轉人溶菌酶基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法

2023-04-30 11:18:56 2

專利名稱：轉人溶菌酶基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，特別是涉及轉基因-克隆技術領域。
背景技術：
轉基因動物研究是人類按著自己的意願有目的、有計劃、有根據、有預見地改變動物的遺傳組成，而改變其遺傳組成的目的是多種多樣的。比如遺傳學家希望通過改變動物的遺傳組成來觀察其表型變化，生理學家希望通過特定基因的表達來研究該基因對機體生理狀況的影響。與動物生產有關的轉基因研究則希望通過轉基因技術來賦予動物新的表型性狀。該項研究在實驗技術上依賴分子生物學、動物胚胎和配子操作技術。
轉基因動物的製作方法目前主要有原核期胚胎的顯微注射，逆轉錄病毒感染髮育早期的動物胚胎，精子載體法，ES細胞技術，PGCs技術，體細胞核移植技術，逆轉錄病毒載體感染MII期的卵母細胞，精子頭與DNA合併注射卵母細胞法。這些方法上的改進與提高大大地促進了轉基因動物研究由實驗室向生產實踐轉化的進程。
其中最傳統和最常用的方法是原核期胚胎的顯微注射，該方法由美國人Gordon發明，是目前應用比較廣泛、效果比較穩定的製作轉基因動物的方法之一。即在顯微操作儀下通過一毛細玻璃管將外源DNA注射進動物受精卵細胞的原核內，再將該受精卵細胞移植進受體細胞子宮內，在受精卵分裂時，外源DNA可能整合入宿主染色體組，待該受精卵發育成熟即可獲得轉基因動物。但是顯微注射法獲得的轉基因家畜的效率極低，特別是牛，羊和豬等，往往低於1％，這將大大增加製作轉基因家畜的成本。
隨著體細胞克隆技術的發展，基因操作技術與克隆技術相結合是將成為轉基因動物，特別是大家畜生產的主要方式。目前，取得的主要進展是轉基因技術和靶位操作技術在克隆動物上的應用。首先，利用克隆進行轉基因是指在核移植前，先把目的基因和標記基因的融合基因導入培養的體細胞，再通過標記基因的表現來篩選轉基因的陽性細胞及其克隆，然後再移植。1997年，英國PPL公司的科學家Schnieke與羅斯林研究所的Wilmut等聯手通過體細胞核移植技術率先在世界上製作了轉基因綿羊。利用胎兒成纖維細胞系，經過轉染之後，再克隆。利用克隆進行轉基因，一旦核移植成功，從理論上講，轉基因成功率為100％。原核注射的方法會使大量的非轉基因胚胎被懷孕，這是一種資源浪費，而利用克隆進行轉基因技術不會造成代理母親去懷孕非轉基因動物。此外，利用克隆進行轉基因時，轉基因動物的性別會被提前決定。這樣的話，如果想得到能在乳腺中表達蛋白質，就可以使克隆的轉基因動物全是雌性動物。
由於動物轉基因技術能按照人們的意願改變動物的生產性狀，得到人們所需要的產品，特別是一些蛋白藥品及保健品，科學家們已經開始將動物轉基因技術應用到實踐當中，目前動物轉基因技術主要有以下一些應用(1)、促進動物生長、提高畜產品產量、改善產品品質，(2)、動物抗病育種，(3)建立診斷和治療人類疾病的動物模型，(4)生產藥用蛋白。
動物乳腺生物反應器是一種利用動物轉基因技術在乳腺細胞中表達多肽藥物、工業酶、疫苗和抗體等蛋白的技術。通過基因工程的方法改造乳腺的功能有利於我們進一步研究乳腺癌的機制，提高乳汁的營養成分，甚至可以合成藥物。該技術具有低投入高產出的特點，其效率是利用以大腸桿菌和動物細胞培養技術的一百倍，是一種非常有潛力的高新技術。1987年，Simons等人在轉基因小鼠乳腺中首次成功地表達羊乳球蛋白基因，並且小鼠奶樣中的蛋白含量高達23克/升，大約是動物細胞表達蛋白的400倍以上。該技術一經出現就得到迅猛的發展。目前，牛乳白蛋白基因人組織血纖維蛋白溶酶原因子，人生長激素基因，人體抗胰蛋白酶基因，人尿激酶基因和人幹擾素基因等基因都在小鼠的乳腺中得到表達。許許多多的著名科學家都認為這將是畜牧業前所未有的革命，可能會給社會帶來巨大的經濟效益。
溶菌酶(lysozyme)又稱胞壁質酶(muramidase)，是天然非特異性免疫物質，具有強力殺菌作用。人溶菌酶(hLY)屬於c型溶菌酶(Isabelle，1990)，具有抗菌、免疫調節及一定的抗腫瘤作用，有潛在的臨床應用價值。人溶菌酶是一種由18種130個胺基酸組成的鹼性多肽，分子量為14.7KD，等電點為pH11。
溶菌酶以溶解革蘭氏陽性細菌的細胞壁而具有溶菌作用。原因在於它能水解細菌細胞壁粘多糖(polypeptidoglycan)N-乙醯葡萄糖胺(NAG)與N-乙醯氨基葡萄糖乳酸(NAM)之間(NAM4-O-NAG5 glycosidic bond)的β-1.4糖苷鍵。隨著細胞壁的弱化，細菌會因為內部壓力的作用崩裂而死。Pellegrini等人的結果顯示溶菌酶抑菌作用不僅僅與它的胞壁質酶有關，而且還與其陽離子和疏水的特性有關。實驗證明，最適小分子底物與酶結合時，正好與酶分子中的長形凹穴嵌合，酶活性中心由三級結構相距較近的Asp53和Glu35胺基酸殘基組成。
溶菌酶的作用1)抗菌消炎，溶菌酶是能水解粘多糖的鹼性水解酶，而粘多糖是細菌細胞壁的主要成分之一，其能直接水解革蘭陽性菌，在免疫蛋白A、補體的參與下，還能水解革蘭陰性菌。此外，它還會與各種誘發炎症的酸性物質結合，使其失活，並能夠增強抗生素和其它藥物的療效，改善組織基質的粘多糖代謝，從而達到消炎、修復組織的目的。2)抗病毒作用，溶菌酶能與帶負電荷的病毒蛋白作用，與DNA，RNA，脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活。近來，一些結果顯示來源雞蛋清，人乳核和人中性粒細胞的溶菌酶具有抑制HIV-1生長的活性。3)增強免疫力，溶菌酶作為機體非特異免疫因子之一，參與機體多種免疫反應，在機體正常防禦功能和非特異免疫中，具有保持生理平衡的重要作用，可以改善和增強巨噬細胞的吞噬和消化能力，激活白細胞的的吞噬功能，並能改善細胞抑制劑所導致的白細胞減少，受到病原微生物的侵害時，其發揮抗感染作用，是一種非常重要的非特性免疫物質。4)其還具有激活血小板的功能可以改善組織的局部血液循環障礙，分解膿液、增強局部防衛功能，從而體現止血、消腫等作用。還可以作為一種抵抗因子，對組織局部起保護作用。
溶菌酶的應用1)溶菌酶作為防腐劑。它本身是一種天然蛋白質，無毒性，是一種安全性高的食品添加劑。同時溶菌酶僅能作用於目的微生物的細胞壁，而不能作用於其它物質。2)溶菌酶在醫學上和應用。A.五官科的應用溶菌酶適用於五官科各種炎症。研究表明它對眼、耳、鼻、喉和口腔等的急、慢性炎症均有一定療效，特別對急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明顯。若在牙膏、漱口水、口潔劑、口香糖中設法添加一定量的溶菌酶，則可以殺死這些病菌，達到防止蟲牙的目的。同樣，可用溶菌酶來制眼藥水、潤喉液。B.皮膚科的應用溶菌酶可以用於治療扁平疣、傳染性軟疣、尋常性疣、尖銳溼疣、帶狀皰疹等多種皮膚病。對於帶狀皰疹，內服溶菌酶即可。而對於扁平疣和傳染性軟疣等的治療，最好採取內服溶菌酶和5-氟脲嘧啶人溶液外塗，療效明顯提高。C.其他方面的應用溶菌酶可用於小兒和乳兒哮喘性支氣管炎、呼吸道內膜腫脹等，它可使黏膜腫脹很快消除，使痰液變稀，呼吸道通暢。溶菌酶可以預防和治療病毒性肝炎，尤其對輸血後肝炎及急性肝炎的效果較為顯著。在機體內，它還有抗流感病毒和腺病毒的生長，並能防止皰疹病毒感染。此外，對肉瘤引起的疼痛、久治不愈的小兒腹瀉及Sjogren’s病，均有一定療效。D.人體溶菌酶的濃度還可以作為多種疾病診斷指標。3)食品、飲料中的應用。溶菌酶集藥理、保健和防腐三個功能於一體。做為一種天然蛋白質無任何副作用。溶菌酶的加入，補充了人體內的非特異性免疫因子，殺死腸道內的腐敗球菌，維持腸道內菌群正常化，促進雙歧桿菌增殖，加強白清滅菌蛋白，Y-球蛋的防禦因子，增強抗感染力。加入飲料中，如鈣奶、乳酸飲料中，也可起到防蛀牙、爽口的作用。特別是母乳化奶粉，對嬰幼兒的成長十分重要。牛奶中的溶菌酶含量極少，而母乳中的溶菌酶含量十分豐富。為彌補奶粉的不足，可以向其中添加適量溶菌酶，製成母乳化能奶粉。溶菌酶的加入，可以加強嬰幼兒的抗感染能力。4)製備細胞浸提物。酵母膏藥發酵工業中用量最多的一類培養基成分。它的製備目前大多是採用酵母自溶法或酵解、酵母的辦法製成的。如果改用溶菌酶製備酵母膏，則不僅可以提高浸膏量的收率，還可以大大縮短酵母膏的製備時間。也可以用溶菌酶從酵母細胞中製備呈味物質，如有些溶菌酶中除了含有溶菌酶活性外，還含有能分解酵母細胞中的核酸為肌苷酸和鳥苷酸的單核酸類的呈味物質。5)科學研究中的應用。由於溶菌酶具有能夠專一性地分解細胞壁的能力，除了在實際生產中的應用外，溶菌酶更廣泛的應用於科學研究中。如用溶菌酶專一性地水解細胞壁的特點，了解微生物細胞壁的構造；分解細胞壁後製備原生質體，而用於微生物育種以及微生物分類等學術研究和專用試劑學。
不同來源的溶菌酶，其溶菌譜各不相同。雞蛋清溶菌酶只對革蘭氏陽性菌有溶菌作用。在這些溶菌酶中，人體中的溶菌酶活性最高，其次是雞蛋白中的溶菌酶，最低的是牛乳中的溶菌酶。人溶菌酶具有生物相容性好，對組織無刺激、無毒性的優點。商業化的人溶菌酶可以從乳汁、中性粒細胞和尿液中提取，然而這種資源畢竟非常有限，所以人們開始研究利用重組技術來生產人溶菌酶。這個過程主要經歷了三個階段。第一個階段，最初，利用酵母和米麴黴實驗來表達溶菌酶。1986年，Jigmi等人利用酵母進行人溶菌酶表達，但這種重組蛋白不具有抑菌活性。接下來，Castanon和Yoshimura也作了相似的工作，也沒有取得重要突破。1990年，Archer等人用米麴黴表達雞蛋清溶菌酶，表達量為12mg/l。Tsuchiya等人在米麴黴裡表達人溶菌酶，表達量為1.2mg/l，遺憾的是同樣沒有生物學活性。由此可見，在酵母和米麴黴裡表達的溶菌酶不具有生物活性。第二個階段，利用轉基因小鼠表達人溶菌酶。Maga在這方面作了大量工作，1994年Maga等人進行了轉基因小鼠乳腺表達人溶菌酶的研究，他們利用alpha sl-casein啟動子來誘導溶菌酶的表達。在轉基因小鼠乳腺組織檢測人溶菌酶mRNA的存在。溶菌酶的表達量估計為0.2g/L到0.7g/L，由於溶菌酶的表達，乳汁的物理和功能特性也發生了改變。1998年，Maga等人的研究結果進一步表明轉基因小鼠表達人溶菌酶的奶樣具有同標準溶菌酶相同的活性。這些結果暗示著溶菌酶的轉基因研究在乳品加工業有著巨大的應用前景。2000年，Akinbi等人為了在體內檢測溶菌酶在呼吸系統的作用，他們製備了在呼吸道上皮細胞表達大鼠溶菌酶的轉基因小鼠。這種轉基因小鼠能提高在肺部對細菌的殺傷能力5-30倍。由此可見，利用轉基因小鼠表達具有生物活性的溶菌酶的方法是可行的，並且有著巨大的潛在應用前景。第三個階段，近年來，人們開始利用植物實驗體系表達溶菌酶，在這方面已取得了很大進展。1997年，Nakajima等人的研究結果表明低水平的溶菌酶也可以在菸草葉表達，並且可以提高植物抗真菌和細菌的活性。2000年，Takaichi和Oeda利用轉基因技術也成功地在胡蘿蔔根中表達了人溶菌酶。Ahreholta等人將T4溶菌酶基因轉移到馬鈴薯裡。發現馬鈴薯的根部上皮細胞可以表達T4溶菌酶並釋放根表面的薄膜層。T4溶菌酶具有活性，可以殺死細菌。而且，這種殺菌能力不依賴於植物的年齡和生長環境。2002年，一個密碼子優化的人工合成的溶菌酶基因通過基因槍轉到水稻愈傷組織，重組的溶菌酶可以在水稻懸浮細胞裡表達，表達量達到大約可溶性蛋白的4％。實驗結果表明Ramy3D信號肽可以被正常剪切，並且具有和人溶菌酶同樣的生物活性。以上研究結果顯示利用植物表達具有生物活性的溶菌酶是可行的。可以想像，含有人溶菌酶的水果和食物一定會人們的生活帶來福音。
從上述對人溶菌酶轉基因的研究表明，還沒有見到人溶菌酶在大型牲畜方面的轉基因克隆報導。

發明內容
針對上述技術領域的空白，將轉基因、細胞轉染和克隆技術相結合，提供一種轉人溶菌酶基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法，以實現「牛奶人乳化」。
本發明提供一種轉人溶菌酶基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法，其操作步驟如下(1)構建含有人溶菌酶基因的乳腺特異表達載體，(2)構建人溶菌酶乳腺特異表達載體與雙標記選擇載體和單標記選擇載體的串聯結構，將串聯結構DNA導入家畜體細胞核內，獲得轉基因細胞，(3)轉基因細胞作為核供體進行體細胞克隆，獲得轉有人溶菌酶基因的轉基因克隆動物。
所述的一種轉人溶菌酶基因的轉基因克隆大型家畜生產方法，所述乳腺特異表達載體為pBC2-sigHLY，所述的pBC2為在pBC1的6407-6438bp處缺失31bp所構建的骨架載體。
所述的sigHLY由牛beta-casein信號肽序列，人溶菌酶的1-4外顯子和1-3內含子組成。
所述的導入方法為電穿孔轉染法。
所述的雙標記選擇載體以增強型綠色螢光蛋白基因和新黴素抗性基因為標記選擇基因。
所述串聯結構DNA為pBC2-sigHLY-EGFP-NEO。
所述的單標記選擇載體以新黴素抗性基因為標記選擇基因。
所述串聯結構DNA為pBC2-sigHLY-NEO。
所述大型家畜為牛、山羊、綿羊、豬或兔。
所述大型家畜為牛。
為了製備高效表達人溶菌酶的奶牛乳腺生物反應器以生產重組人溶菌酶，本實驗室首先建立了乳腺高效表達人溶菌酶的小鼠模型，構建了pBC1-HLY和pBC2-sigHLY四種不同的溶菌酶基因表達載體。利用顯微注射方法注射原核期小鼠胚胎製備轉基因小鼠。
pBC1-HLY溶菌酶表達載體包含溶菌酶基因的編碼序列(含溶菌酶信號肽)、山羊beta-casein啟動子、終止子及其部分不編碼的外顯子和內含子。經顯微注射共獲得6隻為轉基因陽性小鼠，經Western Blotting檢測，在3隻存活轉基因陽性母鼠的乳汁中，可以檢測到重組人溶菌酶的表達。其中6號轉基因小鼠的溶菌酶表達量達到0.2mg/ml，34號的表達量為0.12mg/ml，41號沒有檢測到重組溶菌酶的表達。經溶菌實驗檢測及對重組溶菌酶比活力的計算，重組溶菌酶具有同人溶菌酶相似的比活力。
pBC2-sigHLY溶菌酶表達載體包含溶菌酶基因的編碼序列(含牛beta-casein信號肽)，而pBC2是在pBC1的6407-6438bp處缺失31bp(GAATTCATTTCCTAATCATGCAGATTTCTAG)所構建的載體。將pBC2-sigHLY載體進行小鼠原核胚的顯微注射獲得轉人溶菌酶基因的轉基因小鼠，三隻陽性小鼠乳汁中有兩隻能檢測到重組人溶菌酶的高效表達，分別為2mg/ml和0.5mg/ml；經溶菌實驗檢測，表明重組人溶菌酶具有溶菌活性，其中61號小鼠的酶活性為2160U/ml、63號948U/ml，陰性小鼠的酶濃度為25.98U/ml，人的為1224U/ml。與陰性小鼠相比，61號轉基因小鼠乳清的溶菌酶活性提高了83倍，63號提高了36倍。與人奶相比，61號小鼠奶的酶活性提高了近一倍，而63號也比較接近人奶的溶菌酶活性。表明我們構建的pBC2-sigHLY表達載體能在動物乳腺中高效表達有溶菌活性的重組人溶菌酶。而且pBC2-sigHLY表達載體在轉基因小鼠奶中人溶菌酶的表達量及活性明顯高於我們構建的含自身信號肽序列的人溶菌酶表達載體pBC1-HLY(＜0.2mg/ml和480U/ml)。
本發明探索和完善了轉基因技術、細胞轉染技術和體細胞克隆技術相結合生產攜帶外源功能基因(包括山羊beta-酪蛋白5』和3』調控元件，目的基因的編碼區)的轉基因動物的途徑，並極大提高了轉基因動物，特別是轉基因大家畜的製作效率，本發明所使用的技術路線適用於轉基因牛、山羊、綿羊、豬和兔的基礎群生產和擴繁。
溶菌酶集藥理、保健和防腐三個功能於一體，做為一種天然蛋白質無任何副作用。而人乳中溶菌酶破壞和溶解細菌的比活力約為牛乳的300倍，是人乳中的重要抗菌因子，因此人溶菌酶被認為是一種具有極高開發價值的保健蛋白和藥用蛋白。目前商業化的人溶菌酶主要從人乳汁、中性粒細胞和尿液等中提取，然而這種資源畢竟非常有限，所以我們利用體細胞克隆技術生產轉人溶菌酶基因的轉基因牛，從而通過高產奶牛的乳腺大量生產具有活性的人溶菌酶，既可開發出具有高附加值的保健牛奶，也可純化出人溶菌酶並開發成藥品和保健品。本發明所研究的重組人溶菌酶，具有與天然人溶菌酶相同的生物活性；含有重組人溶菌酶的牛奶可以開發成保健牛奶及奶製品；純化的重組人溶菌酶可以開發成防腐劑、食品添加劑、保健品和藥品。


圖1溶菌酶基因表達載體pBC1-HLY的物理圖譜其中Pcasein為pBC1上的山羊beta-casein啟動子，Casein E1-E2為山羊beta-casein非編碼的第1，2外顯子，Casein E7-E8-E9為山羊beta-casein非編碼的第7，8及9外顯子，Casein3`genome DNA為山羊beta-casein 3』端調控序列。
圖2pBC1-HLY轉基因陽性小鼠的PCR檢測0非轉基因小鼠基因組，+人的基因組；6、30、34、41、48、50分別為PCR檢測的陽性轉基因小鼠圖3pBC1-HLY轉基因陽性小鼠的Southern blot檢測0非轉基因小鼠基因組，6、30、34、41、48、50分別為PCR檢測的陽性轉基因小鼠，陽性對照包括3條帶(10、5、1)，分別相當於基因組的10、5、1拷貝。
圖4pBC1-HLY轉基因母鼠乳汁的Western Blot檢測41，34，6為轉基因母鼠奶樣，human為人奶對照，CK為陽性對照。
圖5人溶菌酶基因編碼區的PCR擴增.
M為1kb DNA marker，1為hly的PCR產物圖6利用XhoI和KpnI對p7zf-sigHLY11進行酶切鑑定M為1kb DNA marker，11為p7zf-sigHLY11質粒DNA，KpnI為p7zf-sigHLY11被KpnI酶切結果，XhoI為p7zf-sigHLY11被KpnI酶切結果。
圖7利用XhoI酶切對pBC2-sigHLY13進行鑑定M為1kb DNA marker，13為pBC-sigHLY13質粒DNA，BC1為pBC1質粒DNA，XhoI為XhoI酶切pBC-sigHLY13結果。
圖8pBC2-sighLY13方向鑑定M為1kb DNA marker，13為pBC-sigHLY13質粒DNA，CalI為CalI酶切pBC2-sigHLY13結果，KpnI為KpnI酶切pBC2-sigHLY13結果。
圖9溶菌酶表達載體pBC2-sigHLY的物理圖譜其中Pcasein為pBC2上的山羊beta-casein啟動子，Casein E1-E2為山羊beta-casein非編碼的第1，2外顯子，Casein E7-E8-E9為山羊beta-casein非編碼的第7，8及9外顯子，Casein3`genome DNA為山羊beta-casein 3』端調控序列。
圖10pBC2-sigHLY轉基因陽性小鼠的PCR檢測M為1kb DNA marker，0為陰性對照，h為陽性對照，6，12，43，61和63為陽性轉基因小鼠。
圖11pBC2-sigHLY轉基因陽性小鼠的Southern blot檢測M為1kb DNA marker，0為陰性對照，h為陽性對照，6，12，43，61和63為陽性轉基因小鼠，1，3，5分別為陽性對照的1，3和5個拷貝。
圖12pBC2-sigHLY轉基因陽性母鼠乳汁的Western Blot檢測CK為陰性小鼠奶樣，12，61和63為轉基因小鼠奶樣，human為人乳對照。
圖13雙標記選擇載體pEGFP-NEO的結構圖EGFP為增強綠色螢光蛋白基因，NEO為新黴素抗性基因，IRES為核糖體結合位點，SalI，NotI，AscI和BamHI為酶切位點，CMV-IE Enhancer為CMV-IE增強子，pEF321為EF321啟動子圖14單標記選擇載體pNEO的結構圖NEO為新黴素抗性基因，SalI，NotI，AscI和BamHI為酶切位點，pPGK為PGK啟動子，Amp為氨苄抗性基因圖15pBC2-sigHLY-EGFP-NEO酶切後的線性圖譜b-casein promoter為pBC1上的山羊beta-casein啟動子，human lysozyme gene為人溶菌酶基因(含牛b-casein序列)，GFP為增強綠色螢光蛋白基因，Neomycin為新黴素抗性基因圖16pBC2-sigHLY-NEO酶切後的線性圖譜b-casein promoter為pBC2上的山羊beta-casein啟動子，human lysozyme gene為人溶菌酶基因(含牛b-casein序列)，GFP為增強綠色螢光蛋白基因，Neomycin為新黴素抗性基因圖17HLY引物的擴增結果.
M1kb ladder；1盼娃；2金娃；3陽性對照；4陰性對照；5blank圖18hLY引物的擴增結果.
M1kb ladder；1329號牛；20365號牛；3為020613，4陽性對照；5陰性對照；6blank圖19NEO引物的擴增結果.
M1kb ladder；1盼娃；2金娃；3陽性對照；4陰性對照；5blank圖20NEO引物的擴增結果M1kb ladder；1陰性對照；2329號牛；30365號牛；4為020613，5陽性對照圖21EGFP引物的擴增結果.
M1kb ladder；1329號牛；20365號牛；3為020613，4陽性對照；5陰性對照；6blank圖22pBC2引物擴增結果
泳道1，4為普通克隆牛基因組DNA，泳道2，3分別為轉pBC2-sigHLY基因克隆牛基因組DNA，泳道5為pBC2-sigHLY-NEO(在pBC上有缺失)質粒DNA，泳道6為pBC2-sigHLY轉基因小鼠DNA，泳道7為完整pBC1，泳道8為非克隆牛DNA，泳道9為空白對照。
圖23HLY轉基因克隆牛的Southern結果泳道1為盼娃，泳道2為金娃，泳道3-5為陰性對照，泳道6-8分別為1，2和5個拷貝的陽性對照.
圖24hLY轉基因克隆牛乳樣PAGE結果，泳道1蛋白標準，泳道2為人溶菌酶標準品，泳道3為人乳，泳道4-7分別為金娃、盼娃、329及0365。
圖25HLY轉基因克隆牛乳樣Southern雜交結果，泳道1為人溶菌酶標準品，泳道2為人乳，泳道3-6分別為金娃、盼娃、329及0365。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進步的詳細說明。
實施例1實驗材料1.1質粒及菌株宿主菌大腸桿菌DH5α和DH10B，pBC1 milk expression vector kit和PCR-XL-TOPO vector購自Invitrogen公司，pCMV-EGFP-IRES-NEO和pIRES-NEO購自Clontech公司，pGEM-7zf購自Promega公司，BAC RP11-1143G9購於美國基因公司1.2實驗動物Holstein奶牛約3月齡的胎兒取自屠宰場，黃牛卵巢來自北京周邊地區屠宰場。
1.3主要試劑DMEM/F12粉末、DMEM粉末培養基、臺盼藍(trypan blue)、TCM199粉末，穀氨醯胺和G418為Gibco公司產品；胎牛血清為Hyclone公司產品；dNTP以及PCR引物購於上海生物工程公司；Taq酶購於中國農業大學農業生物技術實驗室；內切酶SspI和BamHI為華美生物工程公司產品；IPTG、X-gal、氨苄青黴素(Amp)、卡那黴素(Kan)、匙孔血藍蛋白(KLH)均購自華美生物公司；飽和酚為鼎國生物工程公司產品；胰蛋白酶、青黴素鏈黴素、EDTA、Hepes、FSH，LH，17β-E2，EGF，透明質酸酶，HEPES，無脂肪酸BSA，細胞鬆弛素B，Hoechest33342，cycloheximide，A23187，6-DMAP，D-甘露醇，丙酮酸鈉，肝素鈉，礦物油和其它無機鹽均為Sigma公司產品。
1.4培養基的配製SOB培養基配置每升培養基，應在950ml去離子水加入蛋白腖20g酵母提取物5g NaCl0.5g.搖動容器室溶質完全溶解，然後加入250mmol/L KCl溶液10ml，用5mol/L NaOH調節到pH7.0。滅菌LB液體培養基蛋白腖10g，酵母粉5g，NaCL10g，溶於800ml水中，調節PH值至7.5，定容制1000ml，高壓滅菌。
LB固體培養基蛋白腖10g，酵母粉5g，NaCL10g，溶於800ml水中，加脂粉15g，調節pH值至7.5，定容至1000ml，高壓滅菌。
1.5試劑的配製DMEM培養液DMEM粉末13.4g，NaHCO33.7g，青黴素66mg，鏈黴素100mg，Mill-Q超純水定容到1升，PH 7.0-7.4，滲透壓為280-320mOsm/kg，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。使用時加10％的血清。
0.1％Trypsin/EDTA酶消化液Trypsin0.1g，KCl 0.04g，NaHCO3，NaCl 0.8g，EDTA 0.02g，用滅菌的Mill-Q超純水溶解，定容至100ml，用0.2μm濾膜過濾滅菌，-20℃保存。DPBS液DPBS粉末9.7g，Mill-Q超純水定容到1升，PH 7.0-7.2，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。
無鈣鎂PBS溶液KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO412H2O 2.88g，Mill-Q超純水定容到1升，PH 7.0-7.4，滲透壓為280-320mOsm/kg，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。Gimsa母液Gimsa粉末0.5g，加少量甘油將Gimsa粉末在研缽中充分研磨。再加入甘油至總量為22ml，56℃保溫2h，然後再加入33ml甲醇，保存在棕色試劑瓶中，備用。
細胞裂解液10mM Tris.Cl(PH 8.0)，0.1M EDTA(PH8.0)，0.5％SDS。
蛋白酶K貯存液蛋白酶K100mg，溶於5mL滅菌水中，分裝，-20度保存。
TBS液NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tris.Cl 3.0g，溶於1L重蒸水中，高壓滅菌。
G418貯液1g G418溶於1mL 1mol/mL HEPES溶液中(PH7.0-7.2)，加Mill-Q10mL，過濾滅菌，-20度保存。
兩倍電擊緩衝液(2×HeBS)280mM Nacl、10mM Kcl、1.5mM Na2HPO4、12mM Glucose、50mM Hepes，PH7.0-7.4，過濾滅菌，1mL分裝，-20度保存。
1Mol/L Tris.Cl(pH8.0)121.1gTris鹼溶於800ml水中，用HCl調PH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
0.5Mol/L EDTA(pH8.0)126.1g乙二胺四乙酸二鈉加入到800ml水中，用NaOH調PH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
RNase溶液將RNaseA溶於10mMol/L Tris.Cl(pH7.5)，5mMol/L NaCL中，配成10mg/ml的濃度，於100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存於-20℃。
TE緩衝液10mMol/L NaCL，10mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mMol/L EDTA(pH8.0)，高壓滅菌。5mol/L LiCl30.2g氯化鋰二水(LiCl.2H2O)完全溶於80ml水後，定容至100ml高壓滅菌。50×TAE242gTris鹼，57.1ml冰乙酸，100ml0.5Mol/L EDTA(pH8.0)，溶解後定容至1000ml。氨苄青黴素(Amp)貯存液將氨苄青黴素鈉溶於滅菌水後用0.22μm的濾器過濾除菌，配製成100mg/ml，保存於-20℃。
3mol/L NaAc(pH5.2)24.604g無水乙酸鈉溶於80ml水中，用冰乙酸調節pH值至5.2，定容至100ml，高壓滅菌。
1mol/L CaCl2在200ml水中溶解54gCaCl2·6H2O，過濾除菌，分裝成10ml每份，貯存於-20℃，製備感受態時取出一份稀釋至100ml，過濾除菌，預冷備用。
溴化乙錠貯存液在100ml水中加入1g溴化乙錠，溶解後於4℃棕色瓶內保存。
DNA提取抽提緩衝液50mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，100mMol/L EDTA(pH8.0)，100mMol/L NaCl，1％SDS。
2×Cracking buffer0.2N NaOH，0.5％SDS，20％蔗糖。
酚∶仿(1∶1)等體積苯酚、氯仿混合，保存於4℃棕色瓶中。
蛋白酶K溶液用水配成20mg/ml，-20℃保存。
TCM199培養液稱TCM199粉末9.9g，NaHCO32.2g，丙酮酸鈉0.1375g，EDTA 0.372g，用1L超純水定容，PH7.2-7.4，正壓過濾滅菌，4℃保存。培養用工作液中加入10％FCS。
操作液H199在含有25mM Hepes的TCM199中加入10％FCS。
衝卵液DPBS溶液中加入10％FCS。
透明質酸酶透明質酸酶0.2g，溶於10ml無鈣DPBS溶液中，過濾滅菌，-20℃貯存。
工作液用衝卵液稀釋10倍。
融合液0.3M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.05mM CaCl2，0.5mMHEPES，0.05％BSA，調PH至7.2-7.4，過濾滅菌。
成熟培養液M199培養液中加入10％FBS，10u/ml FSH，100U/ml LH，1ug/ml estradiol，100U/ml青黴素，100ug/ml鏈黴素。
CRlaa培養液

將上述成份加入90ml ddH2O中，待所有試劑徹底溶解後，加入0.055g Hemicalcium L-lactate(5mM)。調整pH為7.4，用ddH2O加到100ml，滲透壓為265-285mOsm之間。過濾滅菌。
1.6主要儀器設備1)CO2培養箱美國Forma Scientific Inc.
2)倒置顯微鏡和螢光顯微鏡日本Nikon公司3)培養皿、培養瓶、離心管和細胞凍存管Nunc公司4)電擊儀美國BTX公司(ECM 2001)5)電泳儀DYY-III2穩壓電泳儀，北京六一儀器廠
6)超淨工作檯北京淨化設備廠7)-80℃超低溫冰箱日本SANYO公司8)製冰機日本SANYO公司9)超純水儀美國MILLIPORE公司10)低溫離心機Eppendorf公司11)高速冷凍離心機BECKMAN公司12)凝膠成像系統ALPHAINNOTECH公司13)PHS-3C酸度計上海虹益儀器廠14)自動滅菌鍋日本SANYO公司15)測序儀ABI 377型DNA sequencer，美國PERKIN ELMER公司16)恆溫水浴儀美國LIFESCIENCE公司17)9700型PCR儀美國PERKIN ELMER公司18)ABI 377DNA測序儀美國PERKIN ELMER公司1.7分析工具軟體及網址同源性分析軟體DNAMANPCR引物設計軟體Oligo4.0DNA序列分析軟體ChromasDNA及蛋白序列資料庫NCBI/GenBank/Nucleotides，Protein2實驗方法2.1載體構建2.1.1pBC1-HLY表達載體構建及轉基因小鼠模型建立1)pBC1-HLY表達載體的構建策略首先利用長片段PCR的方法獲得溶菌酶基因的編碼區，將其克隆到PCR-XL-TOPOvector上，並進行酶切和測序驗證。然後再把它連接到乳腺特異表達載體pBC1上，經插入方向和測序鑑定，最後得到溶菌酶的表達載體。
2)人溶菌酶基因編碼區的PCR擴增溶菌酶基因全長6807bp，含有4個外顯子。mRNA(519-682，2246-2410，4349-4427，5281-6374)和CDS(601-682，2246-2410，4349-4427，5281-5347)，起始密碼子位於547位點，TATA box位於491-496位置。為了得到溶菌酶編碼區片段，我們以溶菌酶基因組DNA序列為模版設計引物進行DNA擴增。設計的引物為上遊5`CCC TCG AGA CTC TGACCT AGC AGT CAA C 3`，下遊5`CCG CTC GAG TCT GTT TCT ATC ATT TGG 3`，5`端分別含有XhoI酶切位點。擴增產物全長5652bp，包含溶菌酶基因信號肽部分的DNA片段。PCR條件94℃3min，94℃1min，60℃1min，68℃5min，68℃10min，4℃1h；30cycles.PCR擴增出1條約5.5kb的特異片段，於是我們把這個PCR產物回收回來，克隆到pPCR-XL-TOPO載體上。
3)人溶菌酶基因編碼區DNA片段的克隆為了對PCR產物進行測序和驗證，我們首先把它克隆到PCR-XL-TOPO vector上得到pTOPO-HLY重組載體。經過轉化後，進行培養，最後提取質粒。對獲得的陽性重組質粒進行酶切及測序鑑定。
4)pBC1-HLY expression vector的構建本發明採用pBC1作為構建乳腺表達載體的骨架載體，pBC1為Invotrogen公司的商業化乳腺表達載體，全長為21628bp，包含山羊beta-casein啟動子，外顯子1、2和7、8、9的非編碼區，beta-casein 3`中止子區和2拷貝的beta-globin隔離子，以及原核序列。其中在山羊beta-casein的外顯子2和7之間存在一個XhoI限制性內切酶位點，用於將外源基因的編碼區連接上去。
在構建溶菌酶基因表達載體時，我們首先分別對pBC1和pTOPO-HLY進行XhoI酶切與回收，再按110的比例混勻於16℃過夜連接，再進行電轉化。挑單克隆菌落進行搖菌提取質粒，篩選重組質粒pBC-HLY陽性克隆。
5)酶切鑑定及PCR檢測XhoI酶切pBC1-HLY陽性質粒，結果顯示可以切出一條5kb外源片段和21kb的pBC1的骨架片段，表明重組質粒的XhoI位點已連入5kb外源片段。
為進一步驗證，我們以溶菌酶基因序列為模板設計引物上遊5`TTA TAC ACA CGG CTTTAC 3`下遊5`CAG CAT CAG CGA TGT TAT CT 3`PCR條件94℃5min，94℃40sec，53℃40sec，72℃40sec，72℃7min，4℃1∞；30cycles。結果顯示以4號和12號質粒為模板可以擴增到與以含人溶菌酶基因BAC為模板大小相同的DNA片段，表明人溶菌酶基因編碼區已經連接到pBC1載體上6)方向鑑定由於上述連接屬於單酶切位點連接，所以必須進行插入片段的方向鑑定。我們選擇限制性內切酶Drd進行方向鑑定，有一個Drd位點位於溶菌酶基因5`端(538)，同時在pBC1上也存在相應酶切位點(2442、12109、12219、15035、17540、17953)。根據酶切產物的DNA片段大小，可以判斷外源片段的插入方向。
7)測序驗證為了保證該表達載體序列的正確性，我們又對pBC1-hLY陽性質粒的外顯子1-4的部分進行測序，結果表明在PCR過程中，沒有造成溶菌酶基因外顯子部分序列的突變，連入pBC1的是完好的人溶菌酶基因基因組DNA。
8)pBC1-HLY轉基因小鼠模型的建立及檢測(1)pBC1-HLY expression vector的NotI和SalI酶切片段的回收與檢測pBC1-HLY expression vector的物理圖譜如圖1所示，本實驗用NotI和SalI雙酶切，除去質粒的多餘部分，用Qigen試劑盒回收約26kb大小的片段，溶於轉基因專用TE，調整DNA濃度為2μg/ml。
(2)顯微注射共注射受精卵1200枚，移植受體鼠70隻，受孕鼠32隻，共生小鼠83隻(3)轉基因小鼠的PCR檢測取2-3周齡轉基因小鼠的尾巴組織樣，提取DNA。用前面已使用過的一對引物(上遊5`TTA TAC ACA CGG CTT TAC 3`下遊5`CAG CAT CAG CGA TGT TAT CT 3`)分別對小鼠DNA樣PCR擴增，以普通小鼠基因組作為陰性對照，以人基因組作為陽性對照，如圖2所示，結果發現共有6隻小鼠為轉基因陽性小鼠，分別為6、30、34、41、48和50號。小鼠擴增出的PCR產物與陽性對照一致，咱們這些小鼠為攜帶有pBC1-hLY的轉基因小鼠(4)轉基因小鼠的Southern blot檢測將PCR檢測為陽性的6隻小鼠尾巴組織樣DNA，取大約10μg用PstI內切酶消化，低壓慢速電泳，轉膜後，進行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標記的PCR產物。以pBC1-HLY質粒為陽性對照，以陰性小鼠基因組為陰性對照，雜交可得到5kb片段。結果如圖3所示，結果表明6、30、34、41、48和50號轉基因小鼠均為陽性小鼠，與PCR檢測結果一致，而陰性小鼠的基因組(0)沒有雜交信號。根據Southern雜交信號強度，估算轉基因小鼠的外源基因整合的拷貝數。6、48號，3拷貝；30號，1拷貝；34、41號，2拷貝；50號，8拷貝。
(5)轉基因小鼠的Westernblot檢測在轉基因小鼠生仔鼠後的第5天，採集乳汁。將採集的乳汁進行4500rpm離心10min，去除乳脂。加入2倍體積滅菌水，調pH值至4.0左右去除酪蛋白，最後將pH值調到8.0，將乳清保存於-70℃冰箱。通過雜交的結果估算轉基因小鼠的溶菌酶的表達含量人乳汁溶菌酶的含量為0.5mg/ml，由此可以初步估測，6號乳清重組溶菌酶含量為0.2mg/ml；34號乳清重組溶菌酶含量為0.12mg/ml；41號沒有表達。(圖4)從圖中可看出34，6號小鼠奶樣可以檢測到重組人溶菌酶的表達，初步估測，6號乳清重組溶菌酶含量為0.2mg/ml；34號乳清重組溶菌酶含量為0.12mg/ml；41號沒有表達(6)、重組人溶菌酶的活性檢測a.溶菌酶對溶壁微球菌溶菌作用的標準曲線建立配置標準溶菌酶，濃度分別為50、75、100、125、150、175、200U/mL。取90ul細菌懸浮液置於比色皿中，加入酶液10ul，迅速用移液器吹勻，測定450nm下的光吸收值(OD450)。從加入酶液起計時，每隔1min記錄1次，每組數據要重複3次以上。以0至1分鐘的OD450的差值的平均值作為縱坐標，以標準酶的濃度作為橫坐標來製作標準曲線。根據標準曲線，我們可以得到回歸方程y＝0.0005x-0.002，y代表OD450的差值，x代表酶活力(U/ml)。由此公式可推導出x＝2000(y+0.002)。在乳清的製備過程中，被稀釋3倍，所以，乳清的酶活力計算公式為x＝2000(y+0.002)×3。
b.重組人溶菌酶的活性檢測根據上述方法，分別測定轉基因小鼠、人、陰性小鼠乳清對溶壁微球菌作用的OD450值變化，測定三次，取0至1分鐘的OD450差值。根據x＝2000(y+0.002)×3公式可以計算乳清中溶菌酶的濃度。轉基因小鼠6號的酶活力為480U/ml、34號301U/ml、41號37.98U/ml，陰性小鼠的酶活力為25.98U/ml，人的為1224U/ml。由此可見，與陰性小鼠相比，轉基因小鼠乳清的溶菌酶酶活力有非常明顯提高，其中6號小鼠提高了18倍，34號提高了11倍，但41號幾乎沒有提高。與人乳清相比，轉基因小鼠乳清中的溶菌酶酶活力度相對較低，其中6號佔2/5，34號佔1/4。由此可見，重組人溶菌酶的表達可以顯著提高小鼠乳汁中溶菌酶的活力，表明通過乳腺表達的重組人溶菌酶具有溶菌的生物學活性。
2.1.2pBC2-sigHLY表達載體構建及轉基因小鼠模型建立1).pBC2-sighLY表達載體的構建策略為了構建含有beta-casein信號肽DNA序列的溶菌酶表達載體，我們設計了如下構建表達載體的策略。首先合成牛beta-casein信號肽DNA序列，5』和3』端分別含有XhoI和Csp45I，利用這兩個酶切位點連到pGEM-7zf質粒上得到p7zf-sig質粒。再利用長片段PCR方法擴增人溶菌酶基因的編碼區序列，5』端有Csp45I酶切位點，3』端依次有XhoI和HindIII兩個酶切位點。利用Csp45I和HindIII酶切位點連到p7zf-sig上得到p7zf-sigHLY質粒。構建pBC2載體，用XhoI將牛信號肽和溶菌酶編碼區融合序列切下來，連到pBC2的XhoI位點。
2).牛beta-casein信號肽的設計與合成為了獲得牛beta-casein信號肽，我們分別合成了兩條單鏈DNA序列。序列分別為正向5`TCGAGATGA AGGTCCTCAT CCTTGCCTGC CTGGTGGCTC TGGCCCTTGCAAAGGTCTT 3`，反向5`C GAAGACCTTT GCAAGGGCCA GAGCCACCAGGCAGGCAAGG ATGAGGACCT TCATC 3`。黑體劃線部分序列為牛beta-casein信號肽DNA序列。將兩條單鏈DNA退火成雙鏈後，5`端會形成XhoI酶切位點部分，3`端形成Csp45I酶切位點部分。將已合成的信號肽DNA溶解，終濃度達825ng/μl)。然後各取10μl混勻，沸水煮5分鐘進行變性，然後室溫冷卻進行退火，這樣就可以形成5`端和3`端分別包含XhoI和Csp45I部分酶切位點的牛beta-casein信號肽DNA3).牛beta-casein信號肽DNA的克隆我們利用牛beta-casein信號肽DNA上的XhoI和Csp45I部分酶切位點將其連接到pGEM-7zf載體上得到p7zf-sig重組質粒。為了鑑定連上信號肽的重組質粒，我們利用Kpn I進行酶切鑑定。由於在7zf質粒XhoI和Csp45I之間連上信號肽DNA片段，原有的KpnI酶切位點被去掉。因此，p7zf-sig不能被KpnI切開，而pGEM-7zf可以被切開。同時，對其進行測序，再次證實信號肽序列已連到pGEM-7zf上，並完全正確。
4).溶菌酶基因編碼區(不含信號肽序列)的獲得為了獲得人溶菌酶基因的編碼區，我們利用探針從BAC庫調取含有溶菌酶基因的BAC克隆(BAC RP11-1143G9)。在含有氯黴素的LB液體培養基內，進行搖菌。然後按上述方法提取BAC，，濃度約為100ng/L。接下來，我們用BAC RP11-1143G9作為模板進行PCR擴增來獲得溶菌酶基因的編碼區序列片段。
為了得到溶菌酶編碼區(不含信號肽序列)片段，我們以溶菌酶基因組DNA序列為模版設計引物進行DNA擴增。設計的引物為上遊5`ATT CGA AAG GTG TGA GTT GGCCAG AAC TCT G 3`，5`端分別含有Csp45I酶切位點，下遊5`TAA GCT TCT CGA GACCAT CCT GGC TAA CAC G 3`，5`端包含Hind III和XhoI兩個酶切位點。擴增產物全長5255bp，不包含溶菌酶基因分泌肽部分的DNA片段。PCR條件94℃3min，94℃1min，60℃1min，68℃5min，68℃14min，4℃1∞；30cycles。再按上述的方法提取含有溶菌酶基因的BAC(RP11-1143G9)，以BAC為模板進行PCR擴增，PCR結果如下(圖5)。
5).PCR產物的克隆為了對PCR產物進行測序和驗證，我們首先把它克隆到pPCR-XL-TOPO vector上得到pTOPO-sigHLY重組載體。
6).p7zf-sighLY重組質粒的獲得為了得到含有牛beta-casein信號肽DNA的溶菌酶基因編碼區，我們先利用Hind III和Csp45I將pTOPO-HLY重組載體上的溶菌酶基因編碼區(不含溶菌酶本身信號肽)切下來，連接到p7zf-sig質粒上，從而得到牛beta-casein信號肽DNA和溶菌酶基因連在一起的重組質粒p7zf-sigHLY。為了鑑定p7zf-sigHLY11為陽性重組質粒，利用KpnI和XhoI分別進行酶切，由於在連接信號肽序列的過程中，KpnI酶切位點被去除，所以KpnI不能切開重組質粒。而由於信號肽的5』端和溶菌酶編碼區3』端分別含有XhoI酶切位點，所以酶切可以得到3kb的7zf骨架片段和5kb的信號肽和溶菌酶編碼區片段。酶切結果如圖6所示，證實11號質粒確實為陽性重組質粒。
對p7zf-sighLY11進行測序，結果表明這個載體上包含牛beta-casein的信號肽序列和溶菌酶編碼區的部分序列，並且這些序列沒有發生任何突變。p7zf-sigHLY11質粒測得序列的比對結果如圖24，該測序結果表明beta-casein的信號肽序列與hly序列成功連接7).pBC2-sighLY exprssion vector的構建本發明採用pBC2作為構建乳腺表達載體的骨架載體，pBC2是pBC1經過修改所獲得的載體，即在pBC1的6407-6438bp處缺失31bp(GAATTCATTTCCTAATCATGCAGATTTCTAG)所構建的載體。這段序列位於pBC1中beta-casein啟動子區域，構建pBC2的目的即是要檢測這段序列是否影響外源基因在哺乳動物乳腺中的表達。
pBC2構建過程如下用ClaI和XhoI酶切pBC1質粒DNA，回收4kb的片段，通過ClaI和XhoI酶切位點與pGEM-7zf進行連接獲得pGEM-CX1，通過EcoRI位點將缺失序列(pBC1L1AATTCATTTCCTAATCATGCAGATTTCTAGG，和pBC1 L2AATTCCTAGAAATCTGCATGATTA GGAAATG，兩序列退火形成雙鏈)與pGEM-CX1連接得到pGEM-CX2，用ClaI和XhoI酶切pGEM-CX2並回收4kb的片段，通過ClaI和XhoI酶切位點與pBC1進行連接即可獲得pBC2。
在構建溶菌酶基因表達載體時，我們首先分別對pBC2和p7zf-sigHLY進行XhoI酶切與回收，再按1∶10的比例混勻於16℃過夜連接，再進行電轉化。挑單克隆菌落進行搖菌提取質粒，篩選組質粒的XhoI位點已連入約5kb外源片段(如圖7)。由於上述連接屬於單酶切位點連接，所以必須進行插入片段的方向鑑定。我們選擇限制性內切酶KpnI和Csp45I與ClaI和Csp45I雙酶切進行方向鑑定，Csp45I在外源片段的5』端有1個酶切位點，在pBC2上，ClaI酶切位點位於4529bp，KpnI位於13772bp，在19kb的位置存在一個Csp45I酶切位點。根據酶切產物的DNA片段大小，可以判斷外源片段的插入方向。13號重組質粒的酶切結果如圖8，表明13號重組質粒為正向型重組質粒。
8).載體外顯子部位的測序為了保證所構建溶菌酶基因表達載體的準確性，我們要對載體的編碼區部位進行測序。因為前面已經對外顯子1的部位完成了測序，所以這裡主要對外顯子2、3、4進行測序。如圖25、26、27.綜合測序的結果，表明pBC2-sigHLY表達載體的外顯子序列沒有發生任何突變和錯配。這有利地保證了pBC2-sighLY表達載體能夠正確轉錄和翻譯。
載體外顯子2的測序結果及其與溶菌酶基因序列的比對如圖25，經比對，外顯子2的序列與溶菌酶基因本身序列完全一致。也顯示內含子2的序列沒有發生突變。
載體外顯子3的測序結果及其與溶菌酶基因序列的比對如圖26，經比對，外顯子3的序列也沒有發生任何突變。上行為溶菌酶的基因序列，下行為外顯子3及其側翼序列。
外顯子4的測序結果及其與溶菌酶基因序列的比對如圖27，經與溶菌酶基因序列比對，CDS4和外顯子4均沒有發生突變。
9)pBC2-sigHLY轉基因小鼠模型的建立及檢測(1).pBC2-sigHLY expression vector的NotI和SalI酶切片段的回收與檢測用顯微注射法生產轉基因小鼠，線形DNA比環形DNA整合效率高，因此必須將人pBC2-sigHLY切成線形後(圖9)，方可進行顯微注射；另外，多餘的質粒片段也影響DNA整合效率。所以本實驗用NotI和SalI雙酶切，除去質粒的多餘部分，用Qigen試劑盒回收約26kb大小的片段，OD260/OD280值為1.75，將其濃度調至2ng/μl，通過顯微注射法建立轉基因小鼠。
(2).顯微注射共注射受精卵1500枚，移植受體鼠73隻，受孕鼠34隻，共生小鼠63隻(3).轉基因小鼠的PCR檢測取2-3周齡轉基因小鼠的尾巴組織樣，提取DNA。用前面已使用過的一對引物(上遊5`TTA TAC ACA CGG CTT TAC 3`下遊5`CAG CAT CAG CGA TGT TAT CT 3`)分別對小鼠DNA樣PCR擴增，以普通小鼠基因組作為陰性對照，以人基因組作為陽性對照，結果發現共有5隻小鼠為轉基因陽性小鼠，陽性率為7.9％，如圖10.從檢測結果表明這些小鼠都轉有pBC2-sighLY。
(4).轉基因小鼠的Southern blot檢測將PCR檢測為陽性的5隻小鼠尾巴組織樣DNA，取大約10μg用PstI內切酶消化，低壓慢速電泳，轉膜後，進行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標記的PCR產物。雜交可得到5kb片段。結果如圖11所示，結果表明6、12、43、61和63號轉基因小鼠均為陽性小鼠，與PCR檢測結果一致，而陰性小鼠的基因組沒有雜交信號(0)。轉基因小鼠拷貝數的計算陽性對照包括3條帶(5、3、1)，分別相當於基因組的5、3、1拷貝。根據Southern雜交信號強度，估算轉基因小鼠的外源基因整合的拷貝數。6號，1拷貝；12號，2拷貝；43和61號，高於30拷貝，63號，8拷貝。
(5).轉基因遺傳的檢測Founder轉基因小鼠一經鑑定後立刻與非轉基因小鼠一起進行交配。共有6隻陽性Founder小鼠，F1代共44隻，採用與鑑定始祖轉基因小鼠同樣的程序提取基因組DNA及PCR檢測。其中6、12、61號小鼠後代的陽性率接近或小於50％；63號的後代為76.9％；43號的後代為100％。理論上，轉基因小鼠後代的陽性率至少為50％，並符合孟德爾分離規律。
(6).轉基因小鼠的Western blot檢測在轉基因小鼠生仔鼠後的第5天，採集乳汁，並採集一隻陰性小鼠第5天的乳汁作為對照。在採集乳汁之前，需將母鼠與仔鼠隔離3小時以上，並通過腹腔注射一定劑量的催產素和按摩乳房才能順利採集到乳汁。以人奶作為陽性對照，以陰性小鼠奶樣作為陰性對照進行Western檢測。陰性小鼠的沒有雜交信號，人的有較強雜交信號作為陽性對照。對於轉基因小鼠，61和63號小鼠的奶樣有較強雜交信號，檢測到重組溶菌酶的表達。人乳中含有溶菌酶0.5mg/ml，根據信號的強度來估計，61號外源人溶菌酶的含量約為2mg/ml；63號約為0.5mg/ml；而12號沒有重組溶菌酶的表達，如圖12。
(7)、重組人溶菌酶的活性檢測A.溶菌酶對溶壁微球菌溶菌作用的標準曲線建立方法如前所述B.重組人溶菌酶的活性檢測根據上述方法，分別測定轉基因小鼠、人、陰性小鼠乳清對溶壁微球菌作用的OD450值變化，測定三次，取0至1分鐘的OD450差值。根據x＝2000(y+0.002)×3公式可以計算乳清中溶菌酶的濃度。轉基因小鼠61號的酶活性為2160U/ml、63號948U/ml、12號30U/ml，陰性小鼠(ck)的酶活性為25.98U/ml，人的為1224U/ml。由此可見，與陰性小鼠相比，轉基因小鼠乳清的溶菌酶濃度有顯著提高，其中61號小鼠提高了83倍，63號提高了36倍，但12號幾乎沒有提高。與人乳清相比，61號的溶菌酶濃度提高了近1倍，63號也接近了人乳清的溶菌酶濃度，約為0.8倍。
從以上結果可以看出，我們構建的pBC1-HLY和pBC2-sigHLY表達載體，都能在轉基因小鼠乳腺中特異表達具有溶菌活性的重組人溶菌酶，而具有牛beta-casein信號肽序列的pBC2-sigHLY表達載體表達量以及相對溶菌活性都要明顯高於pBC1-HLY表達載體，因此pBC2-sigHLY表達載體是我們進行下一步實驗即進行轉基因克隆牛製作所採用的主要載體。而且從轉基因小鼠的表達情況可以看出，在山羊beta-casein啟動子區缺失31bp序列的pBC2與完整的pBC1的表達效果一致，證明我們構建的pBC2也可以用於轉基因動物乳腺特異表達研究。
2.1.3pBC2-sigHLY-EGFP-NEO和pBC2-sigHLY-NEO表達載體構建1).pBC2-sighLY標記表達載體的構建策略為了便於篩選陽性細胞，我們首先構建了含綠色螢光蛋白基因(EGFP)和新黴素基因雙選擇標記載體(pEGFP-NEO)以及新黴素基因單選擇標記載體(pNEO)，然後分別將兩個標記載體與此前構建的pBC2-sigHLY載體連接構建成pBC2-sigHLY-EGFP-NEO和pBC2-sigHLY-NEO表達載體。
2)pEGFP-NEO的構建用NotI和SalI酶切pBC1回收約6kb的片斷，連接一個依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，構建成pXM，用BamHI和NotI酶切pCMV-EGFP-IRES-NEO並回收4kb片斷EGFP-IRES-NEO，同時用BamHI和NotI酶切pXM，並與EGFP-IRES-NEO連接即構成pEGFP-NEO，如圖13.
3)pNEO的構建用NotI和SalI酶切pBC1回收約6kb的片斷，連接一個依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，構建成pXM，用BamHI和NotI酶切pIRES-NEO並回收2kb片斷IRES-NEO，同時用BamHI和NotI酶切pXM，並與IRES-NEO連接即構成pNEO，如圖14.
4)pBC2-sigHLY-EGFP-NEO表達載體構建用NotI和SalI酶切pBC2-sigHLY和pEGFP-NEO，將兩者連接即構成pBC2-sigHLY-EGFP-NEO，通過酶切及測序分析，確定pBC2-sigHLY-EGFP-NEO載體構建成功，載體圖如下(圖15)5)pBC2-sigHLY-NEO表達載體構建用NotI和SalI酶切pBC-sigHLY和pNEO，將兩者連接即構成pBC2-sigHLY-NEO，通過酶切及測序分析，確定pBC-sigHLY-NEO載體構建成功，載體圖如下(圖16)2.2細胞培養，基因轉染及陽性細胞篩選2.2.1胎兒成纖維細胞的原代培養在超淨工作檯中將胎兒浸泡在70％酒精中30sec，用PBS漂洗幾遍，以消毒過的手術器械取下耳部及脊背部的數塊表皮組織於DMEM+10％FCS培養液裡。
↓在直徑60mm平皿中將胎兒組織切碎成為1mm3大小的組織碎塊，再將組織碎塊轉移至15mlmlml離心管中，1000rpm下離心洗滌數次。
↓用消毒玻璃彎頭吸管將小組織碎塊吸至25cm2培養瓶中，通過玻璃吸管彎頭使組織塊均勻分布在瓶壁上。
↓小心翻轉培養瓶(防止組織塊落下)讓組織塊黏附於瓶壁上，置於37度，5％CO2培養箱中放置2～4h，待組織塊貼壁後，再正置培養瓶，補加適量培養液繼續培養。
2.2.2胎兒成纖維細胞的傳代、冷凍、及復甦待種植的原代細胞生長至80％匯合時，將細胞一部分冷凍，一部分傳代繼續培養。
2.2.2.1傳代用消毒玻璃彎頭吸管小心吸除培養瓶中的培養液，沿著細胞生長壁的對面瓶壁注入無鈣鎂PBS(37度溫育)衝洗細胞兩次，以祛除殘餘血清及細胞代謝物。
↓用同樣方法加入0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液，加入量為可覆蓋細胞單層即可(直徑100mm培養皿一般加入1ml消化液，35mm培養皿中加入200uL消化液)，放入培養箱中消化1-2min。在顯微鏡下觀察，待細胞開始變圓時，用手指敲打培養皿壁，使細胞徹底脫壁，然後加入培養液終止消化。
↓用消毒玻璃彎頭吸管反覆吹打，細胞，使其分散成為單個細胞，1000rpm下離心5min收集細胞。用培養液按1∶2或1∶3比例稀釋並重新接種細胞至培養皿中培養。
2.2.2.2冷凍貼壁細胞消化後，收集細胞於離心管中，在1000rpm下離心5min以去盡上清。
↓加4度預冷的冷凍液(DMEM+20％FCS+10％DMSO)重懸細胞沉澱，使細胞濃度約為107個細胞/ml，轉移細胞至凍存管中。
↓放入4度冰箱預冷30min，再把凍存管插於厚泡沫上後置於液氮液面燻蒸2h，然後迅速投入液氮保存。
2.2.2.3復甦從液氮中取出凍存管，快速投入37度水浴中，並在水浴中不斷快速搖動凍存管以迅速解凍。
↓待冷凍液徹底解凍後，以新鮮培養液稀釋10倍並將溶解液轉移至離心管中，在1000rpm下離心5min去除DMSO以緩減冷凍液毒性。
↓用新鮮的培養液懸浮細胞沉澱，將細胞稀釋至所需濃度，繼續培養。
2.2.3轉染用DNA的準備大提質粒pBC2-sigHLY-EGFP-NEO和pBC2-sigHLY-NEO，以SalI酶切質粒，酶切反應如下質粒DNA約10-20μg
10×反應buffer20μl限制性內切酶 10-20UddH2O 補足體系至200μl上述試劑加好後，混勻，37度水浴消化2h，取5μL酶切產物以0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否完全，若酶切完全，加酚、酚/氯仿各抽提一次，加2倍體積無水乙醇和0.1倍體積乙酸鈉(PH5.2)，混勻後置-20度過夜；12000rpm離心15min回收沉澱，70％乙醇洗滌一次，真空乾燥，加TE溶解。
2.2.4牛胎兒成纖維細胞對G418毒性敏感性檢測細胞培養到第3代後用0.25％胰蛋白酶消化，按每孔0.5～1×105個細胞接種到13個直徑35mm培養皿中以使細胞儘量分散。次日在其中12孔中以100μg/ml的梯度依次加入終濃度從100μg/ml到1200μg/ml的G418，還有一孔中不加入G418作為對照。連續培養三周，每3～4天換液一次，同時補加G418。每天觀察細胞生長或死亡情況。
2.2.5電擊轉染轉染前將10～50μg純化回收的DNA融入500μL2×HeBS中，補充滅菌超純水至1ml，冰浴預冷。
↓在轉染前2～3天，用0.25％胰蛋白酶溶液消化培養細胞。將1×106個細胞轉接於75cm2培養瓶內，加入完全培養液，置37度、5％CO2培養箱中培養。
↓轉染前，在倒置顯微鏡下觀察培養的細胞，確定細胞處於對數生長後期。用0.25％胰蛋白酶溶液消化細胞，1000rpm離心5min沉澱細胞。
↓將細胞沉澱用冰浴預冷的1×HeBS離心洗滌1次，同時進行細胞計數。
↓將一定數量的細胞重新懸浮於加有DNA的電極緩衝中，混合均勻後轉入電擊杯中，在電擊前冰浴10min。
↓當細胞準備好進行電擊時，設置電場強度(E)和脈衝時間(t)，先試一下，確保產生了所需的脈衝。將電擊杯插入電擊槽中，按照選定的電場強度(E)和脈衝時間(t)，電擊細胞。
↓將經電擊後的細胞冰浴10min後轉入75cm2的培養瓶中，加入含20％FCS的DMEM培養液中於37度、5％CO2培養箱中培養。
↓
1-2天後待細胞生長狀態恢復，將細胞擴大10倍培養，加入適量的G418進行篩選。
↓每3～4天換液一次，同時補加G418。每天觀察細胞生長或死亡情況。6-10天後，挑選陽性克隆細胞。
2.2.6陽性細胞的單克隆培養在螢光顯微鏡下觀察上述方法所得細胞克隆的發光情況，用記號筆圈住分散良好(遠離其它克隆)且細胞數量多的螢光克隆；吸除培養液，用無鈣鎂PBS漂洗細胞二次，在高倍解剖鏡下，將30-50ul 0.25％胰蛋白酶消化液滴加在標記好的細胞克隆上，待克隆的大多數細胞收縮脫壁後，不等細胞懸浮，快速吸取細胞克隆，但注意不要吸入附近其它克隆的細胞；轉移細胞到加有500μl培養液的四孔板中，吹打分散細胞團塊；挑出的克隆繼續培養，降低G418濃度至300μg/ml維持篩選；待克隆細胞數量擴大後或匯合後，將一部分細胞轉移到35mm培養皿中繼續擴大培養，另一部分用於轉基因檢測，其它擴大後的細胞儘早冷凍。
2.3轉基因體細胞克隆2.3.1卵母細胞的成熟培養從屠宰廠收集成年牛的卵巢，置於30℃的生理鹽水在4h內送到實驗室，37℃的PBS液中清洗三遍後，以直徑為0.7mm針頭抽取直徑為2～8mm的卵泡，回收形態均勻、結構緻密的卵丘-卵母細胞-複合體(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/ml bFSH+0.01U/mlbLH+1μg/ml estradiol)洗滌兩遍，然後將卵丘-卵母細胞-複合體以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％CO2培養箱中成熟培養18～20h後，將成熟的卵母細胞放入0.1％透明質酸酶的管內振蕩2～3min後，再用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細胞與卵母細胞完全脫離，選擇形態完整，細胞質均勻並排出第一極體的卵母細胞為體細胞核受體.
2.3.2卵母細胞的去核將帶有第一極體的卵母細胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/ml細胞松馳素B的操作液中，在200倍顯微鏡下用一玻璃針於極體上方將透明帶切一小口，再用內徑為20μm的玻璃管將第一極體以及其下方的卵母細胞內的染色體一併吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍後，置於培養箱中備用.
2.3.3移核與融合將血清飢餓2～4d的供體細胞用0.25％trypsin消化2～4min，選擇直徑為10～12μm的體細胞用20μm直徑玻璃管將其移入去了核的卵母細胞透明帶內，然後將其放入Zimmerman液[15]中平衡3～5min後放入融合槽內，轉動卵細胞使供體細胞與卵母細胞接觸面與電場垂直，同時在直流脈衝的場強為2.5kV/cm、脈衝時間為10μs、脈衝次數為2次、脈衝間隔為1s的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)後，迅速將重構胚移入M199+10％FBS液中，放置0.5h後觀察融合率，挑選融合胚進行下一步激活處理.
2.3.4重構胚的激活與培養將重構胚放入5μmol/L Ionomycin(Sigma)液中，4min後換到1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h後再移入CRlaa+5％FBS液中，在38.5℃、5％CO2培養箱中培養2d後觀察分裂率，7d後觀察囊胚發育率2.3.5胚胎移植與妊娠檢測將形態優良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體母牛的子宮角內.受體母牛選擇的都是經產母牛，其中紅系冀南黃牛的克隆胚胎被移入Holstein奶牛，Holstein奶牛的克隆胚胎被移入魯西黃牛.在移植後的第60d進行直腸檢測，以確定妊娠率.
2.4轉基因克隆的PCR和Southern鑑定本發明共獲得四頭轉有pBC-sigHLY-NEO的轉基因克隆牛，一頭轉有pBC-sigHLY-EGFP-NEO的轉基因克隆牛。採集轉基因、非轉基因克隆牛和普通荷斯坦奶牛耳部組織樣，提取DNA，然後進行PCR鑑定和Southern鑑定。
PCR檢測的引物序列為上遊5`TTA TAC ACA CGG CTT TAC 3`下遊5`CAG CAT CAGCGA TGT TAT CT 3`。PCR條件94℃ 5min；94℃ 40sec，53℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 7min，4℃1∞，產物長度為700bp。結果如圖17和18。
對於NEO基因，引物序列為上遊5`AGGATC TCC TGT CAT CTC ACC TTG CTC CTG3`下遊5`AAGAAC TCG TCAAGAAGG CGATAGAAG GCG 3`。PCR條件94℃ 5min；94℃ 40sec，60℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 7min，4℃1∞，產物長度為490bp。結果如圖19和20。
對於EGFP基因，引物序列為上遊5`TGC AGT GCT TCA GCC GCT AC 3`下遊5`CTCAGG TAG TGG TTG TCG GG 3`。PCR條件94℃ 5min；94℃ 40sec，62℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃7min，4℃1∞，產物長度為380bp。結果如圖21。
我們所使用的pBC2載體啟動子為山羊酪蛋白啟動子，並在啟動子區有31bp缺失。我們在缺失處設計了一對引物(pBCF15′GGG GAC AGA AAA ATA GGA AG 3′，pBCF15′AGA GGA GAA GAA GTGAAG GA 3′)，PCR條件94℃5min；94℃30sec，60℃ 30sec，72℃30sec，30cycles；72℃7min，4℃1∞，完整pBC1的擴增產物為174bp，而pBC2為143bp。擴增結果如圖22，泳道3和6擴增產物約為140bp，這是因為pBC2-sigHLY-NEO質粒DNA和轉基因小鼠DNA均含有缺失序列的pBC2；而1，2，3，4號牛，對照牛以及完整pBC的擴增產物均含有一條約為170bp帶，這可能是由於牛與羊的酪蛋白啟動子區同源性較高(pBCF1和2引物與牛酪蛋白啟動區同源性為100％和95％)的緣故，而2和3號克隆牛則還含有一條約為140bp的條帶，進一步證明2和3號克隆牛為轉有pBC2-sighLY-NEO的轉基因克隆牛。
從以上PCR結果可以看出，在我們得到的四頭克隆牛均轉有pBC2-sigHLY-NEO，而另有一頭轉有pBC2-sigHLY-EGFP-NEO。
取PCR檢測為陽性的轉基因克隆牛DNA約10μg用PstI內切酶消化，低壓慢速電泳，轉膜後，進行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標記的5kb的hLY基因。以pBC2-sigHLY-NEO質粒為陽性對照，以非轉基因克隆牛基因組為陰性對照，雜交可得到5kb片段，如圖23所示進一步確定了金娃和盼娃轉有溶菌酶基因，可以估計金娃和盼娃轉有20個拷貝的人溶菌酶基因，根據轉基因小鼠結果，可以推測這兩頭轉基因牛將能在乳腺中高效表達人溶菌酶。
2.5轉基因牛重組人乳鐵蛋白表達分析2.5.1藥物催乳以西安草灘藥廠生產的催乳針按1/4劑量對6-8月齡的轉基因克隆牛進行藥物催乳，同時以雙標記載體轉基因克隆牛、普通克隆牛、同月齡普通黑白花奶牛作為對照進行催乳，還以普通牛奶為對照，每天收集3次奶樣，共收集兩周。
2.5.2轉基因牛奶的PAGE電泳、Western和放免測定本實施例對四頭轉基因牛乳樣進行分析。對轉基因牛的乳樣用重蒸滅菌水稀釋三倍，進行去乳脂、去酪蛋白的處理，最後得到乳清部分。重組人溶菌酶即存在於乳清中。對轉基因牛奶樣和對照乳樣進行脫脂和去酪蛋白後，用減性(reducing)SDS上樣Buffer變性的PAGE膠進行電泳，結果如圖24。從此圖可以看出轉基因牛奶樣有一條與人溶菌酶標準品大小一致的特異條帶。用兔抗人溶菌酶抗體進行Western雜交，結果如圖25。從Western結果可以看出轉基因牛乳樣和人奶有一條與人溶菌酶標準品大小一致的特異條帶，表明轉基因牛乳腺中能表達完整的重組人溶菌酶。
利用放射性免疫法檢測轉基因牛奶樣中重組人溶菌酶的表達量。人溶菌酶標準品用125I用氯胺-T法標記，取6個時間點的乳樣進行檢測。測得轉基因牛乳樣中重組人溶菌酶的表達量平均值金娃為3.49g/l，盼娃為0.55g/l，329為0.52g/l，而0365牛為2.48g/l，表明我們所使用的人溶菌酶基因結構可以在轉基因牛乳腺中高效表達完整的重組人溶菌酶。
2.5.3重組人溶菌酶的活性檢測標準曲線建立如前所述(轉基因小鼠)，經檢測，轉基因牛金娃的重組人溶菌酶酶活性為3065U/ml、盼娃922U/ml、329號986U/ml，0365號2740U/ml，陰性小鼠(ck)的酶活性為25.98U/ml，人的為1224U/ml。可見本發明所生產的重組人溶菌酶具有與天然人溶菌酶相當的生物活性，甚至超過天然人溶菌酶生物活性。
附SEQ ID NO 1本序列為人溶菌酶一級結構即胺基酸序列，共148個胺基酸，其中前18個胺基酸為信號肽。
1 MKALIVLGLV LLSVTVQGKV FERCELARTL KRLGMDGYRG ISLANWMCLA51 KWESGYNTRA TNYNAGDRST DYGIFQINSR YWCNDGKTPG AVNACHLSCS101ALLQDNIADA VACAKRVVRD PQGIRAWVAW RNRCQNRDVR QYVQGCGV
權利要求
1.一種轉人溶菌酶基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法，其操作步驟如下(1)構建含有人溶菌酶基因的乳腺特異表達載體，(2)構建人溶菌酶乳腺特異表達載體與雙標記選擇載體和單標記選擇載體的串聯結構，將串聯結構DNA導入家畜體細胞核內，獲得轉基因細胞，(3)轉基因細胞作為核供體進行體細胞克隆，獲得轉基因克隆動物。
2.根據權利要求1所述的生產方法，所述乳腺特異表達載體為pBC2-sigHLY，所述的pBC2為在pBC1的6407-6438bp處缺失31bp所構建的骨架載體。
3.根據權利要求2所述的生產方法，其中所述的sigHLY由牛beta-casein信號肽序列，人溶菌酶的14外顯子和1-3內含子組成。
4.根據權利要求1所述的生產方法，所述的導入方法為電穿孔轉染法。
5.根據權利要求1所述的生產方法，所述的雙標記選擇載體以增強型綠色螢光蛋白基因和新黴素抗性基因為標記選擇基因。
6.根據權利要求5所述的生產方法，所述串聯結構DNA為pBC2-sigHLY-EGFP-NEO。。
7.根據權利要求1所述的生產方法，所述的單標記選擇載體以新黴素抗性基因為標記選擇基因。
8.根據權利要求7所述的生產方法，所述串聯結構DNA為pBC2-sigHLY-NEO。
9.根據權利要求1所述的生產方法，所述大型家畜為牛、山羊、綿羊、豬或兔。
10.根據權利要求9所述的生產方法，所述大型家畜為牛。
全文摘要
本發明涉及一種轉人溶菌酶基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法，其操作步驟如下(1)構建含有人溶菌酶基因的乳腺特異表達載體，(2)構建人溶菌酶乳腺特異表達載體與雙標記選擇載體和單標記選擇載體的串聯結構，將串聯結構DNA導入家畜體細胞核內，獲得轉基因細胞，(3)轉基因細胞作為核供體進行體細胞克隆，獲得轉有人溶菌酶基因的轉基因克隆動物。本發明所研究的重組人溶菌酶，具有與天然人溶菌酶相同的生物活性；含有重組人溶菌酶的牛奶可以開發成保健牛奶及奶製品；純化的重組人溶菌酶可以開發成防腐劑、食品添加劑、保健品和藥品。
文檔編號C12N15/56GK1891821SQ20061007624
公開日2007年1月10日 申請日期2006年4月21日 優先權日2005年4月21日
發明者湯波, 戴蘊平, 龔國春, 於政權, 張磊, 李寧 申請人:李寧