基於巨大芽孢桿菌的亞硝酸鹽還原酶小亞基外源表達方法

2023-04-30 10:19:01

基於巨大芽孢桿菌的亞硝酸鹽還原酶小亞基外源表達方法
【專利摘要】一種基因工程【技術領域】的基於巨大芽孢桿菌的亞硝酸鹽還原酶小亞基外源表達方法，通過將測序得到的亞硝酸鹽還原酶大亞基的基因序列通過引物序列擴增並連接到大腸桿菌表達載體中，從而獲得重組表達載體，並進一步將重組表達載體導入大腸桿菌中，篩選到含有目的基因的轉基因重組菌。本發明克服現有技術中由於亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列在天然的巨大芽孢桿菌中表達量非常低，嚴重限制使用效果，應用基因工程菌表達本發明所述的亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列，實現極大的提高該基因的表達量。
【專利說明】基於巨大芽孢桿菌的亞硝酸鹽還原酶小亞基外源表達方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及的是一種基因工程【技術領域】的方法，具體是一種亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列、含有該基因的重組載體、重組菌以及利用該重組菌產生該基因的表達產物及其應用。
【背景技術】
[0002]亞硝酸鹽還原酶是一類催化亞硝酸鹽還原的酶。亞硝酸鹽廣泛存在於醃製食物或飼料中。食品中亞硝酸鹽含量過高，會使體內血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，降低血液載氧能力，造成高鐵血紅蛋白血症，對人體造成嚴重危害。亞硝酸鹽還可在人體內與仲胺、叔胺和氨基化合物反應形成強致癌物亞硝胺化合物，從而誘發消化系統癌變。鑑於土壤和食品中超標亞硝酸鹽鹽汙染可引起環境與食品安全問題，人們正在努力尋找有效控制或降解亞硝酸鹽的方法，生物酶法成為消除食品亞硝酸鹽的一條切實可行的途徑。

【發明內容】

[0003]本發明針對現有技術存在的上述不足，提出一種基於巨大芽孢桿菌的亞硝酸鹽還原酶小亞基外源表達方法，克服現有技術中由於亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列在天然的巨大芽孢桿菌中表達量非常低，嚴重限制使用效果，應用基因工程菌表達本發明所述的亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列，實現極大的提高該基因的表達量。
[0004]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0005]本發明涉及一種 亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其長度為327個鹼基對，編碼108個胺基酸，分子量約為11.7KD。
[0006]本發明涉及一種基於巨大芽孢桿菌的亞硝酸鹽還原酶小亞基外源表達方法，將測序得到的亞硝酸鹽還原酶大亞基的基因序列(Bm-Nas E)通過引物序列擴增並連接到大腸桿菌表達載體中，從而獲得重組表達載體，並進一步將重組表達載體導入大腸桿菌中，篩選到含有目的基因的轉基因重組菌。
[0007]所述的測序是指:以巨大芽孢桿菌NCT-2的基因組DNA為模板，用上述兩對引物進行PCR擴增，然後將擴增產物進行電泳檢測；並將擴增產物切膠回收後連接到pMD19-T(Simple)載體上進行測序。
[0008]所述的引物序列擴增採用的引物為PCR擴增採用的引物的5'端分別設計了 EcoRI和Stu I酶切位點用於連接到表達載體，即:
[0009]正向引物Nas E-Eco R 1-F:
[0010]5' -CGGAATTCATGGTGAATAAAAACATTACAAAAG-3'以及
[0011]反向引物Nas E-Stu 1-R:
[0012]5' -AAGGCCTTTATTCCTCAATTAAAAGATACAGCA-3'組成。
[0013]所述的大腸桿菌表達載體為pET_41a載體。
[0014]所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。[0015]所述的巨大芽孢桿菌NCT-2 (Bacillus megaterium),保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學微生物研究所；保存日期為2011年3月21日，保藏編號為CGMCC N0.4698。
[0016]所述的重組表達載體是指:重組表達質粒pET-41a-Bm_Nas E。
[0017]所述的轉基因重組菌是指:含有重組表達質粒pET-4Ia-Bm-Nas E的大腸桿菌BL21(DE3)。
[0018]本發明涉及上述亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列的應用，將其用於表達目的蛋白產物。
技術效果
[0019]本發明與現有技術相比，具有以下優勢:
[0020]1、本發明提出一種全新的亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列；
[0021]2、本發明通過構建重組表達菌株，實現了目的蛋白的外源表達，可以顯著提高表
達量;
[0022]3、本發明採 用Western Blot技術，可以對表達蛋白進行靈敏檢測，可檢測低至l-5ng(最低可至IO-1OOpg)的蛋白。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1PCR擴增電泳圖。
[0024]圖2重組表達質粒酶切電泳圖。
[0025]圖3含有重組質粒pET-4Ia-Bm-Nas E的BL21 (DE3)平板圖。
[0026]圖4重組菌誘導表達目的蛋白的SDS-PAGE圖。
[0027]圖5重組菌誘導表達目的蛋白的Western Blot-His.Tag圖。
【具體實施方式】
[0028]下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
實施例1
[0029]巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)NCT-2 的培養
[0030]巨大芽孢桿菌NCT-2分離自上海市崇明島設施栽培12-15年的大棚，保藏編號為CGMCC N0.4698。將該菌接種於LB液體培養基中，32°C培養OD6tltl至1.5左右，離心收集菌體用於提取細菌的基因組DNA。
[0031]所述的LB液體培養基組分為:蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，去離子水1L，pH6.8-7.2。LB固體培養基即為在LB液體培養基的基礎上添加15_20g的瓊脂。
實施例2
[0032]亞硝酸鹽還原酶大亞基的基因序列(Bm-Nas E)序列驗證
[0033]根據全基因組測序結果，設計PCR引物:
[0034]正向引物Nas E-F: 5; -ATGGTGAATAAAAACATTACAAAAG-3'
[0035]反向引物Nas E-R: 5; -TTATTCCTCAATTAAAAGATACAGCA-3'[0036]以巨大芽孢桿菌NCT-2的基因組DNA為模板，用上述兩對引物進行擴增。PCR條件為:95°C預變性3min ;94°C變性45s，53°C退火30s，72°C延伸45s ；30個循環後72°C終延伸IOmin0
[0037]將PCR擴增產物進行電泳檢測，結果表明獲得片段約為300bp，結果如圖1所示；然後將PCR產物切膠回收後連接到pMD19-T (Simple)載體上送公司測序。經測序後得到的核昔酸序列與基因組測序結果相吻合，即為本發明序列表中SEQ ID N0.1。
實施例3
[0038]重組表達載體的構建
[0039]根據測序得到的亞硝酸鹽還原酶大亞基的基因序列(Bm-Nas E)，涉及相應引物擴增該基因並連接到pET-41a表達載體上，然後倒入大腸桿菌BL21 (DE3)進行誘導表達。
[0040]設計引物如下:
[0041]正向引物Nas E-Eco R 1-F:
[0042]5' -CGGAATTCATGGTGAATAAAAACATTACAAAAG-3'
[0043]反向引物Nas E-Stu 1-R:
[0044]5' -AAGGCCTTTATTCCTCAATTAAAAGATACAGCA-3'
[0045]上下遊引物的5'端分別設計了 EcoR I和Stu I酶切位點用於連接到表達載體
[0046]pET_41a，用含有酶切位點的引物擴增亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列，回收PCR產物Bm-Nas Ei並連接T載。將連接產物轉入DH5 α大腸桿菌感受態細胞內，挑取陽性克隆搖菌並回收其質粒，然後用EcoR I和Stu I雙酶切，回收含有亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列的基因片段Bm-Nas Ei。用相同內切酶酶切表達載體pET_41a後與Bm-Nas Ei片段混合，用T4 DNA Ligase進行過夜連接，連接產物轉化到DH5a大腸桿菌感受態細胞，通過菌落PCR篩選含有重組表達質粒pET-4Ia-Bm-Nas E的陽性克隆。
實施例4
[0047]重組菌的構建及目的蛋白的表達
[0048]將含有重組表達質粒pET-41a-Bm_Nas E的DH5 α大腸桿菌接入到卡那黴素濃度為50 μ g/mL的LB液體培養基中，過夜培養並提取其質粒。用Eco R I和Stu I酶對提取質粒37°C酶切30min，對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證(見圖2)。
[0049]將提取的重組表達質粒pET-41a-Bm_Nas E轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)菌株的感受態細胞中，挑取陽性克隆(見圖3)於卡那黴素濃度為50μ g/mL的LB液體培養基中，在37°C震蕩培養，當OD6tltl達到0.6-0.8時，加入IPTG使其終濃度達到0.5mM,繼續培養6小時進行誘導表達。誘導表達培養好的發酵液離心收集菌體，利用破胞緩衝液洗滌菌體一次，再利用1/10發酵液體積的磷酸鹽緩衝液重懸菌體後在冰浴條件下利用超聲波破胞至菌液澄清，12000rpm/min離心15min收集上清,上清液即含有目的蛋白。
實施例5
[0050]重組菌誘導表達目的蛋白的SDS-PAGE
[0051]製備12%SDS-PAGE膠，將細胞破碎液與5XSDS-PAGE Loading Buffer比例混合，與沸水浴5min,每個點樣孔上樣20 μ L,在160V電壓下電泳60_70min,直至溴酹藍指示條帶完全跑出膠。停止電泳，用考馬斯亮藍R-250溶液染色20min，然後用脫色液進行洗滌，直至背景色完全脫去，條帶清晰可見(如圖4)。[0052]所述的12%SDS_PAGE是由濃縮膠與分離膠構成的，其組分分別為:
[0053]分離膠:蒸餾水1.6mL, 30% 丙烯醯胺溶液 2.0mL, 1.5M Tris-HCl (pH8.8) 1.3mL，10% 過硫酸銨(APS) 0.05mL, 10%SDS 溶液 0.05mL, TEMED 0.002mL ；
[0054]濃縮膠:蒸餾水0.68mL，30%丙烯醯胺溶液0.17mL，1.0MTris-HCl (pH6.8)0.13mL, 10% 過硫酸銨(APS)0.01mL, 10%SDS 溶液 0.01mL,TEMED 0.0OlmL。
[0055]所述的5 X SDS-PAGE Loading Buffer 組分為:IM Tris-HCl (pH6.8) 1.25mL, SDS
0.5g，溴酚藍25mg，甘油2.5mL,去離子水定容至5mL。小份分裝(500 μ L)後與室溫保存，使用前每小份加入β -巰基乙醇25 μ L0
[0056]所述的考馬斯亮藍R-250溶液組分為:考馬斯亮藍R-250 Ig,異丙醇250mL，冰醋酸IOOmL,去離子水650mL。
[0057]所述的脫色液組分為:冰醋酸IOOmL,無水乙醇50mL，去離子水850mL。
實施例6
[0058]重組菌誘導表達目的蛋白的His.Tag-Western Blot
[0059]Western B lot詳細步驟如下:
[0060]按順序組裝轉膜裝置:正電極、海綿、三張濾紙、PVDF膜、SDS-PAGE膠、三張濾紙、海綿和負電極。其中PVDF膜使用前先用甲醇泡lOmin，濾紙用電轉液浸泡。將裝好的轉膜裝置放入電轉槽，4°C 100V轉60-70min。
[0061]所述的SDS-PAGE膠是指:實施例5中已完成電泳、未染色的膠塊；所述電轉液的組分為:甘氨酸2.9g/L，Tris5.8g/L，SDS 0.37g，甲醇200mL，去離子水800mL，配好之後4°C預冷。
[0062]封閉:將轉好的PVDF膜置於封閉液中，並置於水平振蕩器上室溫封閉lh。
[0063]所述封閉液組分為:5.0g脫脂奶粉溶解於IOOmL TBST緩衝液；所述的TBST緩衝液組分為:NaCl 8.8g, IM Tris-HCl (ρΗ8.0) 20mL,吐溫-200.5mL,去離子水 980mL。
[0064]一抗雜交:將封閉完的PVDF膜轉入一抗溶液中，置於滾動搖床37°C、150rpm孵育Ih0
[0065]所述的一抗溶液組分為:將抗His-兔多克隆抗體以1:5000溶在封閉液中。
[0066]洗膜:將一抗孵育完的PVDF膜轉入TBST緩衝液中，在搖床上震蕩清洗3次，每次IOmin ;之後再在TBS緩衝液中清洗I次，IOmin0
[0067]所述TBS緩衝液是指不含吐溫-20組分的TBST緩衝液。
[0068]二抗雜交:將衝洗乾淨的PVDF膜放入二抗溶液中，置於滾動搖床37°C、150rpm孵育Iho
[0069]所述的二抗溶液組分為:將羊抗兔IgG-HRP以1:5000溶在封閉液中。
[0070]洗膜:同前。
[0071]染色:將染色液均勻塗抹於PVDF膜上，靜置lmin。通保鮮膜包好PVDF膜，置於X-光片盒中，並用透明膠帶固定。
[0072]所述的染色液組分是將EasySee Western Blot Kit (北京全式金，DW101)中500 μ L溶液Α、500 μ L溶液B與I μ L溶液C混合。
[0073]顯影:於暗室中壓片洗膜顯影，結果如圖5。
【權利要求】
1.一種亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所 示。
2.一種基於巨大芽孢桿菌的亞硝酸鹽還原酶小亞基外源表達方法，其特徵在於，將測序得到的亞硝酸鹽還原酶大亞基的基因序列通過引物序列擴增並連接到大腸桿菌表達載體中，從而獲得重組表達載體，並進一步將重組表達載體導入大腸桿菌中，篩選到含有目的基因的轉基因重組菌。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵是，所述的測序是指:以巨大芽孢桿菌NCT-2的基因組DNA為模板，用上述兩對引物進行PCR擴增，然後將擴增產物進行電泳檢測；並將擴增產物切膠回收後連接到pMD19-T (Simple)載體上進行測序。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵是，所述的引物序列擴增採用的引物為PCR擴增採用的引物的5'端分別設計了 EcoR I和Stu I酶切位點用於連接到表達載體，即: 正向引物 Nas E-Eco R 1-F: 5' -CGGAATTCATGGTGAATAAAAACATTACAAAAG-3,以及 反向引物Nas E-Stu 1-R: 5' -AAGGCCTTTATTCCTCAATTAAAAGATACAGCA-3'組成。
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵是，所述的大腸桿菌表達載體為pET-41a載體；所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3);所述的巨大芽孢桿菌NCT-2(Bacillusmegaterium)保藏編號為 CGMCC N0.4698。
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵是，所述的重組表達載體是指:重組表達質粒pET-4Ia-Bm-Nas E0
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵是，所述的轉基因重組菌是指:含有重組表達質粒 pET-4Ia-Bm-Nas E 的大腸桿菌 BL21 (DE3)。
8.一種根據上述任一權利要求所述的亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列的應用，其特徵在於，將其用於表達目的蛋白產物。
【文檔編號】C12N15/53GK103602690SQ201310565484
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月13日 優先權日:2013年11月13日
【發明者】周培, 馮海瑋, 支月娥, 劉群錄, 陸偉, 時唯偉, 孫玉靜, 衛星, 初少華 申請人:上海交通大學