朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷i的提取方法及應用的製作方法

2023-04-30 09:53:31 1

專利名稱：朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷i的提取方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法及應用。
背景技術：
淫羊藿為小檗科植物淫羊藿(Epim edium brevi2cornum Maximl)、箭葉淫羊藿 [El sagitta tum(Sieblet Zuecl)Maximl](El pubescen sMax2iml)
羊藿(El wushanense Tl Sl Ying)或朝鮮淫羊藿(Elkoreanam Nakai)的乾燥地上部分， 具補腎壯陽、強筋健骨、祛風除溼之功效，常用於治療陽痿不舉、小便淋漓、腰膝無力以及冠 心病、慢性氣管炎、神經衰弱和小兒麻痺等症。現代化學成分研究顯示，淫羊藿的主要有效成份是淫羊藿總黃酮(淫羊藿苷、淫 羊藿次苷)和淫羊藿多糖，其總黃酮中的活性成分被認為是8位具有異戊烯基(及其衍生 基團)的黃酮醇及其苷類。現代藥理學研究表明，淫羊藿黃酮具有調節機體免疫功能，增強雄性生殖功能，擴 張血管，改善血液流變學，促進造血系統功能，抗氧化輻射，抗骨質疏鬆等多種功效。近年 來，對淫羊藿苷的口服代謝研究表明，在腸道菌群的作用下，淫羊藿苷主要代謝成次苷和苷 元，原型的生物利用度低。淫羊藿次苷I是淫羊藿苷的體內代謝產物之一，Lenoble等報導 了淫羊藿次苷I對PDE-25酶具有很好的抑制作用。目前，對淫羊藿總黃酮的提取工藝及淫羊藿苷的分離提取、理化性質、結構確證等 研究已有大量報導，但對淫羊藿次苷I的提取方法研究甚少。國內常以水或乙醇為溶劑(張琳，張瑾，現代中藥研究與實踐Vol. 18(5)2004， 63-64)提取淫羊藿中總黃酮；採用柱色譜法(鄭訓海等，中草藥=Vol. (11)2002,964-967) 對淫羊藿中不同化學成分進行分離。國外也有採用柱色譜法分離提取淫羊藿次苷的報導 (Lenoble, et al. 「 Compositions comprising icariside I and anhydroicaritin and methods for making the same " Unit States Patent 2002 (6399579)) 。fefei普^屯U 黃酮類化合物存在由不可逆吸附導致產率低的缺點，而且分離過程十分耗時、耗力，不利於 黃酮化合物的大量分離提取。因此，雖然對淫羊藿中各類黃酮化合物的研究十分迫切，但由 於分離提取困難，研究進展十分緩慢。

發明內容
為了消除因為柱色譜分離純化黃酮類化合物存在由不可逆吸附導致產率低，而且 分離過程十分耗時、耗力，不利於黃酮化合物的大量分離提取的缺點，本發明提供了朝鮮淫 羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法及應用，不僅可以避免因為色譜柱的的不可逆吸附而導 致產率低，而且可以大量提取高純度的淫羊藿次苷I，從而更加推動了對其研究的進展。本發明的目的是提供朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法，其步驟和條件如 下a將朝鮮淫羊藿葉用是其質量15倍的體積濃度為70%乙醇回流4小時，濾出乙醇
3提取液，將回流過的藥渣用是朝鮮淫羊藿葉質量10倍的體積濃度為70%乙醇回流提取2小 時，濾出乙醇提取液，合併兩次濾液；b濾液在50°C下減壓蒸出溶劑，得到提取物，提取物中所含的水分不多於其質量 的5% ；c用朝鮮淫羊藿葉質量2倍的無水乙醇溶解步驟b中所得到的提取物，加入濃鹽 酸，朝鮮淫羊藿葉質量克濃鹽酸的體積HiL為1 0. 05 0. 15，在50°C水浴加熱15 25 小時，室溫放置過夜，過濾；d濾液在50°C減壓濃縮至其體積的20%，加入朝鮮淫羊藿葉質量2倍的蒸餾水析 出沉澱，沉澱在50°C下用體積濃度為20%的乙醇溶液洗滌，洗滌後的沉澱在50°C下真空幹 燥，得到淫羊藿次苷I粉末。本發明的淫羊藿次苷I具有對垂體後葉素誘發大鼠心肌缺血的保護作用。其具體 表現在可以抑制T波的作用；可以抑制J點位移變化的作用。還證實淫羊藿次苷I對豚鼠 離體心臟有保護作用。其具體表現在可以增加豚鼠的冠脈流量，具體見實施例8-9。本發明的朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的應用，其用於製備治療心臟病的藥物。有益效果本發明提供了朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法，不僅可以避 免因為色譜柱的的不可逆吸附而導致產率低，而且可以大量提取高純度的淫羊藿次苷I，從 而更加推動了對其研究的進展。本發明提供了朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法。經高效液相色譜法含量 測定，淫羊藿次苷I的質量提取率在60%以上，質量易控，方法簡便快速。本發明對淫羊藿次苷I進行了藥理方面的研究，證實淫羊藿次苷I具有對垂體後 葉素誘發大鼠心肌缺血的保護作用。其具體表現在可以抑制T波的作用；可以抑制J點位 移變化的作用。淫羊藿次苷I對豚鼠離體心臟有保護作用。其具體表現在可以增加豚鼠的 冠脈流量。本發明的朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的應用，其用於製備治療心臟病的藥物。


圖1實施例1的總黃酮含量測定的HPLC譜圖。圖2為實施例2的200-600nm波長範圍內的淫羊藿苷標準品的掃描圖。圖3為實施例3的標準品淫羊藿苷在270nm下的標準曲線。圖4為實施例4所得到的淫羊藿次苷I單體200-800nm的紫外掃描圖。圖5為實施例5所得到的淫羊藿次苷I的HPLC譜圖。圖6為實施例6所得到的淫羊藿次苷I的HPLC譜圖。圖7為實施例7所得到的淫羊藿次苷I的HPLC譜圖。上述圖1、圖5-圖7中的液相條件如下梯度洗脫波長272nm，流速lml/min，柱溫30°C，色譜柱採用ODS-C18填料色譜 柱(4. 6 X 250mm, 5 μ m)島津公司
時間(min)
0102025303545505具體實施例方式實施例1稱取朝鮮淫羊藿葉5克，用75mL體積濃度為70%乙醇回流4小時，濾出乙醇提取 液，將回流過的藥渣用50mL的體積濃度為70%乙醇回流提取2小時，濾出乙醇提取液，合 並兩次濾液，將濾液定溶至200mL。精密量取0. 2mL濾液定溶至25mL的容量瓶中，在270nm 下測定吸光度值為0. 730 ；取IOuL該溶液測其HPLC色譜圖，HPLC色譜圖結果見附圖1。實施例2取2. 30mg淫羊藿苷標準品於25mL容量瓶中，用甲醇定溶，其濃度為0. 092mg/mL 的淫羊藿苷標準溶液。在200 600nm下進行紫外掃描，270nm為淫羊藿苷最大吸光度值。 結果見附圖2。實施例3根據實施例2製備濃度為0. 092mg/mL的淫羊藿苷標準溶液。分別取此標準溶 液1. OmLU. 5mL、2. OmL,2. 5mL、3. OmL於5mL的容量瓶中，甲醇定溶，配置成濃度分別為 0. 0184mg/mL、0. 0276mg/mL、0. 0368mg/mL、0. 0460mg/mL、0. 0552mg/mL 的溶液，測定其吸光 度值。繪製淫羊藿苷濃度相對於吸光度的標準曲線。根據標準曲線可以得出，實施例1中 朝鮮淫羊藿總黃酮的提取率可達12%。結果見附圖3。實施例4用質量含量為99 %以上的淫羊藿次苷I單體配置濃度分別為0. 0404mg/mL、 0. 1212mg/mL、0. 2020mg/mL、0. 2828mg/mL、0. 3636mg/mL 的淫羊藿次苷 I 標準溶液，分別取 IOuL進行高效液相考察。以峰面積對標準溶液濃度進行線性回歸，得出工作曲線方程。結 果見附圖4。質量含量為99%以上的淫羊藿次苷I單體的製備方法如下a按體積比為5 5 4. 5 5. 5分別量取正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水於IOOOmL 的分液漏鬥中，充分震蕩，靜置，放置過夜；b以澄清的上相為固定相，下相為流動相，以lOmL/min的流速使固定相充滿螺旋 管柱，然後螺旋管柱以1600rpm/min的速度旋轉，穩定IOmin後，以1. OmL/min的速度泵入 流動相，使體系達到流體動力學平衡；c根據高速逆流色譜的進樣系統選擇進樣體積，以1. Omg/mL的溶液濃度進樣，下 相溶解淫羊藿次苷I提取物樣品，檢測器波長為272nm，溫度為10°C。其中所述的體積不得 少於3mL ；d第一個出現的大峰不是淫羊藿次苷I，第二個出現的峰為朝鮮淫羊藿葉中提取 的淫羊藿次苷I單體，溶液顏色呈熒黃色，經過冷凍乾燥，得淫羊藿次苷I單體粉末。
實施例5a稱取朝鮮淫羊藿葉100克，用1500mL體積濃度為70%乙醇回流4小時，濾出乙 醇提取液，將回流過的藥渣用IOOOmL的質量濃度為70%乙醇回流提取2小時，濾出乙醇提 取液，合併兩次濾液；b濾液在50°C下減壓蒸出溶劑，，提取物中所含的水分不能多於其質量的5% ；c用200mL無水乙醇溶解b步驟中所得的提取物，用朝鮮淫羊藿葉質量2倍的無水 乙醇溶解步驟b中所得到的提取物，加入濃鹽酸，朝鮮淫羊藿葉質量克濃鹽酸的體積mL 為1 0. 05，在50°C水浴加熱15小時，室溫放置過夜，過濾；d濾液在50°C減壓濃縮至原體積的20%，加入200mL蒸餾水析出沉澱，沉澱在 50°C下用濃度為20%乙醇溶液洗滌四次，每次用IOOmL,洗滌後的沉澱在50°C下真空乾燥， 得到得到淫羊藿次苷I提取物。該提取物稱重為5. 6760克。其HPLC色譜圖結果見附圖5。實施例6a稱取朝鮮淫羊藿葉100克，用1500mL質量濃度為70 %乙醇回流4小時，濾出乙 醇提取液，將回流過的藥渣用IOOOmL的質量濃度為70%乙醇回流提取2小時，濾出乙醇提 取液，合併兩次濾液；b濾液在50°C下減壓蒸出溶劑，得到的提取物中所含的水分不能多於其質量的 5% ；c用200mL無水乙醇溶解b步驟中所得的提取物，加入濃鹽酸，朝鮮淫羊藿葉質量 克濃鹽酸的體積HiL為1 0. 15，在50°C水浴加熱25小時，室溫放置過夜，過濾；d濾液在50°C減壓濃縮至原體積的20%，加入200mL蒸餾水析出沉澱，沉澱在 50°C下用濃度為20%乙醇溶液洗滌四次，每次用IOOmL,洗滌後的沉澱在50°C下真空乾燥， 得到得到淫羊藿次苷I提取物。該提取物稱重為5. 3560克。其HPLC色譜圖結果見附圖6。實施例7a稱取朝鮮淫羊藿葉100克，用1500mL體積濃度為70%乙醇回流4小時，濾出乙 醇提取液，將回流過的藥渣用IOOOmL的體積濃度為70%乙醇回流提取2小時，濾出乙醇提 取液，合併兩次濾液；b濾液在50°C下減壓蒸出溶劑，得到的提取物中所含的水分不能多於其質量的 5% ；c用200mL無水乙醇溶解b步驟中所得的提取物，加入濃鹽酸，朝鮮淫羊藿葉質量 克濃鹽酸的體積HiL為1 0. 1，在50°C水浴加熱20小時，室溫放置過夜，過濾；d濾液在50°C減壓濃縮至原體積的20%，加入200mL蒸餾水析出沉澱，沉澱在 50°C下用濃度為20%乙醇溶液洗滌四次，每次用IOOmL,洗滌後的沉澱在50°C下真空乾燥， 得到得到淫羊藿次苷I提取物。該提取物稱重6560克。其HPLC色譜圖結果見附圖7。實施例8淫羊藿次苷對垂體後葉素誘發大鼠心肌缺血的保護作用將雄性Wistar大鼠(180g-220g) 40隻，隨機分成4組，每組10隻，分別為模型對 照組淫羊藿次苷組、複方丹參滴丸組。複方丹參滴丸組和1、2號樣品組以200mg/kg的劑量 灌胃相應的藥物，每天一次，共7天，模型對照組灌胃等體積的蒸餾水。第七天給藥後30min，將大鼠用25%烏拉坦(1. 2g/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，
6記錄標準II導聯心電圖。5min後舌下靜脈注射垂體後葉素0. 5U/kg。在IOs內推完。分 別記錄注射前(Os)及注射後第15，30s及l，2，5，10min的心電圖，觀察T波和J波的變化。統計學處理數據結果以f 土 S表示，進行F檢驗和組間t檢驗。1.淫羊藿次苷I對T波的影響。結果見表1。結論淫羊藿次苷I組在注射PIT後的T波抬高均明顯低於模型組，淫羊藿次苷有 抑制T波的作用。2.淫羊藿次苷I對J波的影響。結果見表2。結論淫羊藿次苷I在注射PIT後的J點位移變化均明顯低於模型組，結果顯示淫 羊藿次苷I具有抑制J點位移變化的作用。實施例9淫羊藿次苷I對豚鼠離體心臟的保護作用健康雄性豚鼠30隻，體重為350g_380g，腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻 醉後，固定，打開胸腔，剪斷腔靜脈、主動脈及心臟周圍組織，迅速摘出心臟置於 4°C Krebs-Henseleit液(K_H液)中輕輕擠出心臟餘血並適當修剪後，主動脈插管，置於 Langendorf灌注裝置行經主動脈灌注，K-H液灌流(K-H液成分如下(g/L) =NaCl 6. 92，KCl 0. 35，CaCI2 ·2Η20 0. 38, KH2PO4 0. 16，MgSO4O. 29, NaHCO3 2. 1，葡萄糖 2. Ο,ρΗ 7. 4)裝入密閉 灌流瓶中，下放出一定量的灌流液，上與氧氣瓶相連充入相應量的氧氣(95% O2, 5% CO2), 用力搖勻。超級恆溫器維持灌流液恆溫37°C，排盡灌流管道內空氣。灌流壓力由一插入灌 流瓶底與大氣相通的玻璃管維持恆定(灌流液面距心臟70cm)。用蛙心夾夾住心尖，經滑 輪與彈簧裝置連接到張力換能器，用BL-420生物機能實驗系統記錄心率；調節灌流液流速 使心臟冠脈流量為5-8ml/min，心臟灌流適應IOmin後趨於穩定，測量每分鐘冠脈流量，連 續測3min，若相差不大，則取其平均值作為給藥前冠脈流量。然後分別給淫羊藿次苷(6mg/ ml)和陽性藥(西地蘭0. 8mg/ml)，給藥體積lmL，給藥結束後連續測量IOmin內每分鐘冠脈 流量並開始記錄心跳，以其平均值作為給藥後的冠脈流量和心率。統計學處理數據結果以表示，進行F檢驗和組間t檢驗。結果見表3。結論淫羊藿次苷I可以使大鼠離體心臟冠脈流量比給藥前明顯增加，具有顯著 性差異，淫羊藿次苷I有增加大鼠心臟冠脈流量的作用。
表3受試藥物對豚鼠離體心臟冠脈流量的影響(i 土S) 與給藥前比較*P < 0. 05。
權利要求
朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法，其特徵在於，其步驟和條件如下a將朝鮮淫羊藿葉用是其質量15倍的體積濃度為70％乙醇回流4小時，濾出乙醇提取液，將回流過的藥渣用是朝鮮淫羊藿葉質量10倍的體積濃度為70％乙醇回流提取2小時，濾出乙醇提取液，合併兩次濾液；b濾液在50℃下減壓蒸出溶劑，得到提取物，提取物中所含的水分不多於其質量的5％；c用朝鮮淫羊藿葉質量2倍的無水乙醇溶解步驟b中所得到的提取物，加入濃鹽酸，朝鮮淫羊藿葉質量克∶濃鹽酸的體積mL為1∶0.05～0.15，在50℃水浴加熱15～25小時，室溫放置過夜，過濾；d濾液在50℃減壓濃縮至其體積的20％，加入朝鮮淫羊藿葉質量2倍的蒸餾水析出沉澱，沉澱在50℃下用體積濃度為20％的乙醇溶液洗滌，洗滌後的沉澱在50℃下真空乾燥，得到淫羊藿次苷I粉末。
2.如權利要求1所述的朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法，其特徵在於，所述的 步驟c，朝鮮淫羊藿葉質量克濃鹽酸的體積mL為1 0.05，在50°C水浴加熱15小時，其 餘的同權利要求1。
3.如權利要求1所述的朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法，其特徵在於，所述的 步驟C，朝鮮淫羊藿葉質量克濃鹽酸的體積mL為1 0.15，在50°C水浴加熱25小時，其 餘的同權利要求1。
4.如權利要求1所述的朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法，其特徵在於，所述的 步驟c，朝鮮淫羊藿葉質量克濃鹽酸的體積mL為1 0.10，在50°C水浴加熱20小時，其 餘的同權利要求1。
全文摘要
本發明涉及朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法及應用。所述的提取方法，不僅可以避免因為色譜柱的的不可逆吸附而導致產率低，而且可以大量提取高純度的淫羊藿次苷I。所述的提取方法，經高效液相色譜法進行含量測定，淫羊藿次苷I的質量提取率在60％以上，質量易控，方法簡便快速。本發明對淫羊藿次苷I進行了藥理方面的研究，證實淫羊藿次苷I具有對垂體後葉素誘發大鼠心肌缺血的保護作用。其具體表現在可以抑制T波的作用；可以抑制J點位移變化的作用。淫羊藿次苷I對豚鼠離體心臟有保護作用。其具體表現在可以增加豚鼠的冠脈流量。本發明得到的淫羊藿次苷I，其用於製備治療心臟病的藥物。
文檔編號A61K31/7048GK101899077SQ20101020603
公開日2010年12月1日 申請日期2010年6月23日 優先權日2010年6月23日
發明者丁一迪, 劉志強, 劉忠英 申請人:吉林大學;中國科學院長春應用化學研究所