一種蒜氨酸酶的一步分離純化方法

2023-04-30 15:34:01 3

專利名稱：一種蒜氨酸酶的一步分離純化方法
技術領域：
本發明屬於新鮮大蒜中所含成分的分離純化方法，尤其涉及新鮮大蒜中的 蒜氨酸酶的分離純化方法。
背景技術：
1948年Arthur Stoll和Ewald Seebeck發現大蒜中存在一種酶，並把它命名 為蒜氨酸酶。之後對蒜氨酸酶的研究一直沒有中斷，後來研究發現蒜氨酸酶 (EC.4 4 1 4)是存在於大蒜中的一種內源酶，全稱為S-烷基-L-半胱氨酸 亞碸酶，其是一種均一的二聚體糖蛋白，大約佔蒜中可溶性蛋白質的10-12%。 完整無損的大蒜中，蒜氨酸酶和它的天然底物S-烯丙基-L-半胱氨酸亞碸(蒜 氨酸)等存在於大蒜的不同部位，蒜氨酸酶存在於液泡組織中，而底物則存在 於細胞質中，只有當大蒜破損，兩者才能相互接觸，蒜氨酸酶通過氨醯基中間 體與其輔助因子5，-磷酸吡哆醛結合在一起，經受-消除-去氨基作用裂解底物 成硫代亞磺酸酯。硫代亞磺酸酯類(R-S-S(O)-R)決定了大蒜的絕大部分特性， 是大蒜特有的風味物質，是大蒜產生的各種含硫化合物的前體物質，也是大蒜 具有許多生物活性功能的原因。故在大蒜加工過程中，蒜氨酸酶對於能否生產 出硫代亞磺酸酯保留率較高的優質乾燥大蒜製品至關重要，所以對大蒜中蒜氨 酸酶進行分離純化，以便對其性質進行研究，將具有非常重要的理論意義和實 踐意義。但直到80年代後才將此酶純化為均一的酶，且純化步驟較為煩瑣。
-般要對蒜氨酸酶粗酶液採用親和層析的方法進行初步純化，後採用 S叩herdex200凝膠柱層析才能得到純度很高的蒜氨酸酶(如Kuettner Bartholomeus E.的製備方法)。有人採用Sephadex G-200柱層析分離純化了蒜 氨酸酶，但此方法僅限於實驗室分析，不能用於產業化生產。Rabinkov曾採用 克降技術將蒜氨酸酶克隆出來，這種方法較複雜。

發明內容
本發明目的是提供一種操作較簡單的蒜氨酸酶的一步分離純化方法，並且 使分離純化製得的蒜氨酸酶可達到電泳純；而且這種方法可以使用於產業化生產。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的這種蒜氨酸酶的一步分離純化 方法是，在溫度為0-4"C的條件下，按以下步驟完成
a、均漿把新鮮的大蒜粉碎，按每千克新鮮大蒜加入800—1200mLpH6-8
的緩衝液的量計算，在粉碎後的新鮮大蒜內加入緩衝液，同時進行攪拌使 它們混合均勻；
b、提取上清液將經步驟a所得物質進行冷凍離心處理，而後提取上清
液；
c、鹽析在步驟b中提取的上清液內加入飽和硫酸胺溶液，加入同時進 行攪拌；
d、 溶解把經過鹽析後得到的上清液做冷凍離心處理，而後去掉上清液，
留—1、'濾餅，再把濾餅重新溶於pH7的緩衝液內；
e、 超濾把溶解後的濾餅用截留分子量為1萬-5萬的濾膜過濾，得到截 留物，即為新鮮大蒜的蒜氨酸粗液；
f、 分離純化把製得的新鮮大蒜的蒜氨酸粗液採用Sephacryl S-200凝膠 柱進行分離並用pH6-8的緩衝液以10-60mL/h流速進行梯度洗脫，同時用紫 外檢測儀在280nm進行檢測，收集洗脫液組分；再把它透析得到純化的蒜氨酸 酶。
在步驟a中所加入的緩衝液為磷酸緩衝液，它由NaH2P04、 Na2HP04、甘 油、NaCl、 EDTA，和磷酸吡哆醛配製而成；在粉碎後的新鮮大蒜中加入緩衝 液時，攪拌速度為每分鐘5000—10000轉；
在歩驟b中，均漿後的物質冷凍離心3 — 57分鐘；
在步驟d中，把經過鹽析後的物質，做冷凍離心的時間為10—50分鐘； 濾餅重新溶入的緩衝液為磷酸緩衝液，它由NaH2P04、 Na2HP04、蔗糖、NaCl 和磷酸吡夠醛製成；
在步驟e中，應將溶解後的濾餅先做冷凍離心處理，而後再進行超濾，超 濾是在壓力為0.25MPa的情況下操作的；
在步驟f中，緩衝液由NaH2P04、 Na2HP04、 NaC1、、磷酸吡哆醛製成。
在步驟a中所加入的磷酸緩衝液，其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由 50-80mM jNaH2P04、 50-80 mM的Na2HP04、 8-12Q/。v/v的甘油、4-6%w/v 的NaCl、 4-6mM的EDTA、 4-6pM的磷酸吡哆醛配製而成；
在歩驟c中，所加入飽和硫酸胺溶液為30-60%的飽和硫酸胺溶液；
在步驟d中，濾餅重新溶入的磷酸緩衝液其配製比例為lOOOmL磷酸緩 衝液由55 —65mM的NaH2POj[1 55—65mM的Na2HP04、 8-12%v/v的蔗糖， 1-5%wZv的NaCJ、 l-10pM的磷酸吡眵醛配製而成；
在歩驟f中所採用的緩衝液其配製比例為1000mL的緩衝液由50-80 mM WNaH2P04、 50-80 mM的Na2HP04、 l-5%w/v的NaCl、 10-40 uM的磷酸妣眵醛配製而成。
在歩驟a中所加入的磷酸緩衝液，其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由 50-60 mM的NaH2P04、 60-65 mM的Na2HP04、 10-12%v/v的甘油、4-6%w/v 的NaCl、 4-6mM的EDTA、 5pM的磷酸吡哆醛配製而成；
在步驟d中濾餅重新溶入的磷酸緩衝液其配製比例為1000mL磷酸緩衝 液由60 — 65mM的NaH2P04、 55 —60mM的Na2HP04、10%v/v的蔗糖， l-5%w/v的NaCl、 5-10|iM的磷酸吡哆醛配製而成；
在歩驟f中所採用的緩衝液其配製比例為lOOOmL的緩衝液由55-70 mM 的NaH2P04、 60-70 mM的Na2HP04、 l-2%w/v的NaCl、 20-30 U M的磷酸吡 眵醛配製而成。
在歩驟f中，如若對3-15mL經處理好的新鮮大蒜的蒜氨酸粗酶液進行分 離純化時，應將處理好的Sephacryl S-200凝膠柱填料裝成1-2x100-200cm的柱； 緩衝液應以20-40mL/h流速進行梯度洗脫，洗脫體積在128-250mL的範圍內收
J本;明用來分離純化蒜氨酸酶的操作簡便易行，僅採用一步凝膠柱層析就 可以得到純化的蒜氨酸酶，且此純化出來的蒜氨酸酶純度高，反相HPLC圖譜 測定結果表明蒜氨酸酶保留時間為3.458min，經過Sephacryl S-200凝膠柱一歩 分離蒜氨酸酶可達到很好的純化效果。SDS-PAGE電泳顯示經Sephacryl S-200 分離純化後新鮮大蒜的蒜氨酸酶達到電泳純，顯示單帶，蒜氨酸酶亞基相對分 子質量為53.8kDa，可作為一種新的蒜氨酸酶的分離純化技術手段來對蒜氨酸 酶進行分離純化，具有很大的應用前景。使用本發明中的方法，可以根據需要 分離純化量的多少裝成不同大小的凝膠柱，因此滿足了產業化生產的需要。


圖1為測定蒜氨酸酶純度的反相HPLC圖譜； 圖2為分離純化的蒜氨酸酶SDS-PAGE結果。
ft體實施方式
實施例1:以新鮮大蒜為原料按照下述方法和工藝條件製取蒜氨酸酶
a、把新鮮大蒜粉碎，而後按照1千克新鮮大蒜加入800mLpH6的緩衝液 A的量，在其內加入緩衝液A，並以5000轉/分的速度攪拌0.5分鐘。
b、提取上清液將經步驟a所得物質進行冷凍離心5 — 10分鐘，而後提
取上清液；
C、鹽析把由步驟b中提取的上清液內加入30%飽和硫酸胺溶液，同時
進行攪拌；d、 溶解把經過鹽析後的上清液做冷凍離心處理10 —20分鐘，而後去掉
丄〔:上清液，留下濾餅，再把濾餅重新溶於pH7的緩衝液B內；緩衝液B所用 的量為從10000克鹽析後的上清液中得到的濾餅應溶於600mL的緩衝液B內。
e、 超濾把濾餅溶解後的物質，用截留分子量為1萬的濾膜過濾，得到 截留物，即為新鮮大蒜的蒜氨酸粗酶液；
f、 把製得的新鮮大蒜的蒜氨酸粗液採用Sephacryl S-200凝膠柱進行分離 純化取經處理好的新鮮大蒜的蒜氨酸粗酶液3mL上柱，將處理好的Sephacryi S-200凝膠柱填料裝成1xl00cm的柱，用pH6的緩衝液C以10mL/h流速進行 梯度洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm進行檢測，在洗脫體積100mL — 200mL 的範圍內收集洗脫液組分，而後將其透析，得到純化的蒜氨酸酶。
本實施例的所有步驟均在0°C的溫度條件下操作。
歩驟a中，所用的的磷酸緩衝液A其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由 50-55 mM的NaH2P04、 50-55 mM的Na2HP04、 8-9%v/v的甘油、4%w/v 的NaCl、 4-5mM的EDTA、 4|iM的磷酸吡眵醛配製而成；
在步驟d中，所用的的磷酸緩衝液B其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液 由55mM的NaH2P04、 55mM的Na2HP04、 8%v/v的蔗糖、l%w/v的NaCl、 l|iM的磷酸吡眵醛配製而成；
在步驟g中所用的緩衝液c其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由50 mM 的NaH2P04、 50 mM的Na2HP04、 1。/。w/v的NaCl、 10uM的磷酸吡眵醛配製 而成。
實施例2:本實施例中的分離純化步驟與實施例l相同，其工藝條件如下
a、均漿在粉碎的新鮮大蒜中按照1千克新鮮大蒜加入1200mLpH8的緩衝液 A的量操作，在其內加入緩衝液A時，以10000轉/分的速度攪拌。
b、提取上清液將經步驟a所得物質進行冷凍離心57分鐘，而後提取上 清液；
C、鹽析把由步驟b中提取的上清液內加入60%飽和硫酸胺溶液，同時
進行攪拌；
d、 溶解把經過鹽析後的上清液做冷凍離心處理50分鐘，而後去掉其上
清液，留下濾餅，再把濾餅重新溶於pH7的緩衝液B內；緩衝液B所用的量 為從10000克鹽析後的上清液中得到的濾餅應溶於1400mL的緩衝液B內。
e、 超濾把濾餅溶解後的物質，以操作壓力為0.25MPa，用截留分子量 為5萬的濾膜過濾，得到新鮮大蒜的蒜氨酸粗酶液；
f、把製得的新鮮大蒜的蒜氨酸粗液採用Sephacryl S-200凝膠柱進行分離 純化時取經處理好的新鮮大蒜的蒜氨酸粗酶液15mL上柱，將處理好的 S印hacryl S-200凝膠柱填料裝成2x200cm的柱，用pH8的緩衝液C以60mL/h 流速進行梯度洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm進行檢測，在洗脫體積300mL 一400mL的範圍內收集洗脫液組分，而後將其透析，得到純化的蒜氨酸酶。
本實施例的所有步驟均在4'C的溫度條件下操作。
歩驟a中，所用的的磷酸緩衝液A其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由 80 mM的NaH2P04、 80 mM的Na2HP04、 12%v/v的甘油、6%w/v的NaCl 、 6mM的EDTA、 6jiM的磷酸吡眵醛配製而成；
在歩驟d中，所用的的磷酸緩衝液B其配製比例為1000mL磷酸緩衝液 由65mM的NaH2P04、65mM的Na2HP04、 12%v/v的蔗糖、5%w/v的NaCl、 10pM的磷酸吡眵醛配製而成；
在歩驟g中所用的緩衝液c其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由80 mM WNaH2P04、 80 mM的Na2HP04、 5。/。w/v的NaCl、 40uM的磷酸吡眵醛配製 而成。
實施例3:本實施例中的分離純化步驟與實施例1相同，其工藝條件如下:
a、 均漿在粉碎的新鮮大蒜中按照1千克新鮮大蒜加入1000mLpH7.0的 緩衝液A的量操作，在其內加入緩衝液A時，以8000轉/分的速度攪拌l分 鍾；
b、 提取上清液將經步驟a所得物質進行冷凍離心30分鐘，而後提取上 清液；
c、 鹽析把由步驟b中提取的上清液內加入45%飽和硫酸胺溶液，同時 進行攪拌；
d、 溶解把經過鹽析後的上清液做冷凍離心處理30分鐘，而後去掉其上 清液，留下濾餅，再把濾餅重新溶於pH7的緩衝液B內；緩衝液B所用的量 為從10000克鹽析後的上清液中得到的濾餅應溶於1000mL的緩衝液B內。
e、 超濾把濾餅溶解後的物質，以操作壓力為0.25MPa，用截留分子量 為3萬的濾膜過濾，得到截留物，即為新鮮大蒜的蒜氨酸粗酶液；
f、 把製得的新鮮大蒜的蒜氨酸粗液採用Sephacryl S-200凝膠柱進行分離 純化時每次取經處理好的新鮮大蒜的蒜氨酸粗酶液9mL上柱，應將處理好 的Sephacryl S-200凝膠柱填料裝成1.6x150cm的柱，用pH7.0的緩衝液C以 30mL/h流速進行梯度洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm進行檢測，在洗脫體 積128mL—143mL的範圍內收集洗脫液組分，而後將其透析，得到純化的蒜氨酸酶。
本實施例的所有步驟均在2C的溫度條件下操作。
步驟a中，所用的的磷酸緩衝液A其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由 60 mM的NaH2P04、 60 mM的Na2HP04、10%v/v的甘油、5%w/v的NaCi、 5mM的EDTA、 5pM的磷酸吡眵醛配製而成；
在歩驟d中，所用的的磷酸緩衝液B其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液 由60mM的NaH2PO4、60mM的Na2HP04、 10%v/v的蔗糖、l%w/v的NaCl、 5pM的磷酸吡眵醛配製而成；
在歩驟g中所用的緩衝液c其配製比例為1000mL磷酸緩衝液由60 mM 的NaH，—P04、 60 mM的Na2HP04、 P/。w/v的NaCl、 25 u M的磷酸吡哆醛配製 而成。
實施例4:本實施例中的分離純化步驟與實施例1相同，其工藝條件如下
a、 均漿在粉碎的新鮮大蒜中按照1千克新鮮大蒜加入900mLpH7.0的緩 衝液A的量操作，在其內加入緩衝液A時，以7000轉/分的速度攪拌1.5分 鍾；
b、 提取上清液將經步驟a所得物質先採用3000轉/分的速度進行冷凍 離心3分鐘，再採用10000轉/分的速度冷凍離心10分鐘，而後提取上清液；
c、 鹽析把由步驟b中提取的上清液內加入35%飽和硫酸胺溶液，同時 進行20分鐘攪拌；
d、 溶解把經過鹽析後的上清液做冷凍離心處理20分鐘，而後去掉其上 清液，留下濾餅，再把濾餅重新溶於pH7的緩衝液B內；緩衝液B所用的量 為從10000克鹽析後的上清液中得到的濾餅應溶於700mL的緩衝液B內
e、 超濾把濾餅溶解後的物質，以操作壓力為0.25MPa，用截留分子量 為2萬的濾膜過濾，得到新鮮大蒜的蒜氨酸粗酶液；
i'、把製得的新鮮大蒜的蒜氨酸粗液採用Sephacryi S-200凝膠柱進行分離 純化時每次取經處理好的新鮮大蒜的蒜氨酸粗酶液5mL上柱，並把處理好 的Sephacryi S-200凝膠柱填料裝成1.5x160cm的柱，用pH6的緩衝液C以 20mL/h流速進行梯度洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm進行檢測，在洗脫體 積llOmL—120mL的範圍內收集洗脫液組分，而後將其透析，得到純化的蒜氨 酸酶。
本實施例的所有步驟均在rc的溫度條件下操作。
歩驟a中，所用的的磷酸緩衝液A其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由 55mM的NaH2P04、 55 mM的Na2HP04、 9%v/v的甘油、5%w/v的NaCl、 4mM
的EDTA、 6pM的磷酸吡哆醛配製而成；
在步驟d中，所用的的磷酸緩衝液B其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液 由58mM的NaH2P04、 62mM的Na2HP04、 9%v/v的蔗糖、2%w/v的NaCl、
2(lM的磷酸吡P多醛配製而成；
在步驟g中所用的緩衝液c其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由55 mM 的NaH2P4、 55 mM的Na2HP04、 3%w/v的NaCl、 15 u M的磷酸吡眵醛配製而成。
實施例5:本實施例中蒜氨酸酶的分離純化步驟與實施例1相同，其工藝條
件為
a、 均漿在粉碎的新鮮大蒜中按照l千克新鮮大蒜加入1100mLpH7.0的 緩衝液A的量操作，在其內加入緩衝液A時，以9000轉/分的速度攪拌2分 鍾；
b、 提取上清液將經步驟a所得物質先採用4000轉/分的速度進行冷凍 離心7分鐘，再採用20000轉/分的速度冷凍離心30分鐘，而後提取上清液；
c、 鹽析把由步驟b中提取的上清液內加入50%飽和硫酸胺溶液，同時
進行30分鐘攪拌；
d、 溶解把經過鹽析後的上清液做冷凍離心處理40分鐘，而後去掉其上
清液，留下濾餅，再把濾餅重新溶於pH7的緩衝液B內；緩衝液B所用的量 為從10000克鹽析後的上清液中得到的濾餅應溶於1100mL的緩衝液B內。
e、 超濾把濾餅溶解後的物質，先做冷凍離心處理15分鐘，而後以操作 壓力為0.25MPa，用截留分子量為4萬的濾膜過濾，得到新鮮大蒜的蒜氨酸粗 酶液；
f、 把製得的新鮮大蒜的蒜氨酸粗液採用Sephacryl S-200凝膠柱進行分離 純化時每次取經處理好的新鮮大蒜的蒜氨酸粗酶液10mL上柱，並把處理好 的Sephacryl S-200凝膠柱填料裝成1.5x180cm的柱，用pH7的緩衝液C以 40mL/h流速進行梯度洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm進行檢測，在洗脫體 積130mL—150mL的範圍內收集洗脫液組分，而後將其透析，得到純化的蒜氨
"本實施例的所有步驟均在3"C的溫度條件下操作。
步驟a中，所用的的磷酸緩衝液A其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由 65mM的NaH2P04、 70 mM的Na2HP04、 1P/。v/v的甘油、6y。w/v的NaCl、 5mM的EDTA、 6|iM的磷酸吡眵醛配製而成；
在歩驟d中，所用的的磷酸緩衝液B其配製比例為1000mL磷酸緩衝液
由62mM的NaH2P04、 57mM的Na2HP04、 11。/。v/v的蔗糖、4。/ow/v的NaCJ、 8fiM的磷酸吡眵醛配製而成；
在歩驟g中所用的緩衝液c其配製比例為1000mL磷酸緩衝液由65mM的 NaH2P04、 65 mM WNa2HP04、 4。/。w/v的NaCl、 30 P M的磷酸吡眵醛配製而成。
實施例6:本實施例中蒜氨酸酶的分離純化步驟與實施例1相同，其工藝條
a、 均漿在粉碎的新鮮大蒜中按照1千克新鮮大蒜加入1050mLpH7.0的 緩衝液A的量操作，在其內加入緩衝液A時，以9500轉/分的速度攪拌2分
鍾；
b、 提取上清液將經步驟a所得物質先採用3500轉/分的速度進行冷凍 離心5分鐘，再採用18000轉/分的速度冷凍離心35分鐘，而後提取上清液；
c、 鹽析把由步驟b中提取的上清液內加入55%飽和硫酸胺溶液，同時 進行40分鐘攪拌；
d、 溶解把經過鹽析後的上清液做冷凍離心處理30分鐘，而後去掉其上
清液，留下濾餅，再把濾餅重新溶於pH7的緩衝液B內；緩衝液B所用的量 為從10000克鹽析後的上清液中得到的濾餅應溶於800mL的緩衝液B內。
e、 超濾把濾餅溶解後的物質，先做冷凍離心處理15分鐘，而後以操作 Hi力為0.25MPa，用截留分子量為3萬的濾膜過濾，得到新鮮大蒜的蒜氨酸粗 酶液；
f、 把製得的新鮮大蒜的蒜氨酸粗液採用Sephacryl S-200凝膠柱進行分離 純化時每次取經處理好的新鮮大蒜的蒜氨酸粗酶液12mL上柱，並把處理好 的Sephacryl S-200凝膠柱填料裝成1.8x160cm的柱，用pH7的緩衝液C以 50mL/h流速進行梯度洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm進行檢測，在洗脫體 積330mL—350mL的範圍內收集洗脫液組分，而後將其透析，得到純化的蒜氨
本實施例的所有步驟均在4i:的溫度條件下操作。
歩驟a中，所用的的磷酸緩衝液A其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由 70mM的NaH2P04、 75mM的Na2HP04、 8%v/v的甘油、5%w/v的NaCl、 5mM 的EDTA、 5pM的磷酸吡哆醛配製而成；
在步驟d中，所用的的磷酸緩衝液B其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液 由58mM的NaH2P04、61mM的Na2HP04、 10%v/v的蔗糖、2。/。w/v的NaCl、 6pM的磷酸吡眵醛配製而成；
在歩驟g中所用的緩衝液c其配製比例為1000mL磷酸緩衝液由70mM的 NaH2P04、 75 mM的Na2HP04、 2%w/v的NaCl、 20 y M的磷酸卩比眵醛配製而成。
實施例7:本實施例中
在步驟a中，所用的的磷酸緩衝液A其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液 由52mM的NaH2P04、 78mM的Na2HP04、 9%v/v的甘油、5%w/v的NaCl、 6mM的EDTA、 2.5pM的磷酸吡卩多醛配製而成；
在歩驟d中，所用的的磷酸緩衝液B其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液 山63mM的NaH2P04、 54mM的Na2HP04、 9%v/v的蔗糖、3%w/v的NaCJ、 4jiM的磷酸吡n多醛配製而成；
在歩驟g中所用的緩衝液c其配製比例為1000mL磷酸緩衝液由76mM的 NaH2P04、 52 mM的Na2HP04、 3。/。w/v的NaCl、 35 u M的磷酸吡眵醛配製而 成。本實施例中的分離純化步驟，及其他工藝條件均與實施例1相同。
實施例8:本實施例中
在步驟a中，所用的的磷酸緩衝液A其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液 由50mM WNaH2P04、 60mM的Na2HP04、 10。/ov/v的甘油、4。/。w/v的NaCl、 4mM的EDTA、 5pM的磷酸吡哆醛配製而成；
在歩驟d中，所用的的磷酸緩衝液B其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液 由65mM的NaH2P04、 55mM的Na2HP04、 10%v/v的蔗糖、5%w/v的NaCl、
l(VM的磷酸吡眵醛配製而成；
在歩驟g中所用的緩衝液c其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由70mM的 NaH2P04、 70mM的Na2HP04、 2%w/v的NaCl、 30 U M的磷酸吡眵醛配製而 成。本實施例中的分離純化步驟，及其他工藝條件均與實施例3相同。
實施例9:本實施例中
在步驟a中，所用的的磷酸緩衝液A其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液 由60mM WNaH2P04、 65mM的Na2HP04、 12。/。v/v的甘油、6%w/v的NaCI 、 6mM的EDTA、 5pM的磷酸吡哆醛配製而成；
在歩驟d中，所用的的磷酸緩衝液B其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液 由60mM的NaH2P04、 60mM的Na2HP04、 10%v/v的蔗糖、l%w/v的NaC畫、
5pM的磷酸吡眵醛配製而成；
在歩驟g中所用的緩衝液c其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由55mM的 NaH2P04、 60mM的Na2HP04、 l%w/v的NaCl、 20 y M的磷酸吡卩多醛配製而 成。本實施例中的分離純化步驟及其他工藝條件均與實施例6相同。
權利要求
1、一種蒜氨酸酶的一步分離純化方法，其特徵是，在溫度為0-4℃的條件下，按以下步驟完成a、均漿把新鮮的大蒜粉碎，按每千克新鮮大蒜加入800-1200mL pH6-8的緩衝液的量計算，在粉碎後的新鮮大蒜內加入緩衝液，同時進行攪拌使它們混合均勻；b、提取上清液將經步驟a所得物質進行冷凍離心處理，而後提取上清液；c、鹽析在步驟b中提取的上清液內加入飽和硫酸胺溶液，加入同時進行攪拌；d、溶解把經過鹽析後得到的上清液做冷凍離心處理，而後去掉上清液，留下濾餅，再把濾餅重新溶於pH7的緩衝液內；e、超濾把溶解後的濾餅用截留分子量為1萬-5萬的濾膜過濾，得到截留物，即為新鮮大蒜的蒜氨酸粗液；f、分離純化把製得的新鮮大蒜的蒜氨酸粗液採用Sephacryl S-200凝膠柱進行分離並用pH6-8的緩衝液以10-60mL/h流速進行梯度洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm進行檢測，收集洗脫液組分；再把它透析得到純化的蒜氨酸酶。
2、 根據權利要求1所述的分離純化方法，其特徵是，在步驟a中所加入 的緩衝液為磷酸緩衝液，它由NaH2P04、 Na2HP04、甘油、NaCl、 EDTA，和 磷酸吡哆醛配製而成；在粉碎後的新鮮大蒜中加入緩衝液時，攪拌速度為每 分鐘5000—10000轉；在歩驟b中，均漿後的物質冷凍離心3 — 57分鐘；在步驟d中，把經過鹽析後的物質，做冷凍離心的時間為10—50分鐘 濾餅重新溶入的緩衝液為磷酸緩衝液，它由NaH2P04、 Na2HP04、蔗糖、NaC! 和磷酸吡眵醛製成；在歩驟e中，應將溶解後的濾餅先做冷凍離心處理，而後再進行超濾，超 濾是在壓力為0.25MPa的情況下操作的；在步驟f中，緩衝液由NaH2P04、 Na2HP04、 NaC1、、磷酸吡哆醛製成。
3、 根據權利要求2所述的分離純化方法，其特徵是，在步驟a中所加入 的磷酸緩衝液，其配製比例為1000mL磷酸緩衝液由50-80 mM的NaH2PC^、50-80 mM的Na2HP04、 8隱12。/。v/v的甘油、4-6%w/v的NaCl、4-6mM的EDTA、4-6pM的磷酸吡眵醛配製而成；在歩驟c中，所加入飽和硫酸胺溶液為30-60%的飽和硫酸胺溶液； 在歩驟d中，濾餅重新溶入的磷酸緩衝液其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液山55 —65mM的NaH2POjD 55 — 65mM的Na2HP04、 8-12%v/v的蔗糖，1-5%w/v的NaCl、 l-10(iM的磷酸吡哆醛配製而成；在歩驟f中所採用的緩衝液其配製比例為lOOOmL的緩衝液由50-80 mM的NaH2P04、 50-80 mM的Na2HP04、 l-5%w/v的NaCl、 10-40U M的磷酸吡哆醛配製而成。
4、 根據權利要求3所述的分離純化方法，其特徵是，在步驟a中所加入 的磷酸緩衝液，其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝液由50-60 mM的NaH2P04、 60-65 mM的Na2HP04、 10-12%v/v的甘油、4-6%w/v的NaCl、4-6mM的EDTA 、 5pM的磷酸吡卩多醛配製而成；在歩驟d中濾餅重新溶入的磷酸緩衝液其配製比例為lOOOmL磷酸緩衝 液山60 — 65mM的NaH2P04、 55 —60mM的Na2HP04、10%v/v的蔗糖， 卜5。/。w/v的NaCl、 5-10}iM的磷酸吡哆醛配製而成；在歩驟f中所採用的緩衝液其配製比例為lOOOmL的緩衝液由55-70mM 的NaH2P04、 60-70 mM的Na2HP04、 l-2%w/v的NaCl、 20-30 M的磷酸吡 哆醛配製而成。
5、 根據權利要求1、 2、 3、 4所述的分離純化方法，其特徵是，在步驟f 中，如若對3-15mL經處理好的新鮮大蒜的蒜氨酸粗酶液進行分離純化時，應 將處理好的Sephacryl S-200凝膠柱填料裝成l-2xl00-200cm的柱；緩衝液應以 20-40mL/h流速進行梯度洗脫，洗脫體積在128-250mL的範圍內收集洗脫液組分。
全文摘要
一種蒜氨酸酶的一步分離純化方法是，在溫度為0-4℃的條件下，進行均漿、提取上清液、鹽析、溶解、超濾而後製成新鮮大蒜的蒜氨酸粗液，把大蒜的蒜氨酸粗液採用Sephacryl S-200凝膠柱進行分離並用pH6-8的緩衝液以10-60mL/h流速進行梯度洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm進行檢測，收集洗脫液組分，再把它透析得到純化的蒜氨酸酶。本發明用來分離純化蒜氨酸酶的操作簡便易行，使用本發明中的方法，可以根據需要分離純化蒜氨酸酶量的多少裝成不同大小的凝膠柱，以滿足產業化生產的需要。
文檔編號C12N9/00GK101191126SQ20061012829
公開日2008年6月4日 申請日期2006年11月28日 優先權日2006年11月28日
發明者坤 吳, 瑜 李, 許時嬰 申請人:河南農業大學