一種循環腫瘤細胞小鼠模型、其構建方法及應用與流程

2023-05-07 06:03:12

本發明屬於動物基因工程技術領域，具體涉及一種循環腫瘤細胞小鼠模型、其構建方法及應用。

背景技術：

肺癌是中國死亡率最高的癌症，肺癌患者的5年生存率只有8％-10％。近年來在肺癌的診斷和治療上具有許多新的發現，目前對早期肺癌採用外科治療、化療和放療的手段能夠得到良好的效果。但是這些方法對於已經廣泛轉移的iv期肺癌患者並不十分適用，肺癌的播散轉移是導致肺癌死亡率居高不下的重要因素。因此，對肺癌轉移機制和轉移過程的研究是目前肺癌治療研發平臺的迫切需求。

肺癌的轉移方式主要有以下三種：直接擴散、淋巴道轉移和血行轉移。其中血行轉移是轉移程度最大的一種，癌細胞可隨肺靜脈回流到左心後，可轉移到體內任何部位，常見轉移部位為肝、腦、肺、骨骼系統、腎上腺、胰等器官。循環腫瘤細胞(ctcs，circulatingtumorcells)是存在於外周血中的各類腫瘤細胞的統稱，因自發或診療操作從實體腫瘤病灶(原發灶、轉移灶)脫落，大部分ctc在進入外周血後發生凋亡或被吞噬，少數能夠逃逸並錨著發展成為轉移灶，增加惡性腫瘤患者死亡風險。目前，血液中的循環腫瘤細胞是研究癌症轉移的主要方向。由於ctcs數目稀少，取材困難，目前對ctcs的應用主要在體外活檢。

此外，現有技術中，cn103320387a公開了一種建立小鼠可移植乳腺癌實驗性肺轉移模型的方法，將小鼠自髮乳腺癌瘤塊在網篩中研磨，離心沉澱，用培養液調配細胞濃度(1-2)×107cell/ml的腫瘤細胞懸液，每隻小鼠尾靜脈注射腫瘤細胞懸液0.1-0.3ml，常規條件下飼養，正常繁殖25-35天，完成肺部轉移模型。cn105696087a公開了pdx人源腫瘤異種移植模型，是將患者的新鮮腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠上，依靠小鼠提供的微環境進行生長，腫瘤的分化程度、形態特徵、結構特點以及分子特性等與人本身的腫瘤特點更接近。現有技術中還有將ctcs移植到免疫缺陷小鼠體內建成異種移植模型，上述技術都是直接將相關的腫瘤細胞移植到免疫缺陷小鼠體內，其樣本受限於每個病人的個體差異，導致樣本的不同，具有不可重複的特性，不利於後續的研究，不能廣泛的推廣應用。

現有技術人體上皮細胞來源的腫瘤ctc細胞的定義並不明確，從人體中通過抗體標記、識別和分選人體腫瘤ctc細胞常規使用人表皮細胞表面標記物，hepcam(epithelialcelladhesionmolecule)/hcks(cytokeratins)+hcd45-即認定為ctc細胞。然而，通過該方法分析的ctc細胞並不準確，原因如下：1)因為部分的腫瘤ctc細胞在轉移過程中，表皮的表面標記物會丟失，所以通過以上方法分析的腫瘤ctc細胞並不完全覆蓋所有的腫瘤ctc細胞，如丟失表皮表面標記物的腫瘤ctc細胞；2)此外，通過以上方法標記的細胞也可能是脫落到血液中的正常細胞，所以該檢測、分選方法是存在缺陷的。而現有技術中，從人腫瘤小鼠模型中標記、識別和分選人體腫瘤ctc細胞的方法也同樣存在上述問題。

為了解決現有技術中人體腫瘤ctc細胞分析不準確和分選不純的問題，建立一種具有穩定的重複性的小鼠模型用於對癌症轉移機制和轉移過程，獲得高純度的人體腫瘤ctc細胞的研究是一個亟待解決的問題。

技術實現要素：

針對現有技術的不足及實際的需求，本發明提高一種循環腫瘤細胞小鼠模型、其構建方法及應用，所述模型可用於癌症ctcs體內轉移機制和轉移過程的研究，通過流式細胞等技術分析、分離獲得高純度的人體腫瘤ctc細胞。

為達此目的，本發明採用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種循環腫瘤細胞小鼠模型的構建方法，包括如下步驟：

(1)皮下移植：將原代腫瘤組織樣本移植到免疫缺陷小鼠體內，構建原代癌症異種移植模型pdx(patientderivedxenografts)；

(2)採集循環腫瘤細胞：採集步驟(1)所述的原代癌症異種移植模型的外周血中的循環腫瘤細胞；

(3)腎囊膜移植：將步驟(2)採集的循環腫瘤細胞移植到免疫缺陷小鼠的腎囊膜內，即構建成功所述循環腫瘤細胞小鼠模型。

本發明，發現在所述模型小鼠外周血hla陽性細胞中存在hhla+mcd45+雙陽性細胞群，該細胞群可能並非人體腫瘤ctc細胞，該雙陽性細胞群的存在，將導致通過hepcam/hcks+hcd45-標記分選的腫瘤ctc細胞不純，含有非人腫瘤ctc細胞的hhla+mcd45+雜質細胞，而通過本發明所述方法構建的循環腫瘤細胞小鼠模型，其通過二次移植ctcs細胞，建立ctcs來源的肺癌小鼠模型，採用本方法可有效地得到大量ctcs來源的肺癌小鼠模型，且模型來源於同一病人樣本，生物學背景一致，能篩選到純度很高的腫瘤ctc細胞。

本發明中，所述原代腫瘤組織樣本來源於三甲醫院的腫瘤組織樣本庫，所述腫瘤組織樣本需浸泡於rmpi-1640培養基中並保存於冰上運輸，所述原代腫瘤組織樣本優先選擇肉色部分腫瘤組織樣本，其次選擇白色部分腫瘤組織樣本。

本發明中，所述方法還包括對腫瘤組織樣本的前處理，採用濃度為0.5-3％，優選為1％的pbs進行清洗1-5次，優選為2-3次，並將樣本分成三個部分；

所述第一部分用於凍存保種；

所述第二部分用於腫瘤組織切片和免疫組化分析；

所述第三部分用於腫瘤移植備用。

根據本發明，步驟(1)所述的腫瘤為實體瘤，優選為上皮細胞來源的實體瘤，進一步優選為為肺癌、肝癌、胃癌、直腸癌或乳腺癌中的任意一種或至少兩種的組合，最優選為肺癌。

根據本發明，步驟(1)所述的腫瘤組織樣本移植到免疫缺陷小鼠體內需要進行修剪，所述修剪的形狀和大小隻要能夠將腫瘤組織樣本成功移植入免疫缺陷小鼠體內都是可行的，本領域技術人員可以根據需要自行選擇，本發明將所述的腫瘤組織樣本剪成體積為10-30mm3，例如可以是10mm3、12mm3、15mm3、18mm3、20mm3、22mm3、25mm3、28mm3或30mm3，優選為15mm3的腫瘤組織小塊，以及上述數值之間的具體點值，限於篇幅及出於簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述範圍包括的具體點值。

根據本發明，步驟(1)所述的腫瘤組織樣本修剪後採用matrixgel(基質膠)包裹備用。

根據本發明，步驟(1)所述免疫缺陷小鼠為c57bl/6-nu、nod、cb17-scid、nod-scid、c57bl/6-rag1–/–、balb/c-rag2–/–、c57bl/6-il2rg–/–、nsg、nog或nsi中的任意一種或至少兩種的組合，優選為nsi。

根據本發明，步驟(2)所述採集步驟(1)所述的原代癌症異種移植模型的外周血中的ctcs具體包括：處死步驟(1)所述pdx小鼠模型，採集全部外周血，離心收集全部血細胞，加入紅細胞裂解液，離心收集白細胞即得所述循環腫瘤細胞。

根據本發明，步驟(2)所述處死的pdx小鼠模型為步驟(1)將腫瘤組織樣本移植到免疫缺陷小鼠體內後20-80天，例如可以是20天、21天、23天、25天、26天、28天、30天、31天、32天、33天、35天、36天、38天、40天、42天、45天、46天、48天、50天、52天、53天、55天、56天、58天、60天、62天、63天、65天、66天、68天、70天、72天、73天、75天、76天、78天或80天，優選為30-60天，以及上述數值之間的具體點值，限於篇幅及出於簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述範圍包括的具體點值。

根據本發明，所述處死步驟(1)所述pdx小鼠模型只要能夠處死pdx小鼠模型的方式都可行，本領域技術人員可以根據條件自行選擇，本申請採用co2處死小鼠模型。

本發明中，將pdx小鼠模型處死後，取pdx小鼠模型的腫瘤組織，對腫瘤組織樣本的前處理，剪取腫瘤脂質外層肉色部分，採用濃度為0.5-3％，優選為1％的pbs進行清洗1-5次，優選為2-3次，並將樣本分成三個部分；

所述第一部分用於凍存保種；

所述第二部分用於腫瘤組織切片和免疫組化分析；

所述第三部分用於腫瘤移植備用。

根據本發明，所述離心的離心力為100-400g，例如可以是100g、120g、130g、150g、160g、180g、200g、220g、230g、250g、260g、280g、300g、310g、320g、330g、350g、360g、380g或400g，優選為200-350g，進一步優選為300g，以及上述數值之間的具體點值，限於篇幅及出於簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述範圍包括的具體點值。

根據本發明，步驟(3)所述ctcs可以採用pbs進行調節濃度，本申請中的採用的循環腫瘤細胞的濃度為40-300ctcs/μl，例如可以是40ctcs/μl、42ctcs/μl、45ctcs/μl、48ctcs/μl、50ctcs/μl、55ctcs/μl、60ctcs/μl、65ctcs/μl、70ctcs/μl、75ctcs/μl、80ctcs/μl、85ctcs/μl、90ctcs/μl、95ctcs/μl、100ctcs/μl、105ctcs/μl、110ctcs/μl、115ctcs/μl、120ctcs/μl、125ctcs/μl、130ctcs/μl、135ctcs/μl、140ctcs/μl、145ctcs/μl、150ctcs/μl、160ctcs/μl、170ctcs/μl、180ctcs/μl、190ctcs/μl、200ctcs/μl、210ctcs/μl、220ctcs/μl、230ctcs/μl、240ctcs/μl、250ctcs/μl、260ctcs/μl、270ctcs/μl、280ctcs/μl、290ctcs/μl或300ctcs/μl，優選為40ctcs/μl，以及上述數值之間的具體點值，限於篇幅及出於簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述範圍包括的具體點值。

根據本發明，步驟(3)所述循環腫瘤細胞的移植體積為5-20μl，例如可以是5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl或20μl，優選為10μl，以及上述數值之間的具體點值，限於篇幅及出於簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述範圍包括的具體點值。

根據本發明，步驟(3)所述的免疫缺陷小鼠為c57bl/6-nu、nod、cb17-scid、nod-scid、c57bl/6-rag1–/–、balb/c-rag2–/–、c57bl/6-il2rg–/–、nsg、nog或nsi中的任意一種或至少兩種的組合，優選為nsi。

根據本發明，步驟(3)所述移植到腎囊膜內為本領域的常規技術，在此不做特殊限定，本申請採用如下具體方式移植：將免疫缺陷小鼠麻醉，選取小鼠一側腎臟，用青黴素-生理鹽水溼潤腎包囊，用胰島素針吸取細胞重懸液，移植入受體小鼠腎囊膜下，將腎臟放回體腔中，並向體腔中注入適量青黴素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，於傷口塗抹碘酒消毒。

作為優選技術方案，所述循環腫瘤細胞小鼠模型的構建方法，包括如下步驟：

(1)前處理：將肺癌組織樣本採用濃度為0.5-3％的pbs進行清洗1-5次；

(2)皮下移植：將前處理後的肺癌組織樣本剪成體積為10-30mm3的小塊，採用matrixgel包裹，移植到免疫缺陷小鼠體內，構建原代癌症異種移植模型pdx小鼠模型；

(3)採集循環腫瘤細胞：當步驟(2)所述pdx小鼠模型培養20-80天後，用co2處死，採集全部外周血，100-400g離心收集全部血細胞，加入紅細胞裂解液，100-400g離心收集白細胞即得所述循環腫瘤細胞；

(4)腎囊膜移植：將步驟(3)採集的循環腫瘤細胞採用pbs進行調節濃度，調節到濃度為30-50ctcs/μl，將免疫缺陷小鼠麻醉，選取免疫缺陷小鼠一側腎臟，用青黴素-生理鹽水溼潤腎包囊，用胰島素針吸取5-20μl細胞重懸液，移植入受體小鼠腎囊膜下，將腎臟放回體腔中，並向體腔中注入適量青黴素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，於傷口塗抹碘酒消毒，即構建成功所述循環腫瘤細胞小鼠模型。

第二方面，本發明提供一種如第一方面所述的構建方法製備得到的循環腫瘤細胞小鼠模型。

第三方面，本發明提供一種如第二方面所述的循環腫瘤細胞小鼠模型用於製備人體的病理和生理的研究的模型鼠，優選作為腫瘤疾病研究的模型鼠。

本發明中，通過將構建小鼠模型培養60-90天後，採用co2處死小鼠，取小鼠外周血、肺臟、肝臟、脾臟和腫瘤組織，通過流式細胞技術檢測其中的腫瘤細胞的比例和遷移，用於研究ctcs的擴散情況。

第四方面，本發明提供一種如第二方面所述的循環腫瘤細胞小鼠模型的人循環腫瘤細胞的檢測方法，包括如下步驟：將人實體瘤細胞特異表面標記物和所述小鼠模型外周血細胞特異表面標記物進行標記，通過分析技術分析小鼠模型外周血白細胞中人循環腫瘤細胞；

所述人循環腫瘤細胞為人實體瘤細胞特異表面標記物陽性，且所述小鼠模型外周血細胞特異表面標記物陰性的細胞群。

本發明中，所述人實體瘤細胞特異表面標記物陽性為所述人實體瘤細胞特異表面標記物進行了相關的表達，所述小鼠模型外周血細胞特異表面標記物陰性為所述小鼠模型外周血細胞特異表面標記物沒有進行相關表達，同時滿足這兩個條件的細胞群才能確定為所述人循環腫瘤細胞。

根據本發明，所述人實體瘤細胞特異表面標記物為hla(humanleukocyteantigen，人類白細胞抗原)、epcam(epithelialcelladhesionmolecule，上皮細胞粘附分子)、cks(cytokeratins，細胞角蛋白家族)或cd44(clusterofdifferentiation，分化抗原44)中的任意一種或至少兩種的組合，優選為hla。

根據本發明，所述小鼠模型外周血細胞特異表面標記物為cd45(leukocytecommonantigen，白細胞共同抗原)和/或mhci(majorhistocompatibilitycomplexclassimolecule，主要組織相容性複合體i類分子)，優選為cd45。

根據本發明，所述分析技術選自但不限於流式細胞技術和/或免疫組化技術。

第五方面，本發明提供一種製備人循環腫瘤細胞的方法，包括如下步驟：採用分選技術分離如第二方面所述的循環腫瘤細胞小鼠模型中的人循環腫瘤細胞；

所述人循環腫瘤細胞為所述小鼠模型中外周血白細胞中人實體瘤細胞特異表面標記物陽性，且所述小鼠模型外周血細胞特異表面標記物陰性的細胞群；

根據本發明，所述人實體瘤細胞特異表面標記物為hla、epcam、cks或cd44中的任意一種或至少兩種的組合，優選為hla。

根據本發明，所述小鼠模型外周血細胞特異表面標記物為cd45和/或mhci，優選為cd45。

優選地，所述分選技術選自但不限於流式細胞和/或磁珠分選技術。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

(1)本發明方法採用二次移植的方式，將原代腫瘤異種移植模型中的ctcs通過腎囊膜移植到免疫缺陷小鼠體內，可用於研究ctcs體內轉移的機制及擴散情況以及針對ctcs的藥效實驗；

(2)採用本發明所訴的方式，能夠有效地得到大量ctcs來源的肺癌腫瘤模型，且模型來源於同一病人樣本，生物學背景一致，有利於後續實驗的開展。

附圖說明

圖1是本發明通過免疫組化對比肺癌病人原代腫瘤組織和pdx模型腫瘤組織，其中，圖1(a)為通過免疫組化對比肺癌病人原代腫瘤組織和pdx模型腫瘤組織的結果圖，圖1(b)為通過免疫組化分析原代肺癌在pdx小鼠中的轉移情況的結果圖；

圖2是本發明通過流式細胞術分析原代肺癌在pdx小鼠中的轉移情況的結果圖；

圖3是本發明通過流式細胞術分析ctc模型小鼠中腫瘤的生長和轉移情況的結果圖。

具體實施方式

為更進一步闡述本發明所採取的技術手段及其效果，以下結合附圖並通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案，但本發明並非局限在實施例範圍內。

本發明所有動物飼養、繁殖於spf(specificpathogenfree)級別實驗動物中心。

本發明所有原代腫瘤組織樣本來源於三甲醫院的腫瘤組織樣本庫。

實施例1：肺癌pdx模型的構建

1)原代肺癌樣本處理：原代肺癌腫瘤組織樣本來源於三甲醫院的腫瘤組織樣本庫，肺癌樣本需浸泡於rmpi-1640培養基並保存於冰上運輸。獲取腫瘤樣本後，使用pbs(1％p/s)清洗2-3次將樣本分成三份，一份凍存保種；一份進行腫瘤組織切片和免疫組化分析；一份用於腫瘤移植備用。

2)肺癌組織移植與檢測：可通過肝癌樣本大小選擇合適的腫瘤組織移植方式。移植方式如下：

(1)皮下移植：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成15mm3的腫瘤組織小塊，將肺癌腫瘤組織小塊用matrixgel包裹備用，用剪刀在小鼠下腹部一側剪開小口，用鑷子將matrixgel包裹的腫瘤組織塊夾入小口中，用傷口夾將小口縫合；

(2)腎囊膜移植：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成體積為2mm3的腫瘤組織小塊備用；將小鼠麻醉，選取小鼠一側腎臟，在腎包囊上開小口(開口大小與移植管口相當)，用青黴素-生理鹽水溼潤腎包囊，以移植管吸取帶一隻的聚合卵巢並移植入受體小鼠腎囊膜下(遠離手術開口)，將腎臟放回體腔中，並向體腔中注入適量青黴素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，於傷口塗抹碘酒消毒。

實施例2：肺癌pdx模型的多次傳代

肺癌pdx小鼠模型傳代：將實施例1的肺癌pdx小鼠通過co2處死後，取小鼠腫瘤組織，剪取腫瘤組織外層肉色部分，使用pbs(1％p/s)清洗2-3次，將樣本分成三份，一份凍存保種；一份進行腫瘤組織切片和免疫組化分析；一份用於腫瘤移植；

(1)皮下移植：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成15mm3的腫瘤組織小塊，將肺癌腫瘤組織小塊用matrixgel包裹備用，用剪刀在小鼠下腹部一側剪開小口，用鑷子將matrixgel包裹的腫瘤組織塊夾入小口中，用傷口夾將小口縫合；

(2)腎囊膜移植：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成體積為2mm3的腫瘤組織小塊備用；將小鼠麻醉，選取小鼠一側腎臟，在腎包囊上開小口(開口大小與移植管口相當)，用青黴素-生理鹽水溼潤腎包囊，以移植管吸取帶一隻的聚合卵巢並移植入受體小鼠腎囊膜下(遠離手術開口)，將腎臟放回體腔中，並向體腔中注入適量青黴素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，於傷口塗抹碘酒消毒。

所述傳代可以傳代3-5次。

實施例3：肺癌pdx模型的檢測

腫瘤移植30-60天內，co2處死實施例1和實施例2的pdx模型，取小鼠外周血、肺臟、肝臟、脾臟和腫瘤組織，通過流式細胞技術檢測其中的腫瘤細胞的比例(hhla+)和遷移(除腫瘤組織外的器官hhla+細胞比例)，結果如圖1-2所示。

結果分析：從圖1(a)免疫組化的結果顯示pdx小鼠體內的腫瘤和病人腫瘤表達一致的腫瘤標記物(甲狀腺轉錄因子1(ttf1)、細胞角蛋白7(ck7)、天冬氨酸蛋白酶a(napsina)，表明在免疫缺陷小鼠體內傳代後，腫瘤保留原有組織結構特徵。圖1(b)免疫組化結果顯示肺癌可以在免疫缺陷小鼠體內轉移到肺部、脾臟和肝臟等主要器官，可見採用構建pdx模型後再採集ctcs進行移植是可行的。從圖2流式數據圖可知病人原代肺癌可以在免疫缺陷小鼠體內轉移到骨、脾臟、肝臟和肺部。人白細胞抗原(hhla)標記人腫瘤細胞，鼠白細胞共同抗原(mcd45)標記鼠細胞。

實施例4：構建循環腫瘤細胞小鼠模型

(1)前處理：將肺癌組織樣本採用濃度為1％的pbs進行清洗2-3次；

(2)皮下移植：將前處理後的肺癌組織樣本剪成體積為15mm3的小塊，採用matrixgel包裹，移植到免疫缺陷小鼠體內，構建原代癌症異種移植模型pdx小鼠模型；

(3)採集循環腫瘤細胞：當步驟(2)所述pdx小鼠模型培養30-60天後，用co2處死，採集全部外周血，300g離心收集全部血細胞，加入紅細胞裂解液，300g離心收集白細胞即得所述循環腫瘤細胞；

(4)腎囊膜移植：將步驟(3)採集的循環腫瘤細胞採用pbs進行調節濃度，調節到濃度為40ctcs/μl，將免疫缺陷小鼠麻醉，選取免疫缺陷小鼠一側腎臟，用青黴素-生理鹽水溼潤腎包囊，用胰島素針吸取10μl細胞重懸液，移植入受體小鼠腎囊膜下，將腎臟放回體腔中，並向體腔中注入適量青黴素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，於傷口塗抹碘酒消毒，即構建成功所述循環腫瘤細胞小鼠模型。

實施例5：構建循環腫瘤細胞小鼠模型

(1)前處理：將肺癌組織樣本採用濃度為3％的pbs進行清洗2-3次；

(2)皮下移植：將前處理後的肺癌組織樣本剪成體積為10mm3的小塊，採用matrixgel包裹，移植到免疫缺陷小鼠體內，構建原代癌症異種移植模型pdx小鼠模型；

(3)採集循環腫瘤細胞：當步驟(2)所述pdx小鼠模型培養30-60天後，用co2處死，採集全部外周血，400g離心收集全部血細胞，加入紅細胞裂解液，400g離心收集白細胞即得所述循環腫瘤細胞；

(4)腎囊膜移植：將步驟(3)採集的循環腫瘤細胞採用pbs進行調節濃度，調節到濃度為50ctcs/μl，將免疫缺陷小鼠麻醉，選取免疫缺陷小鼠一側腎臟，用青黴素-生理鹽水溼潤腎包囊，用胰島素針吸取5μl細胞重懸液，移植入受體小鼠腎囊膜下，將腎臟放回體腔中，並向體腔中注入適量青黴素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，於傷口塗抹碘酒消毒，即構建成功所述循環腫瘤細胞小鼠模型。

實施例6：構建循環腫瘤細胞小鼠模型

(1)前處理：將肺癌組織樣本採用濃度為0.5％的pbs進行清洗5次；

(2)皮下移植：將前處理後的肺癌組織樣本剪成體積為30mm3的小塊，採用matrixgel包裹，移植到免疫缺陷小鼠體內，構建原代癌症異種移植模型pdx小鼠模型；

(3)採集循環腫瘤細胞：當步驟(2)所述pdx小鼠模型培養30-60天後，用co2處死，採集全部外周血，100g離心收集全部血細胞，加入紅細胞裂解液，100g離心收集白細胞即得所述循環腫瘤細胞；

(4)腎囊膜移植：將步驟(3)採集的循環腫瘤細胞採用pbs進行調節濃度，調節到濃度為30ctcs/μl，將免疫缺陷小鼠麻醉，選取免疫缺陷小鼠一側腎臟，用青黴素-生理鹽水溼潤腎包囊，用胰島素針吸取20μl細胞重懸液，移植入受體小鼠腎囊膜下，將腎臟放回體腔中，並向體腔中注入適量青黴素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，於傷口塗抹碘酒消毒，即構建成功所述循環腫瘤細胞小鼠模型。

由於實施例5-6製備的小鼠模型的結果與實施例4類似，後續的實驗都採用實施例4製備的小鼠模型。

實施例7：循環腫瘤細胞小鼠模型的檢測

將實施例1構建的循環腫瘤小鼠模型，腫瘤移植60-90天內，co2處死小鼠，取小鼠外周血、肺臟、肝臟、脾臟和腫瘤組織，通過流式細胞技術檢測其中的腫瘤細胞的比例(hhla+)和遷移(除腫瘤組織外的器官hhla+細胞比例)，結果如圖3所示。

結果分析：從圖3流式數據圖可知ctcs可以在免疫缺陷小鼠體內長成腫瘤，並且轉移到骨、脾臟、肝臟和肺部。人白細胞抗原(hhla)標記人腫瘤細胞，鼠白細胞共同抗原(mcd45)標記鼠細胞。

申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細方法，但本發明並不局限於上述詳細方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。