一種與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記及應用的製作方法

2023-04-30 13:40:26 5

專利名稱：一種與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學及遺傳育種技術領域。更具體涉及一種與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記，同時還涉及分子標記在油菜含油量育種中的應用。
背景技術：
油菜是最重要的油料和可再生能源作物之一，其脂肪酸碳鏈長度和結構接近化石柴油，是一種適宜於生產生物柴油的植物油。在當前和今後相當長的時間內，全世界都將面臨食用植物油和化石能源短缺的嚴峻局面 ，因此大幅度增加菜籽油供應總量，是保障全球食物和能源安全的重大需求。作為世界四大油料作物之一，油菜生產對保障我國食用植物油脂和飼用蛋白質的有效供給，對改善食物結構，促進養殖業和加工業發展等諸方面均有重要影響。雖然我國油菜種植面積和產量均居世界第一，但遠不能滿足國內的消費需求，63%左右的食用植物油依賴進口。儘管油料市場需求如此，農民種植油菜的積極性卻不高。造成這種局面的主要原因之一是我國的油菜籽比主要出口國加拿大生產的油菜籽含油量5個百分點左右，且成本高，市場競爭力相對較弱。因此，從保障食物油供給安全和增加農民收入的角度考慮，較大幅度增加單位面積菜籽油的產出量是解決目前狀況的對策之一。我國油菜研究和育種工作具有較深厚的基礎，一些領域處於世界領先地位。油菜高油分育種的途徑主要有多世代的單株選擇、種間雜交、黃籽油菜育種和誘變選育。近年來，隨著基因組學研究取得一系列突破，以分子標記選擇、轉基因和品種分子設計為代表的分子育種技術的成功應用，大大提聞了作物遺傳育種水平。與常規育種相比，該技術可以通過分析與目標性狀基因緊密連鎖的分子標記判斷目的基因的存在與否，並進行精細定位。同時，利用分子標記進行輔助選擇育種，減少了盲目性，縮短育種年限，大大提高了選擇效率。分子標記輔助選擇育種技術的關鍵是與重要農藝性狀緊密連鎖的DNA分子標記的鑑定。美國、日本、西歐各國等國家近年都投入巨資開展這方面的工作。伴隨著水稻，小麥、玉米、棉花、大豆等重要作物的一些農藝性狀的分子標記的開發，利用鑑定到的分子標記進行輔助選擇育種主要包括種質資源的鑑定、基因定位、基因累加或聚合、異源目的基因的篩選和鑑定以及遺傳圖譜的構建等，育種目標包括抗病、抗蟲、抗旱、高產、品質改良等各個方面。隨著生物技術的發展，油菜分子標記的研究日漸受到關注，研究的領域涉及遺傳圖譜的構建、基因標記和基因定位、親緣關係分析、品種純度鑑定、標記輔助選擇等多方面，並取得了重要進展。但與發達國家相比，我國的油菜分子育種研究工作還有較大差距，主要體現在不能有效地發掘和利用種質資源中的有利基因，缺乏有自主智慧財產權及育種價值的基因和標記等。目前常用的分子標記技術大致可分為兩種，一種是基於southern雜交技術，另一種則以PCR技術為核心。Grodzicker等(1974)創立了限制性片段長度多態性(RFLP)標記技術。Botstein等(1980)首先提出用限制性片段長度多態性(RFLP)作為遺傳標記構建遺傳圖譜的設想，從而開創了利用分子標記作為遺傳標記的新時期。隨後幾十種基於分子雜交(如RFLP和微陣列技術等)或PCR (如SSR、IFLP, SNP和InDel等)的DNA分子標記技術陸續建立，大大提高了人們對基因組多樣性、遺傳作圖等的研究效率，並廣泛的應用於植物科學的研究中。大多數重要的農藝性狀均表現數量性狀的遺傳特點，如產量性狀、成熟期、品質、抗旱性等。數量性狀易受環境條件的影響，因此選擇效果不好。傳統育種方法周期長，主要是由數量性狀造成的。由於分子標記技術和數量遺傳學的發展，人們已可將複雜的數量性狀分解為單個的數量性狀基因位點(QTL)，然後像研究質量性狀一樣對控制數量性狀的多個基因進行研究。QTL是在遺傳分離群體的基礎上，藉助分子標記和遺傳圖譜，利用QTL作圖軟體對分離群體的數量性狀表型數據進行分析，從而確定數量性狀基因在染色體上的位置和效應。目前對油菜種子含油量的QTL定位研究也有一些報導，通常檢測出的QTL數目較多，但效應值較小且重複性不好，較難在 油菜育種中應用。本研究通過遺傳分析及QTL定位，旨在篩選對種子含油量具有正向效應的QTL，找到QTL區間內與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記，同時將分子標記用於油菜含油量育種中。

發明內容
本發明目的是在於提供了一種與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記，該分子標記不僅有助於輔助篩選含油量材料，同時也為今後主效QTL的精細定位及克隆奠定基礎，對今後zy036及其衍生品系的含油量性狀育種提供了極大的便利。本發明的另一個目的在於一種油菜含油量性狀的主效基因位點的分子標記的引物，通過該引物擴增得到的分子標記，此分子標記所在的含油量的QTL的貢獻率為21. 75%-22. 91%，加性效應為 I. 23-2. 05。本發明還有一個目的在於提供了一種與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記在油菜高含油量性狀育種中的應用。通過此與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記，可以在苗期預測含油量的高低並進行淘汰，進而可以快速篩選高含油量株系用於油菜含油量育種，輔助育種選擇目標明確，節約成本。為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施一種與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記，其篩選步驟是a)利用在含油量上有極顯著差異的油菜品種zy036 (50%)和51070 (36%)進行雜交，在雜種Fl代利用小孢子技術產生加倍單倍體(DH)代分離群體；b)採用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法)提取親本zy036和51070及DH代分離群體的葉片總DNA，過程中所用到的試劑包括提取液(I. 4M NaCiaOOmM Tris, pH 8.0，20mM EDTA, pH 8. 0，2%CTAB)、苯酚氯仿:異戊醇(25 :24 :1)、氯仿:異戊醇(24 :1)、無水乙Il>75% 乙醇；c)搜集油菜公開資料庫(http://www. ukcrop. net/Brassica DB)的 SSR 並自主開發SSR、IFLP, SNP和InDel引物，對親本DNA進行PCR擴增，產物在變性聚丙烯醯胺凝膠中電泳，染色和顯影后對條帶的大小進行判別，篩選多態性引物。過程中所用到的主要試劑包括Taq酶、dNTP、Tris_base、EDTA、硼酸、尿素、丙烯醯胺、亞甲雙丙烯醯胺、無水乙醇、冰醋酸、反矽化劑、矽化劑、硝酸銀、甲醛、碳酸鈉、硫代硫酸鈉等d)利用多態性引物對DH分尚群體進行分子標記基因型分析,利用Joinmap3. 0軟體(商業途徑獲得)進行遺傳圖譜的構建，作圖參數設為重組率〈O. 4，L0D>1.0。結合其在武漢、陽邏和青海的三個實驗的含油量性狀數據，利用WinQTL Cartographer 2. 5軟體(商業途徑獲得)進行數量性狀位點(QTL)定位，LOD閾值用1000次的置換測驗確定，概率水平P = 0. 05，最後確定在武漢、陽邏和青海的三個實驗的LOD分別為3. 54,2. 93和2. 05。檢測到I個位於染色體A2 (油菜第2連鎖群)控制含油量的QTL。此含油量性狀基因位點(QTL)在武漢和青海的兩個實驗能重複檢測到，而且加性效應和貢獻率都很大，在此QTL峰值(140. 5cM)附近檢測到了一種與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記BrSF34-123 (位於染色體A2的140. 6cM處)。本研究中所用的親本材料為含油量相差近14個百分點的zy036 (50%)和51070(36%)，均由中國農科院油料所生物技 術育種課題組技術人員在王漢中研究員帶領下育成(所有權歸本課題組所有，在公開發表的文章上已介紹，Hu etal. 2009, Plant Cell Rep28:541 - 549)。利用上述技術措施，申請人最終獲得了一種與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記，具體如下BrSF34-123(自主開發的分子標記命名)，該分子標記為SSR標記，位於甘藍型油菜第2連鎖群A2的一個控制含油量的QTL峰值(140. 5cM)附近的140. 6cM處，其引物序列為 BrS F34-123F :5，-CCCCTGCAATTTGTAACCAC-3，,即 SEQ ID NO. 1，BrSF34-123R 5』-CCCTTITGAACAAGGTACGC-3』，即 SEQ ID NO. 2。此 SSR 標記在 zy036 的擴增片段為 129 個鹼基對(bp)，其片段核苷酸序列為SEQ ID NO. 3所示。利用WinQTL Cartographer 2. 5軟體分析，此分子標記所在的含油量的QTL的貢獻率為21. 75%-22. 91%，加性效應為I. 23-2. 05。與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記BrSF34_123在油菜含油量育種中的應用，其步驟是(I)利用zy036高油品系與另一含油量僅為33%左右的品系93275 (所有權歸本課題組所有，在公開發表的文章上已介紹，Hu et al. 2009,Plant Cell Rep 28:541 - 549)雜交後種植F2代；(2)在F2代苗期，用CTAB法提取兩親本zy036、93275及其F2代分離群體的葉片DNA ；(3)用此？2群體的兩親本zy036和93275篩選BrSF34_123的多態性，此分子標記是一個共顯性標記；(4)利用分子標記BrSF34_123對F2代分離群體的基因型進行分子標記輔助(MAS)選擇，保留有zy036條帶的植株；(5)上述保留的油菜植株種子收穫後，用近紅外分析儀測定其含油量。通過鑑定上述主效基因位點，利用分子標記輔助(MAS)選擇得到的高含油量品種，可迅速提高油菜高含油量品種的育種進程。與現有技術相比，本發明具有以下優點本發明首次定位了一種與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記BrSF34_123。傳統育種方法中，表型鑑定要等到收穫種子測定含油量，且受環境影響較大。因此含油量育種不僅費時，而且難度大，成本高。通過此與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記，可以在苗期預測含油量的高低並進行淘汰，進而可以快速篩選高含油量株系用於油菜含油量育種，輔助育種選擇目標明確，節約成本。


圖I為一種zy036X 51070構建的DH群體的含油量表型變異在2010年在武漢、2011年在陽邏和青海的頻率分布圖。結果表明含油量表現分布呈連續性分布，變異分布呈正態分布，且變異範圍很寬，證明含油量屬於數量性狀。圖2 —種甘藍型油菜第2連鎖群A2示意圖。左半部分指示每個標記對應的遺傳圖距，右半部分指示該連鎖群上的標記名稱。
圖3 —種QTLCart2. 5軟體掃描的在甘藍型油菜第2連鎖群A2上含油量主效基因位點(QTL)掃描的LOD曲線圖。此含油量QTL是2010年在武漢和2011年在青海收穫的油菜含油量共同掃描到的QTL。圖4為利用分子標記BrSF34-123 (共顯性)對兩親本zy036、93275及其F2代分離群體的單株進行基因型分析和篩選圖。圖中前兩個Pl和P2分別代表親本zy036和93275，1-46為F2單株編號。
具體實施例方式實施例I.油菜含油量分離群體的構建及性狀測定本實施例中使用的群體為高低含油量親本(含油量分別為50%的zy036和36%的51070)雜交後代一 DH群體。DH分離群體分別2010年在武漢、2011年在陽邏和青海收穫。親本和DH群體種子含油量由近紅外分析儀測定。含油量數據分布結果表明三個實驗的含油量均呈連續性正態分布，且變異範圍很寬，證明含油量屬於數量性狀(圖I)。實施例2.親本zy036、51070和DH分離群體葉片總DNA的提取利用CTAB法提取葉片總DNA，具體步驟如下A.取0. I克葉片鮮樣放入研磨，加700微升提取液研磨，隨即裝入I. 5毫升離心管中置於65° C恆溫水浴60分鐘，其間混合2-3次；B.加等體積的苯酚氯仿異戊醇(25 24 :1，體積比)，輕輕顛倒使其充分混勻；12000rpm離心10分鐘使其分層,輕輕吸取上清液轉入另一 I. 5毫升離心管；加等體積的氯仿異戊醇(24 :1，體積比)重新抽提一次；C.加入I毫升的-20° C預冷無水乙醇，置於-20° C冷凍不超過30分鐘讓DNA析出；12000rpm離心10分鐘，倒掉離心管中乙醇溶液；用75%乙醇(體積比)清洗2 — 3次；倒掉浸泡液，打開離心管蓋置於通風櫥內吹乾；D.乾燥後加入 TE (IOmM Tris, pH 8.0; ImM EDTA, pH 8. 0)溶解 DNA ;紫外分光光度計測定DNA的濃度，於_20°C冰箱中保存備用。實施例3.引物的開發及多態性的篩選申請人:採用的引物包括三類第一類是已發表文章和芸苔屬資料庫中公開的簡單重複序列(SSR)引物序列(http://www. brassica. info/resource/markers/ssr-exchange. php)，包括 BN、BnEMS, BnGMS, BoGMS, BrGMS, BRAS、CB、CNU, EJU, ENA、FITO、16卩、1 、似、祖、01、1^、111&13、8隊81 和sS等許多系列；第二類是申請人根據白菜、甘藍和甘藍型油菜的測序結果，利用MISA軟體對白菜、甘藍和甘藍型油菜全基因組序列進行SSR位點查找，開發簡單重複序列(SSR)引物。利用SOAP軟體的SNP功能對白菜、甘藍和甘藍型油菜全基因組序列進行SNP位點預測，開發單核苷酸多態性(SNP)引物，分別命名為BrSF、BrBAC、P、BoSF、SF、snap、pr和ns系列；第三類是申請人根據甘藍型油菜的差異表達基因，分別利用MISA軟體、Primerf軟體、SOAP軟體的SNP功能和InDel功能，開發簡單重複序列(SSR)、內含子片段長度多態性(IFLP)、單核苷酸多態性(SNP)和插入/缺失(InDel)引物，別命名為GSSR、GIFLP、GSNP和GInDel系列，然後用Primer3. 0軟體設計引物。申請人已經通過生物公司合成了引物8631對。篩選結果表明，有13. 80%引物的擴增產物在雙親間存在長度多態性差異。多態性篩選程序如下(I)從親本中各隨機選擇10株DNA等量混合，作為篩選引物的模板。(2) PCR 反應體系
權利要求
1.一種與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記，其篩選步驟是 a)油菜品種zy036和51070進行雜交，在雜種Fl代利用小孢子技術產生加倍單倍體代分離群體； b)採用十六烷基三甲基溴化銨法提取親本zy036和51070及DH代分離群體的葉片總DNA ； c)搜集油菜公開資料庫的SSR並自主開發SSR、IFLP,SNP和InDel引物，對親本DNA進行PCR擴增，產物在變性或非變性聚丙烯醯胺凝膠中電泳，染色和顯影后對條帶的大小進行判別，篩選多態性引物； d)利用多態性引物對DH分離群體進行分子標記基因型分析，利用Joinmap3.0軟體進行遺傳圖譜的構建，作圖參數設為重組率〈O. 4，L0D>1. 0 ;利用WinQTL Cartographer2.5軟體進行數量性狀位點定位，LOD閾值用1000次的置換測驗確定，概率水平P=0.05，檢測到I個位於油菜第2連鎖群A2控制含油量的QTL，與其性狀緊密連鎖的SSR標記為BrSF34-123，該分子標記位於甘藍型油菜第2連鎖群A2的140. 6cM處，其引物序列為&'SF34-123F :5』-CCCCTGCAAITTGTAACCAC-3』，fcSF34-123R :5』 -CCCTTTTGAACAAGGTACGC-3』 ；此SSR標記在zy036的擴增片段為129個bp，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 3所示。
2.根據權利要求I所述的油菜含油量性狀主效基因位點的分子標記，其特徵在於所述的QTL位點位於甘藍型油菜第2連鎖群A2，對油菜含油量性狀的貢獻率為21. 75%-22. 91%，加性效應為 I. 23-2. 05。
3.權利要求I所述的分子標記在油菜高含油量性狀育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記及應用，一種與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記BrSF34-123，篩選步驟為1)甘藍型油菜品種zy036和51070雜交獲得DH代分離群體；2)設計引物對親本進行多態性篩選，構建遺傳連鎖圖譜；3)通過對DH分離群體進行田間實驗和考種獲得含油量的表型數據；4)結合開發的高密度分子標記遺傳連鎖圖譜，以及分離群體的基因型和含油量表型數據進行QTL檢測，獲得一種與油菜含油量性狀緊密連鎖的分子標記。因此利用該標記進行輔助選擇，可以快速篩選高含油量株系用於油菜含油量育種，育種選擇目標明確，節約成本。
文檔編號C12N15/11GK102766627SQ20121028071
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月8日 優先權日2012年8月8日
發明者劉貴華, 劉靜, 華瑋, 孫美玉, 王新發, 王漢中, 黃順謀 申請人:中國農業科學院油料作物研究所