後，將銅網放在醋酸雙氧鈾溶 液(1%, w/w)上染色20s。過量的溶液用吸水紙小心吸除。樣本在JEM-2100透射電子顯微 鏡下觀測，加速電壓100千伏。三元結構複合物在電鏡下呈類圓形顆粒狀，稍不規則，大小 200-250nm左右， 一元結構複合物呈現類圓形，粒徑在100-150nm左右。表明HA/PE]/DNA 三元結構複合物的粒徑相比二元複合物粒子大小要偏大些。(參見圖1)
實例5: HA/PEI/DNA三元結構基因傳輸系統粒徑測定和zeta電位測定
將實例1中的製備方法，按HA/PE1/DNA-30:3:1以及PEI/DNA=3:1的比例分別製備三元 和二元結構複合物，室溫靜置20min後，取100u 1複合物溶液用三次過濾的PBS溶液稀釋到 1000ul，用粒徑和電位測定儀(Marvern， Nano ZS90)進行測定。結果表明三元複合物的水 合粒徑在400nm左右，二元結構複合物的水合粒徑在220nm左右(參見圖2)， zeta電位為-17mv 左右。
實例6: HA/PEI/DNA三元結構基因傳輸系統電泳阻滯試驗
按實例1中HA/PEI/DNA三元結構基因傳輸系統的製備方法，取PEI/DNA的N/P=0，0.5， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5, 3.0， 4.0，應用PBS (pH=7.4)作為溶媒，分別配製二元複合物的溶液，室溫下放置20min。在制各二元複合物的基礎上，按照HA與PEI的質量比為10:1加入2mg/ml 的HA溶液(PBS)，使得溶液的總體積為即可製備得到三元結構的複合物。分別取15pl 進行瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA阻滯情況。電泳條件:0.7%瓊脂糖(含GoldViewer ), 0.5xTBE 緩衝液，電壓90V，電泳時間90min。結果表明當三元複合物N/P達到3時可將質粒DNA完 全阻滯在加樣孔中。(參見圖3)
實例7: HA/PE1/DNA三元結構基因傳輸系統DNase酶解試驗
製備不同N/P/HA比例的PEI/DNA/HA的複合物，然後在反應緩衝液(pH 7.4, 50 mM Tris - HCl， 10 mM NaCl, 10 mM CaCl2， 6 mM MgCl2)中加入1 unit/ u g of DNase I， 37 °C下孵 育lh。孵育後，每個樣品中加入10iiL的EDTA(0.1M)，溶液同時在80°C卜加熱lOmin， 將DNase I滅活。最後加入30uL的肝素(10mg/ml)，渦旋15min將DNA從三元複合物 中競爭解聚出來，隨後進行電泳阻滯實驗，結果表明當N/P/HA比例在3:1:30時，三元複合 物便能保護DNA不被DNase降解。
實例8: HA/PE]/DNA三元結構基因傳輸系統細胞轉染試驗
人肝癌細胞HepG2以適宜濃度接種於培養瓶中，加入含10呢胎牛血清、100U/ml的青黴 素、100U/ml的鏈黴素的DMEM培養液，置於37。C恆溫、5%C02及飽和溼度的培養箱屮培 養，細胞呈貼壁生長。每2 3天傳代一次，傳代時用0.02% EDTA消化2 3min，棄去消化 液，加入新培養液吹打均勻，按所需細胞量移入新培養瓶中，添加完全培養液至適量。
轉染前一天，將對數生長期的HepG2細胞接種於24孔板，使得次日細胞融合率達 80%-90%。轉染前4h，將細胞用無血清無雙抗的培養基孵育。將配置好的轉染試劑均勻加入 各孔中，於37。C、 5免C02條件下培養4-6h，後更換有血清無雙抗的培養基，繼續培養24h 或48h，對細胞進行螢光檢測，觀察GFP的表達情況，結果表明HA/PEI/DNA三元結構基因 傳輸系統組的細胞轉染效果與陽性對照組(Lipofectamhie2000)相當，且明顯高於PEI/DNA 二元結構複合物組。(參見圖4)
實例9: HA/PEI/DNA三元結構基因傳輸系統細胞毒性試驗
將處於對數生長期的HepG2細胞用0.02%EDTA消化，製成細胞懸液，分別以1 X 105/ml 細胞濃度加入96孔酶標板內，每孔100^1，設五復孔，置37°C 5% C02孵箱內培養24h左右， 再分別加入終濃度為l、 5、 10、 20、 40、 80和160|ig/ml的PEI或PEI/HA100n]/孔，分別孵 育24h後，每孔加入5mg/ml MTT溶液20|^1，繼續培養4h，棄去全部上清，加入DMSO 100)ll /孔，微型振蕩器上振動5分鐘，使結晶完全溶解，於酶聯儀570nm波長處測定吸光度值(A)，A值越高活細胞數也越多。根據A計算藥物對細胞的活力抑制率。結果表明PEI/HA組的細 胞抑制率要明顯低於PEI組，表明加入HA修飾後降低了基因傳輸系統的細胞毒型。(參見圖 5)
油制重《n加藥組細胞平均吸光值、x麗 抑制率%= (1—對照組細胞平均吸光值)X100%
實例10: HA/PEI/DNA三元結構基因傳輸系統荷瘤小鼠注射給藥轉基因試驗
將Hela細胞株接種於5周齡BALB/C裸鼠腹側皮下，待瘤直徑長至0.3-0.5 cm後，將荷 瘤裸鼠隨機分組，每組5隻，分別為NS (生理鹽水)組、質粒pIRES2-EGFP-p53組、PEI/ pIRES2-EGFP-p53組、HA7PET/ pIRES2-EGFP-p53組。瘤體注射相當5pgDNA質粒的轉染復 合物lOO^il, HA/PEI/DNA =120:12:1。第二天重複注射一次。注射後7天，處死裸鼠，取皮 下腫瘤，用PBS緩衝液(pH7.0)漂洗2次，加入新鮮配製的固定液(2%多聚甲醛0.25%戊 二醛PBS溶液)4(TC固定15 min， PBS漂洗15minx3次。用OCT包埋液包埋腫瘤組織，放 在冷凍切片機內冷凍。切片冷凍後，將切片固定在載玻片上，風乾。用4%甲醛中作用10min， 使切片固定在載玻片上。在漂洗後將載玻片於反應緩衝液中37'C染色4-24h。鏡下觀察結果， 發現pIRES2-EGFP-p53組瘤體組織EGFP有效表達，且明顯高於其他對照組。
將HepG2細胞株接種於裸鼠皮下，建立腫瘤模型，瘤塊長至直徑約0.4cm時，小鼠尾靜 脈內注射攜帶pIRES2-EGFP-p53質粒的PE1/DNA/HA新型三元結構複合物進行基因治療，給 藥量為5ug每周二次共兩周，同時觀察腫瘤形態變化。與NS (生理鹽水)組、質粒 pIRES2-EGFP-p53組、PEI/ pIRES2-EGFP-p53組比較，HA/PEI/ pIRES2-EGFP-p53組腫瘤牛 長明顯受抑，接種後四周，與NS組比較，HA/PEI/pIRES2-EGFP-p53組腫瘤抑制率達46%。
實施例11: HA/PEI/DNA三元結構基因傳輸系統荷瘤小鼠肺部黏膜給藥轉基因試驗
用雄性無胸腺裸鼠構建LM-6骨肉瘤細胞模型，將SAOS-LM6人源骨肉瘤細胞株靜脈注 射後6周肺轉移，8周後可見肺部明顯腫瘤形貌。將荷瘤鼠隨機分組，每組5隻，分別為NS (生理鹽水)組、質粒pIRES2-EGFP-p53組、PE1/ pIRES2-EGFP-p53組、HA/PEI/ pIRES2-EGFP-p53組。將藥液氣霧給藥至肺部黏膜，給藥量為2mg質^/10ml氣霧溶液， HA/PEI/DNA=120:12:1。初次給藥後第三天再次給藥， 一周兩次共6周，然後處死裸鼠，分 離肺部腫瘤並稱重。用PBS緩衝液(pH7.0)漂洗後用OCT包埋液包埋腫瘤組織，放在冷凍 切片機內冷凍。切片冷凍後，用4%甲醛固化，將載玻片在PBS漂洗2次。將載玻片於37'C 染色12h。用PBS漂洗載玻片3次。顯微鏡下觀察結果，發現pIRES2-EGFP-p53組的瘤體組織重量減輕，肺部腫瘤的病灶數也明顯低於其他對照組，腫瘤抑制率約為40%，說明 HA/PEI/DNA新型三元結構基因傳輸系統能有效抑制肺部腫瘤的生長和轉移。
權利要求
1、一種非病毒基因傳輸系統，其特徵在於該系統由透明質酸、陽離子聚合物和質粒DNA組成，含有可質子化的氨基單元的陽離子聚合物與含有的可電離的磷酸根離子的DNA形成二元結構粒子，之後與含有可以電離的羧基的透明質酸形成三元結構複合物，三者通過靜電作用結合。
2、 按權利1要求所述的非病毒基因傳輸系統，其特徵在於，所述的透明質酸分子量為 5~3000KDa。
3、 按權利要求1所述的非病毒基因傳輸系統，其特徵在於，所述的質粒DNA是各種含報告 基因、抗癌基因或細胞因子基因的能在真核細胞屮重組表達的質粒DNA。
4、 按權利要求1所述的非病毒基因傳輸系統，其特徵在於，陽離子聚合物選自聚乙烯亞胺、 殼聚糖或聚賴氨酸，聚乙烯亞胺的分子量為1.8~100KDa，殼聚糖的分子量為5~200KDa，聚 賴氨酸的分子量為l~200KDa。
5、 按權利要求l所述的非病毒基因傳輸系統的製備方法，包括如下步驟將透明質酸、陽離 子聚合物和質粒DNA分別用適當溶媒溶解，配製成所需濃度的溶液，陽離子聚合物與質粒 DNA的按合適的比例混勻，陽離子聚合物和DNA通過靜電作用力自組裝形成二元結構複合 物溶液，然後按照合適的比例加入透明質酸溶液，混勻後即得三元結構的微粒。
6、 按權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，所述適當溶媒選自磷酸鹽緩衝溶液、氯化鈉 溶液、葡萄糖溶液或HBS緩衝液，溶媒pH值5.0-9.0;透明質酸、陽離子聚合物和質粒DNA 的濃度為0.1-10 mg/ral;陽離子聚合物與DNA的N/P比例為0.01~100，透明質酸與陽離子 聚合物的重量比(w/w)為0.05~50;陽離子聚合物與質粒DNA室溫下混勻後靜置15 60min， 後與透明質酸溶液混勻後靜置15 60min。
7、 按權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，陽離子聚合物與DNA的N/P比例優選為 1~50，透明質酸與陽離子聚合物的重量比(w/w)優選為1~20。
8、 按權利要求l所述的非病毒基因傳輸系統在轉染包括人體以及動物來源的內皮細胞、上皮 細胞以及腫瘤細胞中的用途。
9、 按權利要求1所述的非病毒基因傳輸系統在製備基因治療藥物中的應用。
10、 按權利要求1所述的非病毒基因傳輸系統的給藥方法，可採用口服、注射或者黏膜途徑 給藥，進行體內轉基因實驗。
全文摘要
本發明屬於生物技術基因治療領域，涉及一種由透明質酸修飾的三元結構非病毒基因傳輸系統及其製備方法和應用；本發明採用生物相容性能優良的透明質酸作為修飾物，增加非病毒基因傳輸系統的水溶性和降低細胞毒性，同時能依靠腫瘤細胞表面的透明質酸特異性受體介導外源性的治療基因更加有效地進入腫瘤組織，能夠抑制惡性腫瘤生長，使得該新型基因傳輸系統更加具有腫瘤靶向性和腫瘤治療的有效性；本發明提供的透明質酸修飾的新型三元結構非病毒基因傳輸系統的製備工藝簡便可行，無需特殊的儀器設備，能直接用於細胞和動物實驗，是一種可用於製備多基因的聯合轉移以治療腫瘤等疾病的新型基因傳輸載體。
文檔編號A61P35/00GK101417134SQ20081002475
公開日2009年4月29日 申請日期2008年5月13日 優先權日2008年5月13日
發明者韻 盧, 周建平, 靜 姚, 偉 王, 星 王, 穎 範 申請人:中國藥科大學