棒桿菌發酵生產L‑賴氨酸的方法及其啟動子改造與流程
2023-04-30 13:56:51
本發明屬於胺基酸發酵領域，具體而言，本發明涉及發酵生產L-賴氨酸的方法和應用，和可以用在這些方法和應用中的細菌及啟動子等。
背景技術：
：通過產L-賴氨酸的細菌（如，棒桿菌屬的杆狀細菌，尤其是穀氨酸棒桿菌）發酵來生產L-賴氨酸已經得到了產業化應用。這些細菌，可以是從自然界分離的細菌，也可以是通過誘變或基因工程改造獲得的細菌，或者兩者兼而有之。通過基因工程改造棒桿菌屬的細菌，主要是通過增加或減少與L-賴氨酸代謝途徑相關的酶活性或表達量來實現的。例如，中國專利CN1017906B公開了生產L-賴氨酸的方法，包括使用含合成二氫二吡啶羧酸合成酶和/或琥珀醯四氫吡啶羧酸合成酶的重組DNA的棒狀桿菌屬細菌來發酵的步驟；中國專利申請CN1187539A公開了生產L-賴氨酸的方法，包括使用含編碼天冬氨酸激酶和編碼二氨基庚二酸脫羧酶的重組DNA的棒桿菌屬細菌來發酵的步驟；中國專利申請CN1310234A公開了生產L-賴氨酸的方法，包括使用含α－酮戊二酸脫氫酶的基因的棒桿菌屬細菌來發酵的步驟；中國專利申請CN1890372A公開了生產L-賴氨酸的方法，包括使用果糖-1，6-二磷酸酶活性增加穀氨酸棒桿菌來發酵的步驟；中國專利申請CN101065484A公開了具有產生L－胺基酸的能力的棒菌屬細菌，其被修飾使得乙醯輔酶A水解酶活性減少；中國專利申請CN104245921A公開了生產L-賴氨酸的方法，包括使用含編碼木糖異構酶和木酮糖激酶的基因的棒桿菌屬細菌來發酵的步驟。要增加酶活性，除了改造基因本身之外，主要涉及對啟動子的改進。然而，現有技術中對棒桿菌屬的杆狀細菌的啟動子改進很少，多數仍舊保留了野生型啟動子，如CorynebacteriumglutamicumATCC13869株（可參見GenBank:CP016335.1的第2531528至2531972位）、CP株（可參見GenBank:CP012194.1的第2575805至2576249位）、ZL-6株（可參見GenBank:CP004062.1的第2560677至2561121位）、BrevibacteriumflavumZL-1（（可參見GenBank:|CP004046.1的第2569176至2569620位）的。而本發明人經過長期研究和實踐，經歷了眾多的失敗，憑藉了一些運氣，發現對cspB基因的野生型的啟動子的兩個位點進行突變，即可獲得改進的啟動子，用其替換棒桿菌屬的杆狀細菌染色體上的其他位置上的野生型啟動子，也能增強相應基因的表達，並最終提高L-賴氨酸的產量。尤其是，該方法與現有改造的大量高產L-賴氨酸的細菌的染色體改造位點沒有衝突，可以疊加提高的效果，從而在實踐上可用於多種細菌發酵生產L-賴氨酸。技術實現要素：本發明要解決的技術問題在於提供新的發酵生產L-賴氨酸的方法及其相關的方法，包括相對於未改造細菌提高L-賴氨酸的發酵生產量的方法，改造的細菌在發酵生產L-賴氨酸中的應用，改造的細菌在相對於未改造細菌提高L-賴氨酸的發酵生產量的應用，和/或，改造細菌的方法等。另外，本發明還涉及相應改造獲得的細菌，以及其中所使用的啟動子及其表達盒、載體和宿主細胞等。具體而言，在第一方面，本發明提供了發酵生產L-賴氨酸的方法，其包括：（1）將棒桿菌屬細菌染色體上一個或多個基因的啟動子替換為EP5啟動子，其中，所述基因編碼酶活性和/或表達量提高有利於提高L-賴氨酸產量的蛋白質，所述EP5啟動子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述啟動子的啟動活性，並且其第51位保持為C，其第88位保持為T；和，（2）用步驟（1）改造而得到的細菌發酵生產L-賴氨酸。替換的技術手段廣泛記載於分子生物學和微生物學文獻中，有許多甚至已經商品化了。在本發明的具體實施方式中，根據同源重組的原理，可以採用Addgene公司商品化的pKOV質粒系統來進行改造，也可以採用pK18mobsacB質粒系統來進行改造。因此，在本文中，替換優選是通過同源重組進行的替換。被替換的基因的啟動子優選是該基因的野生型的啟動子。在本文中，野生型的啟動子可以被定義為穀氨酸棒桿菌ATCC13032（其基因組全序列可獲取自網站http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中的基因的啟動子。在本文中，所述基因編碼酶活性和/或表達量提高有利於提高L-賴氨酸產量的蛋白質。這些基因不限於本發明實施例和
背景技術：
部分所列的。被替換的基因的啟動子可以是一個，也可以是多個，優選是幾個，如2-6個。在本發明的具體實施方式中被替換的基因的啟動子分別有1、2、3、4個。本發明人設計改造的啟動子的關鍵在於對應於SEQIDNO：1的第51位保持為C，其第88位保持為T，因此這兩個位點保持不變後，其他位置可以有少許變化，包括添加、缺失和/或替換一個和/或幾個核苷酸。本發明的EP5啟動子的多核苷酸序列優選是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有95%（更優選97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列。通過常規的Blast和FASTA等程序，本領域技術人員可以計算出多核苷酸序列的同一性。相應地，本發明還提供了其他的應用或方法。例如，在第二方面，本發明提供了提高L-賴氨酸的發酵量的方法，其包括：（1）將棒桿菌屬細菌染色體上一個或多個基因的啟動子替換為EP5啟動子，其中，所述基因編碼酶活性和/或表達量提高有利於提高L-賴氨酸產量的蛋白質，所述EP5啟動子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述啟動子的啟動活性，並且其第50位保持為C，其第88位保持為T；和，（2）用步驟（1）改造而得到的細菌發酵生產L-賴氨酸。又如，在第三方面，本發明提供了改造獲得的細菌在發酵生產L-賴氨酸中的應用，其中，所述改造獲得是將棒桿菌屬細菌染色體上一個或多個基因的啟動子替換為EP5啟動子，其中，所述基因編碼酶活性和/或表達量提高有利於提高L-賴氨酸產量的蛋白質，所述EP5啟動子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%（優選95%，更優選97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述啟動子的啟動活性，並且其第51位保持為C，其第88位保持為T。還如，在第四方面，本發明提供了所述改造獲得是將棒桿菌屬細菌染色體上一個或多個基因的啟動子替換為EP5啟動子，其中，所述基因編碼酶活性和/或表達量提高有利於提高L-賴氨酸產量的蛋白質，所述EP5啟動子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%（優選95%，更優選97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述啟動子的啟動活性，並且其第51位保持為C，其第88位保持為T。在本文中，如無特別限定（如未以「改造獲得」來限定），術語「細菌」或「棒桿菌屬細菌」是未改造或改造前的細菌或棒桿菌屬細菌，其染色體具有野生型的啟動子。L-賴氨酸作為細菌的重要代謝產物，大多數棒桿菌屬細菌或多或少都能夠發酵產生一定量的L-賴氨酸。現有技術沒有在賴氨酸生產/發酵中關注過本發明的啟動子所對應的野生型的啟動子（如，GenBank:CP016335.1的第2531528至2531972位，等），因此現有技術中的產L-賴氨酸的棒桿菌屬細菌通常都帶有野生型的啟動子，基本上都可以採用本發明的方法進行改造，提高L-賴氨酸的發酵量。在本文中，棒桿菌屬細菌包括穀氨酸棒桿菌或北京棒桿菌，優選是穀氨酸棒桿菌。更本質地，在第五方面，本發明提供了改造細菌的方法，其包括將棒桿菌屬細菌染色體上一個或多個基因的啟動子替換為EP5啟動子，其中，所述基因編碼酶活性和/或表達量提高有利於提高L-賴氨酸產量的蛋白質，所述EP5啟動子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%（優選95%，更優選97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述啟動子的啟動活性，並且其第51位保持為C，其第88位保持為T。本發明第五方面的方法改造而獲得的細菌能夠用於發酵生產或產生L-賴氨酸。因此，在第六方面，本發明提供了本發明第五方面的方法改造而獲得的細菌。本發明第六方面的細菌是棒桿菌屬細菌，其染色體上編碼一個或多個野生型啟動子的基因座位的核苷酸序列被替換為本發明的EP5啟動子的核苷酸序列。在第七方面，本發明提供了EP5啟動子，其多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%（優選95%，更優選97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述啟動子的啟動活性，並且其第51位保持為C，其第88位保持為T。在第八方面，本發明提供了表達盒，其包含本發明第七方面的啟動子和可操縱連接在所述啟動子後的編碼序列。在本文中，可操縱連接指的是編碼序列功能地連接啟動子，通常連接在啟動子的3』端，使得啟動子序列可以起始或者介導編碼序列的轉錄。在第九方面，本發明提供了載體，其包含本發明第七方面的啟動子和可操縱連接在所述啟動子後的編碼序列。載體優選是表達載體。在第十方面，本發明提供了宿主細胞，其包含本發明第八方面的表達盒或本發明第九方面的載體，或者是經本發明第八方面的表達盒或本發明第九方面的載體轉化而得的。本發明的宿主細胞包含EP5啟動子。優選宿主細胞是棒桿菌屬細菌，如穀氨酸棒桿菌。在第十一方面，本發明提供了本發明第七方面的啟動子在發酵生產L-賴氨酸或者提高L-賴氨酸的發酵量中的應用，優選在棒桿菌屬細菌中發酵生產L-賴氨酸或者提高L-賴氨酸的發酵量中的應用。本發明的有益效果在於，開闢並且實踐證明了新的提高L-賴氨酸的發酵量的方式，而且與現有改造的大量高產L-賴氨酸的棒桿菌屬細菌的染色體改造位點沒有衝突，從而在實踐上可用於進一步提高L-賴氨酸的產量。為了便於理解，以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，並不構成對本發明範圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重複敘述過一樣。具體實施方式以下通過實施例進一步說明本發明的內容。如未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實驗指南（第3版）》（科學出版社）、《微生物學實驗（第4版）》（高等教育出版社）以及相應儀器和試劑的廠商說明書等參考。實施例1本發明的啟動子根據本發明人設計的多核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的啟動子，委託合成相應的多核苷酸並連接入pMD19-T載體，獲得的新載體為T-EP5，進行測序（委託上海英俊公司測序），測序結果如下：GTAACCCGAGGTTAAGTGTATTTTAGGTGAACAAATTTCAGCTTCGGGTAGAAGACcTTCGATGCGCTTCAGAGCTTCTATTGGGAAATCTGAtACCACTTGATTAAATAGCCTACCCCCGAATTGGGGGATTGGTCATTTTTTGCTGTGAAGGTAGTTTTGATGCATATGACCTGCGTTTATAAAGAAAGTAAACGTGATCAGATCGATATAAAAGAAACAGTTTGTACTCAGGTTTGAAGCATTTTCTCCGATTCGCCTGGCAAAAATCTCAATTGTCGCTTACAGTTTTTCTCAACGACAGGCTGCTAAGCTGCTAGTTCGGTGGCCTAGTGAGTGGCGTTTACTTGGATAAAAGTAATCCCATGTCGTGATCAGCCATTTTGGGTTGTTTCCATAGCAATCCAAAGGTTTCGTCTTTCGATACCTATTCAAGGAGCCTTCGCCTCT測序結果包含了如SEQIDNO：1所示的啟動子，表明克隆正確。相對於野生型的啟動子，本發明人設計的啟動子序列主要設計了T->C和C->T的兩個突變（用小寫表示），SEQIDNO：1所示的啟動子在下文被簡稱為EP5。實施例2EP5啟動子調節ddh基因表達的構建實驗根據已上述EP5的序列及NCBI上公布的穀氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組序列設計引物，用於將EP5片段插入到ddh基因起始密碼子ATG的前端，使得EP5來驅動ddh基因的表達，具體引物設計如下：P15：5'GCTCTAGACGTAGCCAACGAAGTAATC3'（xba1）P16：5'CTATTCAAGGAGCCTTCGCCTCTATGACCAACATCCGCGTAGCTATC3'P17:CTAAAATACACTTAACCTCGGGTTACGTTCTTGTAATCCTCCAAAATTGP18:CAATTTTGGAGGATTACAAGAACGTAACCCGAGGTTAAGTGTATTTTAGP19:5'CTAAAATACACTTAACCTCGGGTTACATGATGATTCAGGGACATCT3'P20:5'CGGAATTCTTTCGGGCGGCAATATAG3'（EcoR1）以穀氨酸棒桿菌ATCC13032為模板，分別以引物P15/P16及P19/P20，進行PCR擴增，獲得上遊同源臂片段700bp及下遊同源臂片段650bp，再用引物P17/P18以T-EP5為模板擴增EP5片段450bp，再以P15/P20為引物，以以上擴增的三個片段混合為模板進行擴增，獲得整個同源臂片段，兩端分別含有Xba1和EcoR1酶切位點。PCR反應結束後，對擴增的產物進行電泳回收，採用柱式DNA凝膠回收試劑盒進行回收所需要的1800bp的DNA片段，並通過酶切回收連接，與穿梭質粒pk18mobsacB質粒相連接，獲得整合質粒。該質粒上含有卡納抗性標記，可以通過卡納篩選獲得質粒整合到基因組上的重組子。將整合質粒電轉化入賴氨酸生產專利菌株YP97158菌株（其構建方法可參見WO2014121669A1，經測序確認該菌株染色體上保留有野生型的ddh基因的啟動子），對培養產生的單菌落通過P17/P20引物進行PCR鑑定，PCR擴增出含有大小1100bp的片段的為陽性菌株，擴增不到片段的為原菌。陽性菌株分別在含有卡那黴素和不含卡那黴素的培養基上培養，在不含卡那黴素的培養基上生長，而在含卡那黴素的培養基上不生長的菌株進一步採用P17/P20引物進行PCR鑑定，擴增出大小為1100bp的菌為EP5整合到ddh基因起始密碼子前的菌株，其被命名為YPL-1-004。實施例3EP5啟動子調節lysC基因表達的構建實驗根據已上述EP5的序列及NCBI上公布的穀氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組序列設計引物，用於將EP5片段插入到lysC基因起始密碼子CTG的前端，使得EP5來驅動lysC基因的表達，具體引物設計如下：P3:5'CGGAATTCCCGCAAGCAGCCACATTC3'（EcoR1）P4:5'CTAAAATACACTTAACCTCGGGTTACCTTTGTGCACCTTTCGATCTAC3'P5:5'GTAGATCGAAAGGTGCACAAAGGTAACCCGAGGTTAAGTGTATTTTAG3'P6:5'CATATTTCTGTACGACCAGGGCCAGAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAG3'P7:5'CTATTCAAGGAGCCTTCGCCTCTCTGGCCCTGGTCGTACAGAAATATG3'P8:5'CCCAAGCTTGTGGTGCCGTCTTCTACAG3'（Hind3）以穀氨酸棒桿菌ATCC13032為模板，分別以引物P3/P4及P7/P8，進行PCR擴增，獲得上遊同源臂片段740bp及下遊同源臂片段940bp，再用引物P5/P6以T-EP5為模板擴增EP5片段450bp，再以P3/P8為引物，以以上擴增的三個片段混合為模板進行擴增，獲得整個同源臂片段，兩端分別含有Hind3和EcoR1酶切位點。PCR反應結束後，對擴增的產物進行電泳回收，採用柱式DNA凝膠回收試劑盒進行回收所需要的2140bp的DNA片段，並通過酶切回收連接，與穿梭質粒pk18mobsacB質粒相連接，獲得整合質粒。該質粒上含有卡納抗性標記，可以通過卡納篩選獲得質粒整合到基因組上的重組子。將整合質粒電轉化入YPL-1-004（經測序確認該菌株染色體上保留有野生型的lysC基因的啟動子），對培養產生的單菌落通過P5/P8引物進行PCR鑑定，PCR擴增出含有大小1400bp的片段的為陽性菌株，擴增不到片段的為原菌。陽性菌株分別在含有卡那黴素和不含卡那黴素的培養基上培養，在不含卡那黴素的培養基上生長，而在含卡那黴素的培養基上不生長的菌株進一步採用P5/P8引物進行PCR鑑定，擴增出大小為1400bp的菌為EP5整合到lysC基因起始密碼子前的菌株，其被命名為YPL-1-005。實施例4EP5啟動子調節lysA基因表達的構建實驗根據已上述EP5的序列及NCBI上公布的穀氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組序列設計引物，用於將EP5片段插入到lysA基因起始密碼子ATG的前端，使得EP5來驅動lysA基因的表達，具體引物設計如下：P9：5'CGGAATTCCGAGGTAGGTTCCGTAGG3'（EcoR1）P10：5'CTAAAATACACTTAACCTCGGGTTACGGGGAGAAATTCTAGCCGAGG3'P11：5'CCTCGGCTAGAATTTCTCCCCGTAACCCGAGGTTAAGTGTATTTTAG3'P12：5'GTTGCGAGATCAGCTGGTGTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAG3'P13：5'CTATTCAAGGAGCCTTCGCCTCTATGACACCAGCTGATCTCGCAAC3'P14：5'CCCAAGCTTGCCCTCGTTTTCGTACAG3'（Hind3）以穀氨酸棒桿菌ATCC13032為模板，分別以引物P9/P10及P13/P14，進行PCR擴增，獲得上遊同源臂片段750bp及下遊同源臂片段850bp，再用引物P11/P12以T-EP5為模板擴增EP5片段450bp，再以P9/P14為引物，以以上擴增的三個片段混合為模板進行擴增，獲得整個同源臂片段，兩端分別含有Hind3和EcoR1酶切位點。PCR反應結束後，對擴增的產物進行電泳回收，採用柱式DNA凝膠回收試劑盒進行回收所需要的2050bp的DNA片段，並通過酶切回收連接，與穿梭質粒pk18mobsacB質粒相連接，獲得整合質粒。該質粒上含有卡納抗性標記，可以通過卡納篩選獲得質粒整合到基因組上的重組子。將整合質粒電轉化入YPL-1-005（經測序確認該菌株染色體上保留有野生型的lysA基因的啟動子），對培養產生的單菌落通過P11/P14引物進行PCR鑑定，PCR擴增出含有大小1300bp的片段的為陽性菌株，擴增不到片段的為原菌。陽性菌株分別在含有卡那黴素和不含卡那黴素的培養基上培養，在不含卡那黴素的培養基上生長，而在含卡那黴素的培養基上不生長的菌株進一步採用P11/P14引物進行PCR鑑定，擴增出大小為1300bp的菌為EP5整合到lysA基因起始密碼子前的菌株，其被命名為YPL-1-006。實施例5EP5啟動子調節gnd基因表達的構建實驗根據已上述EP5的序列及NCBI上公布的穀氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組序列設計引物，用於將EP5片段插入到gnd基因起始密碼子ATG的前端，使得EP5來驅動gnd基因的表達，具體引物設計如下：P21：5'CCCAAGCTTTCGCCTGCGTTCCATTCC3'（Hind3）P22:CTATTCAAGGAGCCTTCGCCTCTATGCCGTCAAGTACGATCAATAACP23:GTTATTGATCGTACTTGACGGCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAGP24:CGATTTTGCTGACACCGGGCTGTAACCCGAGGTTAAGTGTATTTTAGP25:CTAAAATACACTTAACCTCGGGTTACAGCCCGGTGTCAGCAAAATCGP26：5'CGGAATTCTGCGCTGGGTTGTTATCTG3'（EcoR1）以穀氨酸棒桿菌ATCC13032為模板，分別以引物P21/P22及P25/P26，進行PCR擴增，獲得上遊同源臂片段720bp及下遊同源臂片段700bp，再用引物P23/P24以T-EP5為模板擴增EP5片段450bp，再以P21/P26為引物，以以上擴增的三個片段混合為模板進行擴增，獲得整個同源臂片段，兩端分別含有Hind3和EcoR1酶切位點。PCR反應結束後，對擴增的產物進行電泳回收，採用柱式DNA凝膠回收試劑盒進行回收所需要的1870bp的DNA片段，並通過酶切回收連接，與穿梭質粒pk18mobsacB質粒相連接，獲得整合質粒。該質粒上含有卡納抗性標記，可以通過卡納篩選獲得質粒整合到基因組上的重組子。將整合質粒電轉化入YPL-1-006（經測序確認該菌株染色體上保留有野生型的gnd基因的啟動子），對培養產生的單菌落通過P23/P26引物進行PCR鑑定，PCR擴增出含有大小1150bp的片段的為陽性菌株，擴增不到片段的為原菌。陽性菌株分別在含有卡那黴素和不含卡那黴素的培養基上培養，在不含卡那黴素的培養基上生長，而在含卡那黴素的培養基上不生長的菌株進一步採用P23/P26引物進行PCR鑑定，擴增出大小為1150bp的菌為EP5整合到gnd基因起始密碼子前的菌株，其被命名為YPL-1-007。實施例6賴氨酸發酵實驗將實施例2-5構建的菌株和原始菌株在BLBIO-5GC-4-H型號的發酵罐（購自上海百侖生物科技有限公司）中以表1所示的培養基和表2所示的過程進行發酵實驗。每個菌株重複三次，結果如表3所示。表1發酵培養基配方品名配比澱粉水解糖30g/l硫酸銨12g/L硫酸鎂0.87g/l糖蜜20g/l酸化玉米漿3ml/l磷酸0.4ml/l氯化鉀0.53g/l消泡劑（2%泡敵）4ml/L硫酸亞鐵120mg/l硫酸錳120mg/l煙醯胺42mg/l泛酸鈣6.3mg/lVB16.3mg/l銅、鋅鹽溶液0.6g/L生物素0.88mg/L表2發酵過程表3賴氨酸發酵實驗結果(賴氨酸含量g/dl)批次\菌株對照YPL-1-004YPL-1-005YPL01-006YPL01-00712223.524.124.925.7222.223.424.024.825.6322.123.424.124.925.8均值22.123.424.124.925.7結果如表3所示，在棒桿菌中將EP5啟動子構建在表達量升高對L-賴氨酸產量有利的基因前調控它們的表達，基本都有助於L-賴氨酸產量的提高，而且EP5啟動子構建得越多，L-賴氨酸的產量增加得也基本越多，表明存在疊加效應。寧夏伊品生物科技股份有限公司棒桿菌發酵生產L-賴氨酸的方法及其啟動子改造CN1PatentInversion3.51445DNAArtificialSequence啟動子1cgaggttaagtgtattttaggtgaacaaatttcagcttcgggtagaagaccttcgatgcg60cttcagagcttctattgggaaatctgataccacttgattaaatagcctacccccgaattg120ggggattggtcattttttgctgtgaaggtagttttgatgcatatgacctgcgtttataaa180gaaatgtaaacgtgatcagatcgatataaaagaaacagtttgtactcaggtttgaagcat240tttctccgattcgcctggcaaaaatctcaattgtcgcttacagtttttctcaacgacagg300ctgctaagctgctagttcggtggcctagtgagtggcgtttacttggataaaagtaatccc360atgtcgtgatcagccattttgggttgtttccatagcaatccaaaggtttcgtctttcgat420acctattcaaggagccttcgcctct445當前第1頁1 2 3