一種三羥甲基氨基甲烷配基瓊脂糖親水色譜介質合成方法
2023-04-30 12:40:21 2
專利名稱：一種三羥甲基氨基甲烷配基瓊脂糖親水色譜介質合成方法
技術領域：
本發明涉及一種色譜介質的合成方法，具體地是涉及一種三羥甲基氨基甲烷配基 瓊脂糖親水色譜介質合成方法。
本發明屬於生物工程的生化分離領域。
背景技術：
生物藥物生產過程中分離純化的費用佔成本的絕大部分，其中使用最普遍的是色 譜技術及其組合，目前所用介質主要是凝膠過濾、離子交換、疏水相互作用、親和、 反相介質，其基質材料有瓊脂糖、葡聚糖、聚苯乙烯和矽膠等。瓊脂糖介質是在生物 藥物生產中使用最為廣泛的基質材料。它是一種天然多糖，具有高孔度；具有高的連 通性有效保證了分子內物質傳遞；大比表面積提供很高的吸附能力；易製備成不同瓊 脂糖濃度、不同尺寸的球形顆粒以滿足不同領域的需求；低的非特異性吸附使應用面 較廣；在氫氧化鈉中穩定可滿足苛刻的在位清洗步驟；可通過交聯使介質具有剛性； 可被大量配基取代而應用於多種色譜技術。
瓊脂糖介質已經在生物醫藥領域被使用了 40餘年，利用瓊脂糖基質介質生產的生 物藥物種類繁多，例如Y-幹擾素、人生長激素、人血清白蛋白、胰島素、促紅細胞 生成素、各種單克隆抗體和疫苗等。這些產品的開發和生產有助於保障公共衛生安全、 提高人民生活質量。美國公司GE Healthcare Bio-Sciences (原Pharmacia,瑞典)的瓊 脂糖介質產品均獲得美國食品藥品監督管理局的認證，表明瓊脂糖基質具有優異的安 全性和可靠性。瓊脂糖介質5.7億美元約120萬升的世界市場被該公司控制了 60%, 而我國生物製藥所使用的瓊脂糖介質98%以上依賴進口，每年約耗資5億元人民幣， 隨著生物藥物需求的快速增長、新生物藥物種類的增加，對瓊脂糖基質介質的需求也 將迅猛增長。目前國內有一些企業、研究院所及高校從事該介質的研究開發，但產品 種類少、質量穩定性較差、市場佔有率非常低，是我國生物技術產業發展急待解決的
3戰略問題。
氫鍵吸附色譜屬於親水相互作用色譜的一種，是近年來在中藥活性成分分離純化 研究過程中提出的概念，常用的氫鍵吸附色譜介質包括瓊脂糖凝膠和聚醯胺，已成功 應用於多種中藥多酚類化合物的分離純化，對強極性有機小分子化合物能夠實現較好 的保留，可分離獲得高純度的中藥活性成分。
瓊脂糖凝膠適於作為氫鍵色譜吸附劑。目前國內外市場上沒有專用的瓊脂糖基質 氫鍵吸附色譜介質。
30 pm平均粒徑的瓊脂糖凝膠微球因粒徑小，剛性不足，為了能將其灌裝工業色 譜柱，需要通過交聯提高剛性。國內外瓊脂糖介質產品因其主要用於生物大分子蛋白 質的分離純化，大多介質粒徑在60-120 pm，採用一步或兩步交聯即可，本項目的純 化目標是分子量明顯低於蛋白質的多肽，需要更高的解析度，也就要求更小的微球粒 徑， 一步或兩步交聯提供的剛性不能完全滿足本項目的需要。
從檢出文獻看，國內已有多家單位採用瓊脂糖為基質製備色譜柱填料，如中科 院過程所、北京化工大學、清華大學、中國藥科大學、北京理工大學、上海醫藥工業 研究院、北京大學、中科院生物物理所、南京醫科大學、中科院大連化物所、北京北 清創業科技開發有限公司、西安交大保賽生物技術股份有限公司、北京東凱元醫藥生 物技術研究院等。但我國目前瓊脂糖基質介質產品的種類少、市場佔有率低，98%以 上的國內市場被國外產品佔據，研製具有自主智慧財產權的瓊脂糖介質是急待解決的戰 略問題。
瓊脂糖凝膠介質表面有大量可供反應的羥基，可以通過直接法、間接法引入高密 度的配基，作為親水吸附色譜的分離介質。三羥甲基氨基甲烷，分子量小，是親水吸 附色譜的良好供體偶聯作為配基後介質可耐受鹼性溶劑清洗。
發明內容
本發明的目的在於提供一種以高濃度、高交聯度瓊脂糖凝膠微球為基質，製備具 有高剛性的、高選擇性的、以三羥甲基氨基甲垸為配基的親水吸附色譜分離材料的合 成方法。用於多酚蛋白質、親水性多肽和天然有機小分子的分離純化。
本發明的目的是通過如下的技術方案實現的。
本發明提供的使用以高濃度、高交聯度瓊脂糖凝膠為基質、以三羥甲基氨基甲烷
4為配基的親水吸附介質的合成方法，包括如下步驟
1) 12%濃度、30 pm平均粒徑瓊脂糖凝膠微球100 ml，在砂芯漏鬥上用水洗後替 換成丙酮，轉入反應瓶或反應器，加100ml丙酮；
2) 加入10-30 g縮水甘油醚，攪拌60-120 min;
3) 加入3ml的20。/。氫氧化鈉，攪拌8-12h;
4) 加丙酮攪拌l-2h;
5) 用5倍體積的丙酮洗10-20 min，用5倍體積的水洗10-20 min;
6) 加200ml水，加入5-15g硫酸鈉，攪拌2-3 h;
7) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌1-2 h;
8) 加入10-30 ml表氯醇，35-60 。C攪拌3-5 h;
9) 用5倍體積的水洗；
10) 加入200ml水，加5-15g硫酸鈉，攪拌2-3 h;
11) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌1-2 h;
12) 加入30-60 ml的1,4-二丁基縮水甘油醚，35-60 。C攪拌10-15 h;
13) 用IO倍體積的水洗；
14) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌1-2 h;
15) 加入10-20 ml烯丙基溴或環氧氯丙烷或l,4-雙一丁烷二縮水甘油醚或季戊四 醇三縮水甘油醚或季戊四醇縮水甘油醚或溴代醇，攪拌6-8h;
16) 用鹽酸調pH4-6;
17) 加入3-10g三羥甲基氨基甲垸，10-20ml的20氫氧化鈉，攪拌12-20 h;
18) 用鹽酸調pH4-6;
19) 用IO倍體積水洗。
圖1為三羥甲基氨基甲垸結構式
圖2為三羥甲基氨基甲垸配基的瓊脂糖凝膠親水吸附色譜介質純化縮宮素的色譜圖。
圖3為三羥甲基氨基甲垸配基的瓊脂糖凝膠親水吸附色譜介質純化虎杖水提取物 的色譜圖。
具體實施例方式
實施例l、三羥甲基氨基甲垸配基的瓊脂糖凝膠親水吸附色譜介質合成方法1
1) 12%濃度、30 pm平均粒徑瓊脂糖凝膠微球100 ml，在砂芯漏鬥上用水洗後替 換成丙酮，轉入反應瓶或反應器，加100ml丙酮；
2) 加入10g縮水甘油醚，攪拌60min;
3) 加入3ml的20%氫氧化鈉，攪拌8h;
4) 加丙酮攪拌lh;
5) 用5倍體積的丙酮洗10min，用5倍體積的水洗10 min;
6) 加200ml水，加入5g硫酸鈉，攪拌2h;
7) 加入3ml的20e/。氫氧化鈉，攪拌Ih;
8) 加入10ml表氯醇，35-60。C攪拌3h;
9) 用5倍體積的水洗；
10) 加入200ml水，加5g硫酸鈉，攪拌2h;
11) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌1 h;
12) 加入30 ml的1，4-二丁基縮水甘油醚，35-60 。C攪拌10 h;
13) 用IO倍體積的水洗；
14) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌1 h;
15) 加入10 ml烯丙基溴攪拌6 h;
16) 用鹽酸調pH4;
17) 加入3g三羥甲基氨基甲烷，10-20ml的20氫氧化鈉，攪拌12h;
18) 用鹽酸調pH6;
19) 用IO倍體積水洗。
實施例2、三羥甲基氨基甲烷配基的瓊脂糖凝膠親水吸附色譜介質合成方法2
1) 12%濃度、30 pm平均粒徑瓊脂糖凝膠微球100 ml，在砂芯漏鬥上用水洗後替 換成丙酮，轉入反應瓶或反應器，加100ml丙酮；
2) 加入30g縮水甘油醚，攪拌120min;
3) 加入3ml的20%氫氧化鈉，攪拌12h;
64) 加丙酮攪拌2h;
5) 用5倍體積的丙酮洗20min，用5倍體積的水洗20 min;
6) 加200ml水，加入15g硫酸鈉，攪拌3h;
7) 加入3ml的20。/。氫氧化鈉，攪拌2h;
8) 加入10-30 ml表氯醇，40。C攪拌5h;
9) 用5倍體積的水洗；
10) 加入200ml水，加15g硫酸鈉，攪拌3h;
11) 加入3ml的20n/。氫氧化鈉，攪拌2h;
12) 加入60 ml的1,4-二丁基縮水甘油醚，35 。C攪拌15 h;
13) 用IO倍體積的水洗；
14) 加入3ml的20。/。氫氧化鈉，攪拌2h;
15) 加入20m季戊四醇三縮水甘油醚攪拌8h;
16) 用鹽酸調pH6;
17) 加入10g三羥甲基氨基甲烷，20ml的20氫氧化鈉，攪拌20h;
18) 用鹽酸調pH6;
19) 用IO倍體積水洗。
權利要求
1、一種以三羥甲基氨基甲烷為配基、以高濃度、高交聯度瓊脂糖凝膠為基質的親水吸附色譜介質的合成方法。
2、 如權利要求l所述的以三羥甲基氦基甲垸為配基、以高濃度、高交聯度瓊脂糖 凝膠為基質的親水吸附色譜介質的合成方法，包括如下的步驟-1) 12%濃度、30 pm平均粒徑瓊脂糖凝膠微球100 ml，在砂芯漏鬥上用水洗後替 換成丙酮，轉入反應瓶或反應器，加100ml丙酮；2) 加入10-30 g縮水甘油醚，攪拌60-120 min;3) 加入3ml的20%氫氧化鈉，攪拌8-12h;4) 加丙酮攪拌l-2h;5) 用5倍體積的丙酮洗10-20 min，用5倍體積的水洗10-20 min;6) 加200ml水，加入5-15g硫酸鈉，攪拌2-3 h;7) 加入3ml的20n/。氫氧化鈉，攪拌l-2h;8) 加入10-30 ml表氯醇，35-60 °C攪拌3-5 h;9) 用5倍體積的水洗；10) 加入200ml水，加5-15g硫酸鈉，攪拌2-3h;11) 加入3ml的20。/。氫氧化鈉，攪拌l-2h;12) 加入30-60 ml的1,4-二丁基縮水甘油醚，35-60 °C攪拌10-15 h;13) 用IO倍體積的水洗；14) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌1-2 h;15) 加入10-20 ml烯丙基溴或環氧氯丙烷或1,4-雙—丁烷二縮水甘油醚或季戊四 醇三縮水甘油醚或季戊四醇縮水甘油醚或溴代醇，攪拌6-8 h;16) 用鹽酸調pH4-6;17) 加入3-10g三羥甲基氨基甲烷，10-20ml的20氫氧化鈉，攪拌12-20h;18) 用鹽酸調pH4-6;19) 用IO倍體積水洗。
全文摘要
本發明涉及一種以三羥甲基氨基甲烷為配基、以高濃度、高交聯度瓊脂糖凝膠為基質的親水吸附色譜介質的合成方法。高濃度、高交聯度瓊脂糖凝膠介質表面有高密度的可供反應的羥基，用烯丙基溴或環氧氯丙烷或1，4-雙-丁烷二縮水甘油醚或季戊四醇三縮水甘油醚或季戊四醇縮水甘油醚或溴代醇活化，加入三羥甲基氨基甲烷作為配基，所製備的介質在親水吸附反應中作為氫鍵供體。本合成方法製備的介質剛性強，配基密度高，選擇性強，適宜分離多酚蛋白質、親水性多肽和天然有機小分子。
文檔編號B01J20/30GK101559356SQ20091008488
公開日2009年10月21日 申請日期2009年5月26日 優先權日2009年5月26日
發明者孟桂鳳, 邢思亮 申請人:北京康銘優盛生化技術有限公司