基於電泳來操控液體中的帶電粒子的方法及器件的製作方法

2023-04-30 06:20:16 2

專利名稱：基於電泳來操控液體中的帶電粒子的方法及器件的製作方法
技術領域：
本發明涉及微流器件領域，特別是涉及一種基於電泳來操控液體中的帶電粒子的方法及器件。
背景技術：
近年來，微流器件，又稱之為晶片實驗室(Lab-on-a-Chip)及微全分析系統(MicroTotal Analysis Systems),由於具有樣品用量少、檢測速度快、實驗成本低、易於自動化、檢測重複率高、和數據質量好等優勢，得到了各個行業的關注。

傳統的液體操作所需的樣品量大、步驟多且繁瑣，而以介質上的電潤溼(Electrowetting-on-dielectric)為基礎的數位化微流器件不僅可以對液體以獨立液滴為控制單位來進行操作，由此來大大增加對多個樣品進行平行處理以及並行檢測的能力；而且，通過對器件包含的電極的控制，還可以對極其微量的液體進行自動化操作，例如液滴的移動、合併、拆分、孵育(incubation)、混合、反應、廢液收集等。由於數位化微流器件上沒有(也不需要)可動部件，因而大大提高了器件及操控的穩定性和可靠性。本申請的發明人在專利號WO 2008/147568的文獻中提出一種多層控制電極結構的微流器件，不僅使得通用型微流器件成為可能，而且，在製作低成本、高質量的微流器件方面，也是一個飛躍；此外，也大大簡化了微流控制過程。然而，該專利文獻(W02008/147568)主要涉及液滴的操作，而對液滴中所含粒子的控制卻未提及，而對液體中的粒子的控制，尤其是帶電粒子的控制，對於樣品製備及生化分析十分重要。電泳是生化分析中的重要手段，它是指液體(或膠狀物)中的帶電粒子在均勻電場的作用下運動的效應。由於液體(或膠體)中懸浮體中不同成分物質的在電場作用下遷移速度的不同，電泳效應可以有效地用於包括DNA、蛋白質、細胞等在內的物質分離，它也可用於對物質分子結構的分析。例如，在正常PH值的溶液裡，細胞通常帶負電，因而向正電極移動；通常紅細胞在lV/cm (每釐米I伏)電場的作用下的移動速度大約為lum/sec (每秒I微米)。電泳在管道微流可以很自然地實現，專利號為WO 2007/032789的文獻描述了在管道微流中利用電泳進行免疫分析的方式。

發明內容
本發明的主要目的是提供一種可以實現對液體中的帶電粒子進行操作和檢測的方法及微流器件。為達上述目的及其他目的，本發明提供的基於電泳來操控液體中的帶電粒子的方法，所述方法用於具有至少兩個電極的微流器件，其至少包括步驟a.在所述兩個電極上分別施加電壓以形成第一電壓差，並在第一持續時間後，改變所述兩個電極上的電壓以形成第二電壓差，並持續第二持續時間，使所述待測液滴中的帶電粒子產生不同位移，以便粒子的分離；其中，第一電壓差與第二電壓差中至少一者的幅度能使待測液滴中至少部分帶電粒子移動。
優選地，多次重複步驟a，則至少一種帶電粒子在液滴中持續向一個電極方向移動，最終滯留在該液滴中臨近該電極的位置處。優選地，所述第一電壓差與第二電壓差的極性相反。優選地，所述第一持續時間與第二持續時間中的一者長於另一者。本發明提供的基於電泳來操控液體中的帶電粒子的微流器件，至少包括第一基底及第二基底；設置於所述第一基底的第一電極結構層及設於所述第一電極結構層表面的第二電極結構層、設置於所述第二基底的第三電極結構層，且第一基底上的電極結構層與第二基底上的電極結構層相對設置，以便兩者之間具有容置液體的空間；其中，在所述第二電極結構層中，兩個電泳電極的寬度範圍在I微米至I毫米之 間、間距範圍在10微米至20毫米之間，其他電極的寬度範圍和間距範圍在100微米至20毫米之間。本發明提供的基於電泳來操控液體中的帶電粒子的方法，其至少包括步驟在前述的微流器件的兩個電泳電極上分別施加極性相反且幅度能使得帶電粒子移動的電壓，使待測液滴中的帶電粒子向極性與自身電荷極性相反的電泳電極方向移動。由上可見，本發明提出了一種基於電泳效應來操控液滴中的帶電粒子(尤其是帶同種電荷的不同粒子)的方法；還提出了一種利用與專利WO 2008/147568所提出的多層控制電極的結構類似的數位化微流器件。在不受理論限制的基礎上，主要利用電泳來對液體介質中的帶電粒子進行操控，可以實現對液體介質中的帶電粒子進行重新分布或分離。與本發明人之前的專利(W0 2008/147568, WO 2009/003184, and PCT/CN2012/070594)結合起來，本發明的數位化微流器件的功能更加完善，很多液體樣品的操作都可以實現，例如液滴產生、移動、合併、混合、分離、位置及大小測量、孵化、和熱處理等，而為了方便於更進一步的分析處理，液體樣品中的帶電粒子也可以被重新分布或分離。本發明使得使用數位化微流系統在複雜液體樣品(如血液、血清、血漿、汗液、唾液、尿液等)中分離和鑑定生物標誌物(如抗體或其他蛋白質、DNA或RNA等)、病毒、細菌和細胞等成為可能。


圖I為本發明的基於電泳來操控液體中的帶電粒子的方法的流程圖；圖2A為本發明的基於電泳來操控液體中的帶電粒子的數位化微流器件的截面示意圖；圖2B是圖2A所示的微流器件的三維圖；圖2C至圖2G展示了一個液滴中的兩種帶不同電荷的粒子在電泳效應下重新分布，以及利用電潤溼效應將液滴一分為二的流程圖；圖3是一個在本發明的數位化微流器件上實現從全血樣品中提取DNA，並在器件上對其進行實時PCR反應的流程圖。其中所有的步驟，包括樣品製備、樣品操作(如加熱、混合及移動)，以及信號測量等，全部在器件上實現。
具體實施例方式以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實施方式
加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基於不同觀點與應用，在沒有背離本發明的精神下進行各種修飾或改變。請參閱圖I至圖3。需要說明的是，本實施例中所提供的圖示僅以示意方式說明本發明的基本構想，遂圖式中僅顯示與本發明中有關的組件而非按照實際實施時的組件數目、形狀及尺寸繪製，其實際實施時各組件的型態、數量及比例可為一種隨意的改變，且其組件布局型態也可能更為複雜。以下先對一些術語予以說明在本發明中，術語「粒子」被用來指微米或納米量級的實體，這些實體可以是天然的，也可以是人工製作的，例如細胞、亞細胞成分、病毒、脂質體(liposome)、納米球、和微米球，或更小的如生物大分子、蛋白質、DNA、及RNA等實體，它也可指與懸浮介質不相融合的液珠，它還可指液體中的小氣泡等。「粒子」的(線性)大小可以從幾納米到幾百微米。 術語「電潤溼(electrowetting)」用來指液體與固體表面接觸角隨所加電場而變化的效應。應當指出，當所加電壓或電場為交流時，「電潤溼」效應和「介電泳」效應同時存在，當電壓或電場的頻率增大時，「介電泳」效應的相對比重也會相應的增強。本發明中不對「電潤溼」效應和「介電泳」效應進行嚴格區分。本發明的主要目的是實現可以對液體試劑中的帶電粒子進行操作和檢測的方法及器件。術語「操作(manipulation)」可以包含以下步驟的一個或多個組合I.選擇(selection)-對包含多種粒子的樣品中的某一種粒子進行分離(isolation)。2.重新排序(reordering)-對粒子的空間位置進行重新安排。3.合併(union)-將兩個或更多粒子在空間上移到相近或相同的位置(有時某個粒子可以包含另一個粒子)。4.分離(separation)-將本來相互接觸、分開一定距離、或在介質中均勻分布的粒子分離開來。5.捕獲(trapping)或聚焦(focusing)-將粒子移動到一個指定的位置,並在某一段時間裡將這些粒子控制在那個位置。作為本發明的另一個具體實現方式，電泳利用均勻電場對粒子產生的力，將帶電粒子(一個、幾個、或幾組)移動到電勢能最低的位置。在本發明的設計中，帶正電的粒子向負電位電極移動，帶負電的粒子向正電位電極移動。出於本公開的目的，術語「微流(miciOfluidic)」指的是可以對至少在一個維度(dimension)的尺度為幾至幾百微米的液體進行操作的器件或系統。出於本公開的目的，術語「液滴(droplet)」指的是和其他部分由空氣或其他氣體、其他(通常指相互不融合的)液體、或固體表面(例如數位化微流器件的內表面)等分離開來的一定量的液體(一種或幾種的混合)。「液滴」的體積範圍很大一般從幾飛升(femtoliter,毫微微升)到幾百微升(microliters)。「液滴」可以有任意的形狀，如球形、半球形、扁狀的圓形、不規則形等。本發明提出了對樣品溶液中的待分析物進行檢測的器件、方法、及系統。熟悉此領域的人都知道，非限制的樣品溶液的例子有體液(包括，但不受限於，血液、血清、血漿、唾液、尿液等);試樣純化液(purified samples)(例如淨化的DNA、RNA、蛋白質等);環境樣品(包括，但不受限於，水、空氣、與農業有關的樣品等)；生物戰劑樣本(biological warfareagent sample)等。其中體液可以是任何生物體的體液,但本發明對哺乳動物尤其是人的體液更有興趣。出於本公開的目的，術語「分析物(analyte)」指的是分析或測試中的待測物質或化學成分。「分析物」可以是有機或無機物質。它可以指生物分子(如蛋白質、脂質、細胞因子、激素、碳水化合物等)，病毒(如皰疹病毒、逆轉錄病毒、腺病毒、慢病毒)，完整細胞(包括原核和真核細胞)、環境汙染物(包括毒素、殺蟲劑等)、藥物分子(如抗生素、治效藥物和藥物濫用、及毒品)，細胞核，孢子，等等。出於本公開的目的，術語「試劑(reagent)」指的是用於與樣品材料反應、稀釋樣品材料、使樣品材料媒合、懸浮樣品材料、乳化樣品材料、包封樣品材料、與樣品材料相互作用、或添加到樣品材料中的任何材料。出於本公開的目的，術語「生物標誌物(biomarker)」指的是可用於對於疾病狀態、 生物體的生理狀態、及機體對某種療法的反應等進行標誌的物質。非限制的，生物標誌物可以是血液中(但不限於)某種蛋白質(其濃度反映生物體是否有某種疾病，及該疾病的的嚴重程度)，DNA序列，引入生物體的用於檢查該生物體的某器官功能或某些健康指標的可跟蹤測量的物質。出於本公開的目的，「擴增(amplification)」指的是可以增加待測分析物的數量或濃度的過程。非限制的例子包括聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction或PCR)及其變種(如定量競爭PCR、免疫PCR、逆轉錄PCR等)，鏈置換擴增(Strand DisplacementAmplification 或 SDA),基於核酸序列的擴增(Nucleic Acid Sequence Basedamplification 或 NASBA),環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification或 LAMP),解鏈酶擴增(Helicase-dependent amplification 或 HAD)等。出於本公開的目的，術語「層(layer)」和「膜(film)」可以互換使用用來指主體的結構，該結構通常但不必須是平面或基本上平面的，而且通常沉積、形成、塗覆或其他方式放置在另一結構上。出於本公開的目的，「電極選擇單元(electronic selector)」指的是能夠設置輸出電信號或將其改變到不同電壓(或電流)水平的任何電子器件，具有或不具有中間電子器件均可。作為非限制性示例，微處理器與某些驅動器晶片一起可以用來在不同時間將不同的電極設置於不同的電勢。出於本公開的目的，術語「接地(ground)」(如用於「接地電極」或「接地電壓」)指的是相應的電極的電壓是零或足夠接近於零。所有其他電壓值，儘管幅度通常小於300伏，應當足夠高，以使得能夠充分觀察到電泳、介電泳、及電潤溼效應。應當指出，當布置覆蓋的電介質層時，同一層中相鄰電極之間的空間通常填充有該介電材料。這些空間也可以空著，或填充有諸如空氣、氮氣、氦氣和氬氣等氣體。同一層中的所有電極和不同層處的電極優選的進行電隔離。出於本公開的目的，術語「連通(communicate)」(例如，第一組件與第二組件「連通」或第一組件「連通至」第二組件)是指在兩個或更多組件或元件之間的結構、功能、機械、電、光、或流體關係或其任意組合。如此，一個組件被說成與第二組件連通的事實並不意圖排除在第一或第二組件之間存在額外的組件和/或額外的組件可操作地關聯或接合於第一或第二組件的可能性。出於本公開的目的，可以理解，當任何形式(如液滴或連續體，可能是在運動或靜止的)的液體被描述為在電極、陣列、矩陣或表面「上」、「處」或「之上」時，該液體可能與電極/陣列/矩陣/表面直接接觸，或可能與插入液體和電極/陣列/矩陣/表面之間的一個或多個層或膜相接觸。出於本公開的目的，可以理解，當諸如層、區域或基底的給定組件被稱為置於或形成在另一組件「上」、「中」、或「處」時，該給定組件可以直接位於該另一組件上，或備選地，也可以存在中間組件(例如，一個或更多個緩衝層、夾層、電極或接觸)。還可用理解，術語「置於...上」和「形成在...上」可以互換使用用來描述給定組件如何相對於另一組件進行定位或安置。因此，術語「置於...上」和「形成在...上」並不意在對材料傳輸、沉積或製造的特定方法引入任何限制。
出於本公開的目的，術語「探測(detection)」和「測量(measurement)」可以互換使用用來獲取物理量(例如，位置、帶電量、溫度、濃度、PH值、亮度、螢光等)的過程。在通常情況下，至少一個傳感器(或探測器)會被用來獲取物理量並將其轉換成人或儀器可以識別的信號或信息。待測物體和傳感器之間可以有其他元器件，比如光學測量中使用的透鏡、反光鏡、濾光片等，和電學測量中的電阻、電容、三極體等。而且，為了使得測量成為可能或容易些，測量中常會用到其他的輔助裝置或器件。例如，諸如雷射或雷射二極體等光源被用來將粒子從電子基態激發到電子激發態，激發態粒子回到基態時有時會發射的螢光，而測量這裡的螢光強度就可以用來測量液體樣品中某種粒子的濃度。傳感器在光學方面有CCD，光電二極體、光電倍增管等，在電學方面有運算放大器、模數轉換器、熱電偶、熱敏電阻等。測量可以對多個樣品的多個參量同時或按一定的順序進行。例如，在用光電二極體測量液滴中某種粒子螢光的同時，其液滴的位置也可以由電容測量來同時獲得。傳感器或探測器通常會跟電腦(computer)連接起來，電腦上通常裝有相應的軟體對所測量的信號進行分析，並通常將其轉化成人或其他儀器可以讀懂的信息。例如，利用對液體中某粒子螢光強度的測量和分析可以用來推斷該粒子的濃度。出於本公開的目的，術語「延長電極」的長度至少是其寬度的3倍；優選地，長度至少是其寬度的5倍；更為優選地，長度至少是其寬度的10倍。作為非限制性示例，光學測量包括雷射誘導的螢光測量(laser inducedfluorescence measurement)、紅夕卜光譜(infrared spectroscopy)、拉曼光譜(Ramanspectroscopy)、化學發光測量(chemiluminescence measurement)> 表面等離子共振測量(surface plasmon resonance measurement)、吸收光譜(absorption spectroscopy)等；電學測量包括電流分析法(amperometry )、伏安測量法(voItammetry )、光電化學測量法(photoelectrochemistry)、庫侖分析法(coulometry)、電容測量法(capacitancemeasurement)、以及交流阻抗測量法(and AC impedance measurement)等。下面是對本發明的操控方法及微流器件的具體描述，為了方便於說明，相應的附圖(圖I至圖3)會在需要的時候提到。應該說明的是，這些例子的目的是為了幫助說明，而不是為了限制發明的意願和精神。請參閱圖I，其為本發明的基於電泳來操控液體中的帶電粒子的方法的流程圖。其中，本發明所述的方法可用於包含至少兩個電極的微流器件。優選地，該兩個電極的寬度範圍在I微米至I毫米之間、間距範圍在10微米至20毫米之間。在步驟SlOl中，在所述兩個電極上分別施加電壓以形成第一電壓差，並在第一持續時間後，改變所述兩個電極上的電壓以形成第二電壓差，並持續第二持續時間，使待測液滴中的帶電粒子產生不同位移，以便粒子的分離；其中，第一電壓差與第二電壓差中至少一者的幅度能使待測液滴中至少部分帶電粒子移動。其中，待測液滴可能包含的粒子的種類可包括以下幾種情形

第一種情形待測液滴可能包含兩種粒子，其中一種粒子帶正電荷、另一種粒子帶負電荷；第二種情形待測液滴可能包含兩種或兩種以上的粒子，且每一種粒子所帶電荷的類型均相同，例如，均帶正電荷或均帶負電荷；第三種情形待測液滴可能包含三種或三種以上的粒子，且至少有一種粒子帶正電荷、一種粒子帶負電荷、剩餘種類的粒子或帶正電荷或帶負電荷。當待測液滴可能包含的粒子為第一種情形時，若第一電壓差與第二電壓差的極性相同，例如，均為正值或均為負值，則待測液滴中帶正電荷的粒子的位移方向與兩電極間的電場方向相同而帶負電荷的粒子的位移方向與電場方向相反，故待測液滴中的粒子產生不同方向的位移；若第一電壓差與第二電壓差大小相同但極性相反，則第一持續時間與第二持續時間中的長者所對應的兩電極間的電場方向決定了待測液滴中的粒子的位移方向，例如，若第一持續時間長於第二持續時間，貝1J第一持續時間所對應的兩電極的電場方向為帶正電荷粒子的位移方向、該電場的反方向為帶負電荷粒子的位移方向，故待測液滴中的粒子也產生不同方向的位移。當待測液滴可能包含的粒子為第三種情形時，可先按照前述第一種情形所述的方式在兩電極上施加相應電壓使帶正電荷的粒子移動並滯留在待測液滴中臨近一個電極的位置處、帶負電荷的粒子移動並滯留在待測液滴中臨近另一個電極的位置處；隨後再在兩電極上施加相應電壓使待測液滴基於電溼潤效應分離為兩個子液滴，則子液滴中若包含多種粒子，則該多種粒子所帶電荷的類型均相同，即屬於前述第二種情形。以下將對待測液滴可能包含的粒子為第二種情形進行詳細說明當待測液滴中包含帶同種電荷的不同粒子時，在第一持續時間及第二持續時間後，待測液滴中的各帶同種電荷的不同粒子總的位移方向基於第一持續時間、第二持續時間、第一電壓差及第二電壓差來確定。例如，當待測液滴Dl中可能含有均帶正電荷的粒子all和粒子bll,在第一持續時間til內在電極Ell、E12上分別施加電壓以形成第一電壓差U11，在第二持續時間tl2內改變電極Ell、E12上電壓以形成第二電壓差U12，其中，第一電壓差Ull與第二電壓差U12均能使帶電粒子移動，且兩者大小相同而極性相反，第一持續時間til小於第二持續時間tl2，則經過第一持續時間til與第二持續時間tl2後，帶正電荷的粒子all、bll各自總的位移方向均為朝向在第二持續時間tl2內電壓極性與帶正電荷的粒子all、bll的極性相反的電極方向，而由於粒子al I、bl I各自的質荷比不同，故粒子al I、bl I中質荷比小者的位移大於質荷比大者的位移。
由此，基於上述說明，本領域技術人員應該理解，選擇合適的第一持續時間長度、第二持續時間長度、第一電壓差以及第二電壓差，則在第二持續時間後，待測液滴中至少一種粒子的位移應大於(優選是遠大於)待測液滴中其他與該種粒子所帶電荷類型相同的粒子的位移；更為優選地，在該第二持續時間後，待測液滴中至少一種粒子具有明顯位移，而待測液滴中其他種粒子基本保持在原地，或位移可以忽略不計。其中，兩電極上所施加的電壓的頻率通常低於10000赫茲，優選地，頻率小於100赫茲；更為優選地，頻率小於I赫茲。基於上述說明，若多次重複步驟S101，則待測液滴中至少一種帶電粒子在每一次步驟SlOl執行之後均朝向一個電極方向移動，最終會滯留在該待測液滴中臨近該電極的位置處，由此可改變液滴中的粒子的分布，方便對粒子進行後續處理或測量等。例如，繼前述待測液滴D1，在每一次步驟SlOl執行之後，粒子all、bll中質荷比小者均具有較大朝向電極Ell方向、而粒子all、bll中質荷比大者則基本保持在原地或位 移可以忽略不計，則步驟SlOl多次執行之後，粒子all、bll中質荷比小者移動並滯留在待測液滴Dl中臨近電極Ell的位置處，則該待測液滴Dl中，臨近電極Ell的位置處的質荷比小的粒子的濃度會顯著增加。隨後，若在電極Ell、E12上施加電壓，使得待測液滴Dl基於電溼潤效應而分離為兩個子液滴，則質荷比小的粒子集中在臨近電極Ell的子液滴中。優選地，若在步驟SlOl執行之前，先在一電極上施加正電壓、在另一電極上施加負電壓，使待測液滴中的帶電粒子移動並最終滯留在液滴中臨近電壓極性與自身所帶電荷極性相反的電極的位置處；隨後，再開始步驟SlOl的操作，使待測液滴中的至少一種粒子遠離自身所滯留處，而朝向液滴中臨近另一電極的位置處移動並最終滯留在該位置處。例如，繼前述待測液滴D1，若在步驟SlOl執行之前，先在電極Ell上施加正電壓、在電極E12上施加負電壓，則待測液滴Dl中的帶正電荷的粒子al I、bl I均向液滴Dl中臨近電極E12的位置處移動並最終滯留在該位置處；隨後再進行步驟SlOl的操作，則粒子all、bll中質荷比小的粒子移動並最終滯留在待測液滴Dl中臨近電極Ell的位置處、而質荷比大的粒子仍滯留在待測液滴Dl中臨近電極E12的位置處，由此可實現同一液滴中同種電荷的粒子的分離。隨後再在電極E11、E12上施加電壓，使得待測液滴Dl基於電溼潤效應而分離為兩個子液滴，以便分別對粒子all與bll進行檢測等。此外，通過在微流器件所包含的電極上施加電壓來移動待測液滴至所期望的位置處(例如，液體出口處、與進行前述步驟SlOl操作的一個電極交疊的位置處等)、在兩個電極上施加同相位電壓使待測液滴基於電溼潤效應而改變形狀等，均已為本領域技術人員知悉，故在此不再詳述。圖2A是本發明的基於電泳來操控液體中的帶電粒子的數位化微流器件的截面示意圖。在這個實施例中，液滴D被夾在下層板202和上層板204當中。本上下文中使用的術語「上」和「下」僅用於區分下層板202和上層板204，而不作為下層板202和上層板204相對於地平面的方向的限制。下層板202上設置有第一電極結構層及第二電極結構層，上層板204上設置有第三電極結構層。其中，設置在第一基底201上的第一電極結構層包括電極El及介電層203B ;設置在第一電極結構層表面的第二電極結構層包括兩個長條形電泳電極E2E_1、E2E_2、電極E2、以及介電層203B。設置在第二基底205上的第三電極結構層包括電極L及介電層207。
優選地，下層板202和上層板204之間的間隔小於I毫米；更為優選地，小於O. 3毫米。其中，電泳電極E2E_1、E2E_2的寬度範圍在I微米至I毫米之間，兩者之間間距範圍在10微米至20毫米之間，各電極E2的寬度範圍和相鄰電極間的間距範圍在100微米至20毫米之間；優選地，電泳電極E2E_1、E2E_2的寬度範圍在5微米至500微米之間、間距範圍在100微米至5毫米之間，各電極E2的寬度範圍和相鄰電極間距範圍在200微米至2毫米之間。其中，第一電極結構層中的各電極El的寬度範圍和相鄰電極間的間距範圍在I微米至10毫米之間。優選地，各電極E1、E2、E2E_1和E2E_2均採用延長電極。其中，電極E2E_1和E2E_2可以用來(在它們之間)產生電場而對對液滴中的懸浮 帶電粒子進行操作。當然，控制電極El及E2的主要用途是用來產生電潤溼效應以對在液滴中的帶電粒子進行控制。應當理解，在構建受益於本發明的器件時，控制電極E1、E2、E2E_1、或E2E_2通常是一起形成二維電極陣列或網格的大量控制電極的一部分。優選地，控制電極E2E_1和E2E_2至少部分表面未被介電層203C覆蓋，由此可與液滴直接接觸，如圖2A所示。圖2B是圖2A所示的微流器件的上層板204中的電極L和嵌入在下層板202中的控制電極的一個三維圖。圖2C是一個顯示嵌入在下層板202的控制電極的俯視圖。除了放置電極的區域不可以導電以外，用於製作第一基底或第二基底的材料並不重要。材料應當有一定的硬度，以便基底的基本形狀及兩者間的間距可以基本保持不變。第一基底或第二基底可以由(但不局限於)石英、玻璃、或聚合物(如聚碳酸酯(polycarbonate)或環烯共聚物(cyclic olefin copolymer)等製作而成。控制電極El及E2的數量在I至10000之間，但是優選的是從2到1000個，更優選的是從2到200個。上層板204中的電極L的數量在I至10000之間，優選地，在2至1000之間，更為優選地，在2至200之間，相鄰電極L的間距範圍在0. I微米至20毫米之間，優選地，在I微米至2毫米之間。控制電極El、E2、E2E_1、及E2E_2可以通過傳統的導電引線和直流或交流電源連接。每個電源可以獨立控制，也可以利用轉換開關而用一個電源來控制多個電極。典型的電壓幅度通常小於300伏。用於產生電潤溼效應的交流電壓的頻率通常小於I萬赫茲。當希望產生電泳效應時，電極E2E_1、及E2E_2可以通過傳統的導電引線和直流或交流電源連接，交流電的頻率通常低於10000赫茲，但是優選的是小於100赫茲，更優選的是小於I赫茲。製作電極的可以是任何的導電材料，例如銅、鉻、銦銻氧化物(ITO)等。為了畫圖和顯示方便，圖2A至圖2C中的電極形狀被畫成長方形，不過，它們可以是很多其他任何形狀。事實上，各電極的形狀、寬度、及間距可以基於器件上的不同位置而不同，從而可以在器件上不同的位置對不同大小及形狀的粒子更有效的進行操作。用於製作介電層203B、203C、及207的材料包括但不限於鐵氟龍(Teflon)、Cytop,聚氯代對二甲苯(Parylene C)、氮化娃、氧化娃等。介電層203B及207優選地為疏水性，這可以通過在介電層203C及207上塗一層鐵氟龍、Cytop、或其他疏水物質來實現。
控制電極E1、E2、E2E_1、及E2E_2嵌入或形成在第一基底201上。介電層203A塗覆在各電極El上，以將各電極El電隔離，同時也將各電極El (屬於第一電極結構層)與各電極E2、E2E_1、及E2E_2 (屬於第二電極結構層)電隔離。另一介電層203C覆蓋至少部分控制電極E2，也可由此將電極E2、E2E_1、及E2E_2電隔離。上層板204中包括嵌入在第二基底205中或形成在其上的控制電極L。優選地，疏水絕緣薄層207覆蓋各電極L，並由此將各電極L電隔離。標準的IC或IXD生產工藝可以用於製作與生物分析相容的數位化微流器件。例如，用於製作薄層的技術有(但不局限於)澱積(deposition)，例如等離子體增強化學氣相沉積法(PECVD)、#i射(sputtering)、或旋塗(spinning coating)等；用於去除薄層的技術有(但不局限於)蝕刻(etching),如溼法腐蝕(wet etching)、等離子蝕刻(plasmaetching)等；薄膜布圖布線技術(patterning technique)有(但不局限於)紫外光刻(UVlithography)、電子束光刻(electron beam lithography)等。上述所示的微流器件作為一種數位化微流器件，其還可以包括其他微流體組件和/或微電子組件。例如，器件還可以包括電阻式加熱(resistive heating)區域、微通道 (microchannels)、微泵(micropumps)、壓力傳感器(pressure sensors)、光波導(opticalwaveguides)、和/或與金屬氧化物半導體(Metal Oxide Semiconductor,或M0S)電路連接的生物傳感(biosensing)或化學傳感(chemosensing)元件。作為一種優選，本發明的微流器件還包括電極選擇單元。該電極選擇單元分別與處於第一基底的第一電極結構層、第二電極結構層及第二基底的第三電極結構層中的可選址電極相連接，用於由可選址電極中選擇待施加電壓的電極，來施加相應電壓。作為又一種優選，本發明的器件還可包括至少一個溫度控制元件以控制自身部分區域的溫度等。溫度控制元件，如半導體製冷器(Peltier)，可以設置在器件所屬的集成晶片外，其與微流器件I00所屬晶片的至少一個區域接觸；或集成在器件所屬的集成晶片上，如直接製作在器件外表面上的薄膜電阻加熱器；此外，器件也可既包括設置在自身所屬的集成晶片外的溫度控制元件，還可包括集成在自身所屬的集成晶片上的溫度控制元件。所述溫度控制元件可以將其接觸的區域的溫度穩定的控制在O攝氏度到大約100攝氏度。此外，本發明的微流器件還包括與容置液體的空間連通的液體入口、液體出口等。圖2D顯示了通過對電極E2E_1加正電Vl，對電極E2E_2加負電V2，液滴D中的帶電粒子被重新分布，即帶正電的粒子在電極E2E_2附近，帶負電的粒子在電極E2E_1附近。其中，電壓VI、V2的幅度應足夠大以使帶電粒子移動。圖2E和圖2F顯示了在帶電粒子被重新分布後，再在電極E2_l和E2_2加合適的電壓(例如，分別為V3和V4)，則液滴D基於電潤溼效應被分成了兩個較小的子液滴。圖2G顯示了兩個子液滴在電極E2_l和E2_2上的電壓取消後，變成了自然的扁圓形。由此可見，基於本發明的微流器件的兩電泳電極，可操控液滴中帶電粒子，尤其可使帶正電荷的粒子與帶負電荷的粒子分離。此外，基於上述微流器件的兩電泳電極來進行前述步驟SlOl的操作，則還可實現液滴中帶同種電荷的不同粒子的分離。由於其高親和性和特異性，免疫分析是用於定量檢測的靈敏且常用手段，其分析物多種多樣，如病毒、肽(peptides)、多核苷酸(polynucleotides)、蛋白質(如抗體、毒素、細胞因子等)及其他小分子。在臨床實驗室裡，免疫分析仍被用來檢測心臟病標誌物、月中瘤標誌物、激素、藥物、傳染源(infectious agent)、及免疫反應(immune response)等；而且新的檢測物也不斷的被加進來。在不同的免疫分析格式中，非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)具有更高的靈敏度，因而也是最常用的。異相免疫分析有三個典型的步驟第一，捕獲-產生有標記的抗原抗體複合物的反應；第二，分離-將結合的抗原抗體複合物和游離抗原分開的過程；第三，檢測-測量從結合的抗原抗體複合物發出的信號。在常見的異相免疫分析中，抗原抗體複合物通常會被固定在固體的表面(酶標板或微磁珠)，然後未結合分子被衝洗掉。利用本發明，參與結合和未結合分子可以用電泳在數位化微流器件上實現，這樣就不需要使用固體表面來固定待分析物。這可以降低整個系統的複雜程度和實驗花費。利用本發明的數位化微流器件可以實現對液體中帶電粒子的操作，通過對器件中電極的控制，所需要的粒子分離就可以實現，因此就不需要用諸如多孔板(well-plates)或 微珠(microbeads)等來固定抗原抗體複合物了。這帶來的好處很大包括可靠的測量、更經濟的檢測、易使用的系統等等。至今，微流器件上所分析的樣品在放入器件之前都需要預處理，即樣品製備(sample preparation).對於大多數的分析手段來說，樣品製備都是重要的一個環節，因為該分析手段可能對於原位狀態的待分析物不敏感，也可能分析結果易受其他與待分析物並存的其他物質的幹擾。傳統意義上的樣品製備通常是指在分析前對待分析物進行濃縮、溶劑交換(the exchange of solvent)、去除幹擾物質等。在生化分析中，樣品製備通常是一個耗時耗力並需要很多步驟的過程，例如從原始樣品(如全血、唾液、尿液、汗液、腦脊液、糞便等)收集所需要的DNA、RNA、或蛋白質等。總體說來，樣品製備可以分為兩大步第一，細胞或組織裂解(cell or tissuelysis)-裂解細胞但不使其中的敏感大分子變形或降解(denature or degrade),如DNA或蛋白質；第二，提取或分離(extraction or separation)-將待測物從裂解後的細胞裡提取。在微流系統中，細胞分解方法有以下幾大類a.機械法-利用對細胞直接接觸的機械力來擠碎細胞。b.加熱法-利用高溫來破壞細胞膜。c.化學法-利用化學緩衝劑或酶來打開細胞。d.電學法-利用低強度電場在細胞膜產生多孔，或利用較強電場分解細胞。在不受理論的約束下，利用本發明，細胞裂解可以在數位化微流器件上利用加熱法、化學法、電學法等較容易的實現。而利用電泳，提取或分離也可以在器件上實現。就是說，本發明使得數位化微流器件成為一種真正意義上的集成器件-可以進行樣品製備、檢測、和分析。圖3是一個利用本發明的數位化微流器件來從全血(whole blood)中提取DNA樣品並對其進行檢測分析的例子。在第S301步驟，在數位化微流器件上放入病人的血液樣品和用來對特定DNA進行實時PCR測量的試劑(如DNA引物、DNA聚合酶、dNTP等)。在第S302步驟，在器件相應電極上施加電壓使血液樣品基於電溼潤分離出一個或多個樣品液滴，並通過在相應電極上施加電壓來移動樣品液滴至器件上可以加熱的位置。在第S303步驟，在器件上通過溫度控制元件將樣品液滴的溫度升至100攝氏度並在此溫度保持一小段時間(比如30秒)，以實現對樣品中細胞的熱分解。在第S304步驟，通過在相應電極上施加電壓來將樣品液滴移至與電泳電極E21或E22對應的位置處，並通過在電泳電極E21或E22施加電壓對對樣品液滴進行電泳操作，以將待測的DNA分離出來。在第S305步驟，通過在在相應電極上施加電壓來產生電溼潤效應將樣品液滴一分為二，使得待測的DNA主要在其中的一個液滴中(DNA液滴)。在第S306步驟，在器件相應電極上施加電壓使試劑基於電溼潤產生一個或多個試劑液滴，並通過在相應電極上施加電壓來移動試劑液滴，使試劑液滴與DNA液滴合併。在第S307步驟，在器件上對合併混合後的液滴進行實時PCR測量。在第S308步驟，將測量後的液滴移至器件中的廢液收集處。圖3顯示的只是許許多多個只要在本發明中數位化微流器件上放入未處理樣品和相應的試劑就可以進行檢測分析的例子之一。這裡的數位化微流器件具有各種各樣的功能，例如從未處理樣品中提取待測物質、對待分析物進行測量、以及實 驗分析等。非限制的例子包括對全血進行血液化學檢驗(blood chemistry),如血氣(blood gases)、葡萄糖(glucose)、電解質類(electrolytes)、尿素(urea)等；對尿液中陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)的測量來診斷膀胱癌；對汗液中電解質(sweat electrolytes)的測量儀診斷囊腫性纖維化(cystic fibrosis)、對唾液中相應的白細胞間介素(interleukin) IL-IB和IL-8等的測量來判斷口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma)等。可以看出，本發明提出了在生化分析和即時檢驗(point-of-care testing)等很多領域都非常有用方法，包括樣品製備的自動化(例如細胞分離、細胞溶解(cell lysis)、分子提取和純化、濃縮、與試劑的混合、或者擴增等)、測量和分析。從上面的一些例子可以看出其中的一些優勢。除了繼承了數位化微流的一些優勢以外，本發明引入了更多的優勢，例如a.有主要用於電泳的電泳電極及配合電泳電極進行電溼潤操作的電極，方便使用者的使用。b.器件功能更加完整，尤其是樣品製備也可以在器件上完成，而不需要在放入器件前用其他方法進行。因此，可用原材料直接進行測量。c.因為懸浮在液體中的帶電粒子可以在液滴內被重新分布或濃縮，測量的靈敏度可以因此而相應的提高。d.由於通過對器件上的電極控制就可以對液滴裡的帶電粒子進行分離，通常用於粒子分離的磁珠及外界磁鐵裝置也就不需要了。這可以簡化器件的使用、降低器件的使用成本。e.在器件上對液滴裡的帶電粒子進行重新分布或分離的功能使得檢測的靈活性和多重性(multiplicity)得到提高。f.生化分析的很多步驟都可以在器件上集成化和自動化，例如取樣、樣品製備、液體移動、混合、稀釋、濃縮、分離、孵育、反應、測量、廢液收集等。g.可以對多個待分析物同時進行檢測。h.可以同時進行不同類別的分析檢測。i.利用器件上的電泳過程，樣品和試劑之間的混合過程可以加快。j.實驗定標和檢測分析可以同時進行。用於定標的液滴和檢測的液滴可以同時產生和運作，而實驗定標的過程不需要先將實驗先停下。這裡應當指出，為了降低焦耳熱(Joule heating)的副作用，可以對本發明的數位化微流器件(整個或局部)可以進行溫度控制。儘管這裡沒有詳細描述，應當指出，在使用電泳效應時，電極上所加電壓的幅度也是可以調節的，這也是為了更有效地進行粒子操作而經常使用的。以上可見,本發明提供了一個真正意義上即時檢驗(point-of-care testing)的方法及器件，尤其能有效分離液滴中帶同種電荷的不同粒子。基於本發明，細胞溶解(celllysis)及分析物的提取/分離都是器件功能的一部分。本發明的數位化微流器件具有頗為完整的功能，包括樣品製備、測量、分析、和診斷等。通過和網際網路及雲計算結合，本發明可以為醫療系統(healthcare system)提供一個好的基礎,包括病情診斷、網上醫療知識支持、遠程醫生病人互動等。這裡應當指出，上述示例和上述提及的優勢不是窮舉性的。本發明的靈活性本質 可以用於很多應用，並且與諸如基於單層電極的數位化微流或基於管道的微流的其他技術相比，的確有很多優勢。在本申請中提及的所有書面專利和出版物通過應用而在此併入全部內容。儘管說明並描述了本發明的優越實施方式，但是應當理解，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，可以對本發明做出很多改變。上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用於限制本發明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及範疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。
權利要求
1.一種基於電泳來操控液體中的帶電粒子的方法，用於具有至少兩個電極的微流器件，其特徵在於所述方法至少包括步驟 a.在所述兩個電極上分別施加電壓以形成第一電壓差，並在第一持續時間後，改變所述兩個電極上的電壓以形成第二電壓差，並持續第二持續時間，使所述待測液滴中帶電粒子產生不同位移，以便粒子的分離； 其中，第一電壓差與第二電壓差中至少一者的幅度能使待測液滴中至少部分帶電粒子移動。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於多次重複步驟a，使部分帶電粒子在液滴中持續向一個電極方向移動，最終滯留在該液滴中臨近該電極的位置處。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於所述第一電壓差與第二電壓差的極性相反。
4.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於所述第一持續時間與第二持續時間中的一者長於另一者。
5.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於在步驟a之前還包括步驟 在兩電極上分別施加極性相反的電壓，使待測液滴中的帶電粒子均向電壓極性與自身所帶電荷極性相反的電極移動，並最終滯留在該待測液滴中臨近該個電極的位置處。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於還包括步驟在所述微流器件所包含的相應電極上施加直流或低頻交流電壓，以便待測液滴基於電溼潤效應分離為至少兩個子液滴。
7.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，在步驟a之前還包括步驟在所述微流器件包含的相應電極上施加直流或低頻電壓，使待測液滴被驅動至與所期望的電極對應的位置處。
8.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟a中施加在兩電極上的電壓的頻率低於10000赫茲。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述頻率小於100赫茲。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述頻率小於I赫茲。
11.一個基於電泳來操控液體中的帶電粒子的微流器件，其特徵在於至少包括 第一基底及第二基底； 設置於所述第一基底的第一電極結構層及設於所述第一電極結構層表面的第二電極結構層、設置於所述第二基底的第三電極結構層，且第一基底上的電極結構層與第二基底上的電極結構層相對設置，以便兩者之間具有容置液體的空間； 其中，在所述第二電極結構層中，兩個電泳電極的寬度範圍在I微米至I毫米之間、間距範圍在10微米至20毫米之間，其他電極的寬度範圍和間距範圍在100微米至20毫米之間。
12.根據權利要求11所述的微流器件，其特徵在於電泳電極的寬度範圍在5微米至500微米之間、間距範圍在100微米至5毫米之間，所述第二電極結構層中的其他電極的寬度範圍和間距範圍在200微米至2毫米之間。
13.根據權利要求11所述的微流器件，其特徵在於每一電泳電極的至少部分表面處於裸露狀態以便能與液滴接觸。
14.根據權利要求11所述的微流器件，其特徵在於所述第一電極結構層中的各電極的寬度範圍和間距範圍在I微米至10毫米之間。
15.根據權利要求11所述的微流器件，其特徵在於所述第一電極結構層及第二電極結構層所包含的電極包括延長電極。
16.根據權利要求11所述的微流器件，其特徵在於還包括電極選擇單元，分別與處於所述第一基底及第二基底的各電極結構層中的可選址電極相連接，用於由可選址電極中選擇待施加電壓的電極，來施加相應電壓。
17.根據權利要求11所述的微流器件，其特徵在於還包括與容置液體的空間連通的液體入口。
18.根據權利要求11所述的微流器件，其特徵在於還包括與容置液體的空間連通的液體出口。
19.根據權利要求11所述的微流器件，其特徵在於還包括至少一個溫度控制元件以控制器件至少部分區域的溫度。
20.根據權利要求11所述的微流器件，其特徵在於在所述第一基底及第二基底上，處於表面的電極結構層所包含的介電層中至少部分區域具有疏水性。
21.根據權利要求11所述的微流器件，其特徵在於第一基底上處於表面的電極結構層的表面與第二基底上處於表面的電極結構層的表面之間的間距小於I毫米。
22.根據權利要求21所述的微流器件，其特徵在於第一基底上處於表面的電極結構層的表面與第二基底上處於表面的電極結構層的表面之間的間距小於O. 3毫米。
23.一種基於電泳來操控液體中的帶電粒子的方法，其特徵在於至少包括步驟 a、在權利要求11至22任一項所述的微流器件的兩個電泳電極上分別施加極性相反且幅度能使得帶電粒子移動的電壓，使待測液滴中的帶電粒子向極性與自身電荷極性相反的電泳電極方向移動。
24.根據權利要求23所述的方法，其特徵在於，當帶電粒子已滯留在液滴中臨近與自身所帶電荷極性相反的電泳電極的位置處時，所述方法還包括步驟 在兩電泳電極上施加直流或低頻交流電壓，使待測液滴基於電溼潤效應分離為兩個子液滴。
25.根據權利要求23所述的方法，其特徵在於所述待測液滴包括只帶一種電荷的粒子或既包括帶正電荷的粒子又包括帶負電荷的粒子。
全文摘要
本發明提供一種基於電泳來操控液體中的帶電粒子的方法及器件。根據本發明的方法，在微流器件的兩個電極上分別施加電壓以形成第一電壓差，並在第一持續時間後，改變所述兩個電極上的電壓以形成第二電壓差，並持續第二持續時間，使待測液滴中的帶電粒子產生不同位移，以便粒子的分離；其中，第一電壓差與第二電壓差中至少一者的幅度能使待測液滴中至少部分帶電粒子移動。本發明利用電潤溼(electrowetting)、及電泳(electrophoresis)等效應，可實現對液滴的操作以及對懸浮於液滴中的帶電粒子，尤其是帶同種電荷的不同粒子，進行控制。
文檔編號G01N27/447GK102879453SQ201210324609
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月4日 優先權日2012年9月4日
發明者吳傳勇 申請人:吳傳勇, 上海衡芯生物科技有限公司