透明質酸的雜化協同複合物的製作方法

2023-05-07 09:47:11

專利名稱：透明質酸的雜化協同複合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及基於透明質酸的產品領域。
現有技術下文通常所述的透明質酸，連同它的鹽稱為透明質酸化合物HA，是負電荷直鏈多糖，由n個ニ糖単元(-4GlcUA@ l-3GlcNAc ^ 1-)的重複組成，其中D-葡糖醛酸(GlcUA)和N-こ醯基-D-葡糖胺(GlcNAc)是用交替的@ -1, 3和@ -1, 4糖苷鍵連接的。HA是高水溶性多糖，並且HA溶液表現出非牛頓型粘弾性性能。這些性質取決於分子量(由於HA是線性聚合物，因此，分子量取決於鏈的長度)、濃度、pH和離子強度。由於它的生物學性質和功能，HA具有很高的附加值(它的商業價值大大超過了其它天然多糖)，應用範圍從醫藥方面到藥用化妝品和營養食品。它的粘彈性連同完全沒有毒性或免疫原性(HA的結構在其存在的所有活的有機體中通常是ー樣的)產生多種且廣泛的應用。在很多這些應 用中，性能取決於HA的分子量。對於這一點，當開發HA的製備方法和應用策略吋，HA的平均分子量和多分散性指數Mw/Mn (其測量分子量分布曲線的寬度，其中Mn是數量-平均分子量，定義為樣品中所有聚合物分子的總重量除以分子總數，並且Mw是重量-平均分子量，其考慮存在的分子的變化質量)必須是考慮的金標準。特別地，目前與其分子量相關的HA的多種生物學響應意味著在文中必須使用低分子量HA (L-HA)和高分子量HA (H-HA)。發明描述本發明描述了 L-HA與H-HA之間的協同雜化複合物(cooperative hybridcomplexes)(命名為簡稱L/H-HA)、它們的特性、其製備方法以及其在醫藥、化妝品和食品領域的用途。弱作用力(例如氫鍵或疏水相互作用)能在分子間產生非常穩定的相互作用，如果這些是協同類型。當在分子間可能形成多重鍵時，產生協同性，並且很弱，隨後它們隨機斷裂，但是由於存在完整的鄰位鍵，多重鍵能立即重新形成，所述的鄰位鍵在可用於重新形成的距離處維持鍵的結構組成。溶液中HA分子的特徵在於基於形成疏水鍵和鏈間氫鍵的相互作用的協同現象，並且這些相互作用的協同性取決於鏈的長度，並且因此取決於鏈的分子量。H-HA的長鏈提供它們之間穩定的相互作用，其涉及溶液中存在的所有分子，其產生三維網絡，然而L-HA分子提供不太穩定的相互作用，導致聚集的體系，其沒有同時涉及存在的所有分子，其替代聚簇中的相互作用。溶液中H-HA和L-HA的這種不同方式的聚集引起流變學性能的很大差異，例如HA溶液的粘度，對於很多應用(特別是在醫藥領域中)，這是非常重要的性質。事實上，作為分子量函數的HA溶液的粘度快速下降實際上取決於分子間相互作用的這種不同能力，因此，在相同濃度下，分子量大於I IO6Da的H-HA溶液比分子量在5 IO3至5 IO5Da之間的L-HA溶液具有更高數量級的粘度。由於H-HA長鏈之間相互作用的強的協同性，當L-HA溶於H-HA的粘稠溶液中時，短期內沒有觀察到產生的溶液的粘度的顯著差異，這表明兩種分子群體獨立表現，並且L/H-HA協同雜化聚集體的形成是熱力學不利的過程。只有經過一段時間(數天至數周)，才能觀察到粘度緩慢但持續下降，這不能歸因於水解過程，並且如果L-HA的分子量小於IO5Da,這些效應更明顯。這些溶液理化性質(特別是粘度)的不斷變化使得它們不適合實際應用，其需要不變的流變學特徵。因此，鑑於以上描述，很清楚目前還沒有獲得低分子量透明質酸和高分子量透明質酸之間的協同雜化複合物，所述的複合物具有使得它們能用於所需目的的性質。現在，令人驚訝地發現通過將含有H-HA和L-HA的水溶液一起經過合適配置的熱循環來產生穩定的L/H-HA協同雜化物是可能的。本發明的穩定的L/H-HA協同雜化物溶液的特徵在於粘度不隨時間變化並且顯著低於熱循環之前。這些性能不能僅僅歸因於HA的熱解聚過程。存在四個精密決定L/H-HA複合物形成和它們流變學性質的參數:a)在相同溶液中同時存在兩種類型的HA(L_HA和H-HA)；b)在形成L/H-HA雜化物體系的過程中所用的兩種HA的分子量；c)所用的兩種HA的相對比例；d)溶液所暴露的熱循環的分布。在相同溶液中同時存在兩種類型HA (L-HA和H_HA)是ー個必要條件，因為當進行熱循環，溶液達到足夠高溫度時，產生的能量條件能同時破裂H-HA鏈間的所有相互作用以及L-HA鏈間的所有相互作用，並且在這些條件中不再存在必要條件，因為溶液中分子間產生的弱相互作用是協同型，並且聚合物鏈以獨立的實體表現。接著，當溶液在熱處理循環範圍內冷卻吋，鏈間相互作用開始逐漸重新形成，在這種情況下其在溶液中存在的所有HA分子間(高分子量和低分子量)隨機產生，引起雜化物體系，隨著弱分子間鍵數量的増加，雜化物體系是穩定的，它們的協同性意味著不同分子量的聚合物鏈間產生的相互作用方式不隨時間變化。確認這種機制有效性實際上是，當兩種溶液(ー種L-HA和ー種H-HA)分別進行熱循環，然後冷卻後將它們以相同濃度在溶液中一起混合時，我們沒有觀察到由雜化物系形成引起的粘度的顯著且快速降低，只有在熱循環過程中同時存在兩種分子時才能形成雜化物體系。在構建L/H-HA雜化物體系中所用的HA的分子量精密地決定了它們的流變學特性；所用的L-HA和H-HA之間分子量差異越大，相同濃度時，相比H-HA的粘度，雜化物體系的粘度降低越多。如果L-HA的分子量在I IO4至I IO6Da之間並且H-HA的分子量是以公式MWh-BA ^ MWl_ha/0.9給定時，可以獲得具有粘度降低特徵的協同雜化L/H-HA複合物。L-HA和H-HA的相對比例(決定雜化物的化學計量)相比它們之間雜化的種類引起它們流變學性質的修飾；由於複合物的形成引起的粘度降低隨著所用的L-HA/H-HA化學計量比的増加而增加。通常所述的比值在0.1至10之間，優選0.5至2。本發明的複合物的粘度通常比單獨含有用於形成複合物的H-HA透明質酸的溶液的粘度小1.1至200倍。 引起由含有L-HA和H-HA的溶液開始形成協同雜化L/H-HA體系的熱分布發現，首先將溶液加熱至溫度為80至160°C、優選100至120°C，然後快速冷卻至室溫。從而獲得的L/H-HA雜化物體系隨時間穩定，證明能維持它們的流變學特徵。如已經提及的，本發明的L/H-HA雜化複合物溶液可以易於通過將所需分子量的H-HA和L-HA水溶液混合併且將產生的溶液進行上面所示的熱循環而獲得，優選L-HA溶液的濃度為0.01至50%w/w，而H-HA溶液的濃度為0.01至10%w/w。固態協同雜化L/H-HA複合物可以從含有它們的溶液以多種方式獲得:a)沉澱含有它們的溶液，加入水可混溶的有機溶劑，例如低分子量醇、丙酮等；b)溶劑蒸發；c)噴霧乾燥；d)凍幹。此外，類似於上述那些具有低值動態粘度特徵的協同雜化複合物可以通過高溫熱處理含有低分子量多糖(例如軟骨素、硫酸軟骨素、糊精、環糊精、葡聚糖)的H-HA水溶液而獲得。由於它們流變學特性，協同雜化L/H-HA複合物在某些生物醫學應用中具有很多益處，例如:通過皮內注射HA生物再生皮膚；用於消退與關節炎性障礙相關的病理學狀況的粘度補充技術；膀胱內治療膀胱炎；治療陰道炎性疾病；治療肺泡疾病；治療口腔疾病。與使用協同雜化L/H-HA複合物相關的最重要的優勢是它們的低粘度，在醫學實踐中其允許使用更高濃度的溶液，但在用小口徑針和導管注射或噴霧時仍能充分流動。一旦接觸生物環境，協同雜化L/H-HA複合物作為體系表現出緩慢釋放L-HA和H-HA,因為微環境的 化學複雜性(特徵在於溶液中存在其它種類和細胞結構的巨大表面)容許逐漸分解分子間相互作用，其表現為所述的複合物使得本文從頭開始可獲得L-HA和H-HA，它們是在體內具有不同作用的分子種類，L-HA通過與細胞表面存在的受體相互作用傳遞信號，H-HA作為細胞外基質的重要組成。下面給出了非限制性實施例，描述了協同雜化L/H-HA複合物的製備、特性和用途。實施例1-在不同溫度下製備協同雜化L/H-HA複合物H-HA (MWl.4 IO6Da ；Mw/Mnl.5)和 L-HA (MW3.3 IO4Da ；Mw/Mnl.8)的兩種水溶液是以2%w/v在蒸餾水中製備的，其用於製備表I中給出的多種溶液。將同時含有L-HA和H-HA的這些溶液在高壓釜中進行熱循環，其設定為:a)加熱相在10分鐘內由25°C升至最高溫度；b)維持該溫度特定一段時間(10分鐘或40分鐘)；c)在10分鐘內冷卻溶液至25°C。測定麗和多分散性指數Mw/Mn，使用裝有多檢測器的尺寸排阻色譜系統，所述的多檢測器包括四橋粘度計、折射計、直角光散射檢測器(RALS)和低角光散射檢測器(LALS),專利權歸 American group Viscotek (www.viscotek.com)所有。用 LALS 測量的信號與分子量和濃度成比例，用粘度檢測器測量的信號與樣品濃度和固有粘度成比例，而折射計提供濃度的測量。Viscotek裝置不僅能測量HA的分子量，而且能評價存在的分子群體中分子量的不均一度，通過多分散性指數Mw/Mn描述，通過Viscotek裝置自動計算，並且定義為平均分子量(Mw= 1:衝具/！:凡，其中Hii是分子量Mi的聚合物的質量，並且2 a是聚合物的總質量，設定Hii=Ii具，表達式還可以為Mw= I: ^iMi2/1: ^iMi)和重量-平均分子量(Mn= I: PiMi/1: ini，其中IiiMi是分子量Mi的聚合物的質量，並且SiIii是存在的聚合物的總摩爾數)的比。動態粘度n的測量是在Anton Paar Physica MCR301流變儀上進行的，使用具有同軸圓筒的幾何圖。n是在25°C下以恆定剪切率(^,=2(1)測定的，其在聚合物溶液的牛頓粘度範圍內(相對於Y』，n是常數，並且僅取決於溶液中聚合物的構象)。表權利要求
1.通過在溫度為80°C至160°C進行熱處理同時含有L-HA透明質酸或透明質酸化合物和H-HA透明質酸或透明質酸化合物的溶液製備的穩定的雜化協同L/H-HA複合物，其中L-HA的分子量為I IO4至I IO6Da,並且H-HA的分子量是通過公式MWma彡MWL_m/0.9得到的。
2.權利要求1的穩定的複合物，其中所述的溫度為100°C至120°C。
3.權利要求1和2的雜化協同複合物，其中H-HA和L-HA是以相對量為0.1至10、優選0.5至2存在的。
4.權利要求1-3的L/H-HA複合物，其粘度比單獨含有用於形成複合物的H-HA透明質酸的溶液的粘度小1.1至200倍。
5.權利要求4的L/H-HA複合物，其中除了溶劑和透明質酸之外的其它化學物質也存在於該溶液中。
6.權利要求1-4的L/H-HA複合物，其中所用的溶劑是水。
7.權利要求1的L/H-HA複合物，其中熱處理是在高壓釜中進行的。
8.權利要求1和7的L/H-HA複合物，其中熱處理包括將樣品在最高溫度保持一段時間，所述的時間從10秒至2小時、優選10至30分鐘。
9.權利要求1、7和8的L/H-HA複合物，其中熱處理包括歷經I分鐘至I小時、優選2至10分鐘的時間達到最高溫度。
10.權利要求1、7和8的L/H-HA複合物，其中熱處理包括在最高溫度暴露後歷經I分鐘至I小時、優選2至10分鐘的時 間冷卻溶液。
11.權利要求1至10的L/H-HA複合物，其通過沉澱包含它們的溶液製備為固態。
12.權利要求11的L/H-HA複合物，其中沉澱是通過加入與溶液可混溶的化合物並且用作複合物的非溶劑來獲得的。
13.權利要求12的L/H-HA複合物，其中複合物的非溶劑化合物是水可混溶的有機溶齊U，優選丙酮、甲醇、こ醇、丙醇、異丙醇、丁醇。
14.權利要求1至10的L/H-HA複合物，其通過真空蒸發、噴霧乾燥或凍幹的方式除去溶劑製備為乾燥狀態。
15.權利要求1至14的雜化協同複合物，其中低分子量透明質酸被其它低分子量多糖代替，所述的其它低分子量多糖例如軟骨素、硫酸軟骨素、糊精、環糊精、葡聚糖。
16.權利要求15的雜化協同複合物,其中低分子量多糖表不小於I百萬Da。
17.權利要求1至16的雜化協同複合物作為基於應用該多糖的所有臨床治療中高分子量透明質酸的替代物的用途。
18.權利要求1至16的雜化協同複合物在真皮內生物再生治療中的用途。
19.權利要求1至16的雜化協同複合物在關節內粘性補充治療中的用途。
20.權利要求1至16的雜化協同複合物在膀胱內治療膀胱炎中的用途。
21.權利要求1至16的雜化協同複合物在治療陰道炎性疾病中的用途。
22.權利要求1至16的雜化協同複合物在治療肺泡疾病中的用途。
23.權利要求1至16的雜化協同複合物在治療口腔疾病中的用途。
全文摘要
本發明描述了透明質酸的協同雜化複合物，其簡單經濟的製備方法以及其在醫藥、化妝品和食品領域中的用途。
文檔編號A61K31/728GK103119068SQ201180043030
公開日2013年5月22日 申請日期2011年9月9日 優先權日2010年9月9日
發明者M·德羅薩, A·達戈斯提諾, A·拉加塔, C·斯基拉爾迪 申請人:阿爾特剛股份有限公司