1,2,3,4,6-五-O-沒食子醯基-b-D-葡萄糖的用途的製作方法

2023-04-30 14:18:01

專利名稱：1,2,3,4,6-五-O-沒食子醯基-b-D-葡萄糖的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及l， 2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖作為製備抗單 純皰疹病毒的藥物的用途，特別涉及其作為製備抗單純皰疹l型病毒的藥物 的用途，屬於藥品領域。
背景技術：
1,2,3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖從餘甘子〃朋Aw emMca L.)的枝葉中提取而得。餘甘子(屍/^〃a"A^ L.)來源於大戟科
@1^1101^&06&6)葉下珠屬植物(屍/^//朋^^)的成熟果實，又名滇橄欖、油柑，
廣泛分布於西亞、北非、印度南部以及東南亞各地。我國西南至東南沿海地 區均有分布。在我國的中草藥、藏藥、蒙藥、傣藥、維吾爾藥等民族藥體系 以及印度壽命吠陀傳統藥物體系中，均具有十分悠久的用藥史。 單純皰疹病毒屬a亞科，分單純皰疹病毒1型和2型，是最早發現的皰疹類 病毒。單純皰疹病毒1型引起唇皰疹、皰疹性角膜炎等。單純皰疹原發感染 愈後病毒基因潛伏於神經節，當機體抵抗力低下時，病毒基因被激活並開始 繁殖，病情反覆發作。
單純皰疹病毒(HSV)為典型皰疹病毒形態，球形，有包膜，顆粒直徑 120-150nm，內有核衣殼，直徑100-110nm，包膜和核衣殼之間有無定形纖 維組織皮質層，內有核心，核心內有病毒DNA和蛋白質。
單純皰疹病毒在全球廣泛分布，人類是唯一的宿主。感染主要通過人群 與易感者之間的密切接觸，無季節差異。機體感染病毒後可產生抗體，抗體 不能清除病毒，但可作為了解HSV感染流行病學的指標。
單純皰疹病毒感染在人群中廣泛存在，初次原發感染絕大多數形成隱性 感染，無臨床症狀，感染後產生中和抗體，60%-90%的人群中抗體檢測為陽 性，但不能清除病毒。少數感染者出現黏膜、皮膚復發性皰疹病灶，新生兒 或免疫力低下者感染後可發展為皰疹性腦炎或全身性感染。唇皰疹為單純皰 疹病毒l型(HSV-1)常見的皮膚感染，局部出現皰疹病灶， 一般自愈，可復發。也可引起皮膚皰疹、溼疹。眼角膜炎為單純皰疹病毒常見的黏膜感染， 單純皰疹病毒1型感染引起角膜炎，發病率較高。原發性感染多為急性樹枝 狀角膜炎，愈後經常反覆發作，病變深入角膜基層組織，發展為角膜潰瘍， 影響視力，甚至導致失明，發作病程長達數月。新生兒或免疫力低下者感染 皰疹病毒，可侵染神經系統，引發腦炎，病情嚴重、未治療病人病死率高達
70%,治療後也多發生後遺症。嚴重者可引起全身性單純皰疹病毒感染，病 死率極高。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術存在的缺點和不足，提供了l， 2， 3， 4， 6陽五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖(1， 2， 3， 4， 6-penta-0-galloyl-卩-D-glucose)
作為製備抗單純皰疹病毒的藥物的用途。
本發明的目的通過下述技術方案實現1， 2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基 -b-D-葡萄糖作為製備抗單純皰疹病毒的藥物的用途。
所述抗單純皰疹病毒的藥物是抗單純皰疹病毒1型的藥物。 所述抗單純皰疹病毒的藥物含有治療有效量的1， 2， 3， 4， 6-五-0-沒 食子醯基-b-D-葡萄糖和藥學上可接受的載體。
所述抗單純皰疹病毒的藥物製成片劑、膠囊、口服液、針劑或粉針劑。 本發明相對於現有技術，具有如下的優點及有益效果(1)本發明以單 純皰疹病毒l型(HSV-1)毒株和人胚肺成纖維細胞(MRC-5)細胞為實驗 對象，觀察1， 2， 3, 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖抗單純皰疹病毒1 型的活性，確定了l， 2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖對HSV-l感 染的細胞具有預防和治療作用，還可以降低對MRC-5細胞的感染性，明確 了 1， 2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖對HSV-l具有直接殺傷作用， 使HSV-1感染MRC-5細胞的活性下降；(2)將l， 2， 3， 4， 6-五-0-沒食 子醯基-b-D-葡萄糖用於製備抗單純皰疹病毒1型的藥物，在安全劑量範圍 內，對單純皰疹病毒1型的抑制率高；預防單純皰疹病毒1型感染的作用強； 愈後快，可以減輕感染病人的綜合症狀；藥物毒性小，穩定性好，具有重要 的開發與應用前景。


圖1是正常細胞對照組的顯微鏡圖(10xl0倍)。圖2是病毒對照組的顯微鏡圖(10xl0倍)。圖3是本發明的藥物組的顯微鏡圖(10x10倍)。圖4是陽性對照藥物ACV組的顯微鏡圖(10x10倍)。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
實驗材料的說明如下
1、 器材進口 24孔培養板(平底)；倒置顯微鏡；C02細胞培養箱；微量可調加樣器；培養基為MEM (含青黴素、鏈黴素雙抗各250U/ml)，除菌過濾前用碳酸氫鈉調pH至7.0-7.2 ;小牛血清經56°C 30min滅活補體，除菌分裝；消化液為5X胰蛋白酶5ml+0.01mol/L (pH7.2) PBS93ml，除
菌分裝，低溫保存。
2、 病毒和細胞株
單純皰疹病毒1型毒株是來源於美國ATCC(VR733)，引自武漢病毒所。MRC-5細胞購於購自中國科學院細胞庫，由申請人所在的實驗室保存。MRC-5細胞系來自14周齡男性胎兒的正常肺組織，是正常二倍體細胞系，是皰疹病毒敏感細胞。MRC-5細胞用含10%胎牛血清的MEM培養基連續傳代3次保持在對數生長期，供實驗用，維持液為含2%小牛血清的MEMi首養基。
3、 藥物
將10mgl， 2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖先加入100plDMSO(二甲基亞碸)溶解後配成藥物儲存液，-20°0保存備用。陽性對照藥無環鳥苷(ACV)為湖北科益藥業股份有限公司產品，臨用前用MEM維持液稀釋。
實施例1
藥物稀釋將藥物儲存液用MEM維持液稀釋，倍比稀釋為20)Lig/ml，
510^g/ml， 5pg/ml， 2.5pg/ml， 1.25pg/ml。
陽性對照藥物ACV稀釋將10mg ACV樣品溶於100nl去離子水配製藥物母液，4"C長期保存，使用時用MEM維持液稀釋，稀釋為20pg/ml，10嗎/ml， 5嗎/ml， 2.5嗎/ml， 1.25pg/ml。
分別將20貼/ml， 10pg/ml， 5|tig/ml， 2.5|ng/ml， 1.25嗎/ml的1,2,3,4,6-五-O-沒食子醯基-b-D-葡萄糖維持液和20pg/ml， 10pg/ml， 5pg/ml， 2.5pg/ml，1.25pg/ml的ACV維持液以100^1/孔的量加到單層MRC-5細胞的孔中，每個濃度設4個復孔，培養2小時後，接種100TCID50 (病毒感染力滴度)HSV-1病毒液100pl/ L，置於5%C02細胞培養箱繼續培養2小時，病毒完全吸附到細胞後，加入由2倍的MEM維持液和1%羧甲基纖維素以1 : 1的比例配成的完全覆蓋液800|iil，培養72小時，觀察藥物處理後的細胞對HSV-1感染的影響，同時設定病毒對照組、正常細胞對照組，實驗重複3次。試驗分析方法
72小時後，病毒對照組的細胞不再出現空斑時，棄去維持液，以10%甲醛溶液固定30分鐘，然後用5%結晶紫溶液染色後作空斑計數，計算空斑抑制率。
空斑抑制率(％)=(病毒對照組空斑數-藥物處理組空斑數)/病毒對照組空斑數xl00^
計算IC50 (半數抑制濃度)，計算方法為加權直線回歸法，從而估測1，2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖對HSV-l的感染有無預防作用。
結果顯示1, 2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖藥物對預防HSV-l感染的半數有效劑量(IC50)為2.104pg/ml。可見1， 2， 3, 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖對HSV-1感染的細胞具有預防作用。
實施例2
1， 2， 3， 4, 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖藥物和陽性對照藥物ACV
的稀釋方法同實施例1。
先接種100TCID50的HSV-1於24孔板的單層MRC-5細胞上，在37°C、C02細胞培養箱吸附2小時，再將20ing/ml， 10嗎/ml， 5(ag/ml， 2.5pg/ml，1.25pg/ml的1，2,3，4，6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖維持液和20pg/ml，10|tig/ml， 5嗎/ml， 2.5昭/ml， 1.25嗎/ml ACV維持液以100^1/孔的量加到單層MRC-5細胞的孔中，每個濃度設4個復孔，置於5XC02細胞培養箱繼續培養72小時，觀察空斑形成的情況。同時設病毒對照組、正常細胞對照組，實驗重複3次。試驗分析方法
統計不同的藥物濃度作用下的空斑形成數目，計算IC50。結果顯示1， 2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖藥物對預防HSV-1感染的半數有效劑量(IC50)為1.600嗎/ml。可見1， 2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖對HSV-1感染的細胞具有治療作用。
實施例3
1， 2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖藥物和陽性對照藥物ACV
的稀釋方法同實施例1。
分別將20嗎/ml， 10嗎/ml， 5pg/ml， 2.5pg/ml， 1.25ng/ml的1,2,3,4，6-五-O-沒食子醯基-b-D-葡萄糖維持液和HSV-1存儲液各lOOpl混合後，以200-孔的量加到24孔板單層MRC-5細胞上，每個濃度設定4個復孔，置於5%C02細胞培養箱培養72小時，觀察藥物對HSV-1感染細胞的綜合作用。同時設病毒對照組、正常細胞對照組，實驗重複3次。
試驗分析方法
統計各藥物濃度作用下的空斑形成數，計算IC50。
結果顯示1， 2, 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖藥物對預防HSV-1感染的半數有效劑量(IC50)為:5.340—1。可見1, 2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖可降低HSV-1對MRC-5細胞的感染性。
實施例4
1， 2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖藥物和陽性對照藥物ACV
的稀釋方法同實施例1。
分別將20嗎/ml， 10pg/ml， 5|iig/ml， 2.5|iig/ml， 1.25|ug/ml的1， 2， 3， 4，6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖維持液和HSV-1存儲液各lOOpl混合後，置37"C培養箱培養2小時後，將此混合液以200^0/孔的量加入單層MRC-5細胞孔中，37°C、 5XC02細胞培養箱培養72小時，觀察藥物對HSV-1的直接殺傷作用。同時設病毒對照組、正常細胞對照組和同樣在37°C、 5%(302細胞培養箱中放置2小時的病毒對照組，實驗重複3次。試驗分析方法
統計各藥物濃度的空斑數，計算IC50。
結果顯示1， 2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖藥物對預防HSV-l感染的半數有效劑量(IC50)為為1.302pg/ml。可見1, 2， 3， 4， 6-五-O-沒食子醯基-b-D-葡萄糖對HSV-1具有直接殺傷作用，使HSV-1感染的MRC-5細胞的活性下降。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1、1，2，3，4，6-五-O-沒食子醯基-b-D-葡萄糖作為製備抗單純皰疹病毒的藥物的用途。
2、 根據權利要求1所述的用途，其特徵在於所述抗單純皰疹病毒的 藥物是抗單純皰疹病毒1型的藥物。
3、 根據權利要求1所述的用途，其特徵在於所述抗單純皰疹病毒的 藥物含有治療有效量的1， 2， 3， 4， 6-五-0-沒食子醯基-b-D-葡萄糖和藥學 上可接受的載體。
4、 根據權利要求1所述的用途，其特徵在於所述抗單純皰疹病毒的 藥物製成片劑、膠囊、口服液、針劑或粉針劑。
全文摘要
本發明提供了1，2，3，4，6-五-O-沒食子醯基-b-D-葡萄糖作為製備抗單純皰疹病毒的藥物的用途，特別涉及其作為製備抗單純皰疹1型病毒的藥物的用途。1，2，3，4，6-五-O-沒食子醯基-b-D-葡萄糖對HSV-1感染的細胞具有預防和治療作用，還可以降低對MRC-5細胞的感染性，對HSV-1具有直接殺傷作用，可以使HSV-1感染MRC-5細胞的活性下降；以其為有效成分製備的抗單純皰疹病毒1型藥物，在安全劑量範圍內，對單純皰疹病毒1型的抑制率高；預防單純皰疹病毒1型感染的作用強；愈後快，可以減輕感染病人的綜合症狀；藥物毒性小，穩定性好。
文檔編號A61K31/7024GK101461817SQ20081022068
公開日2009年6月24日 申請日期2008年12月31日 優先權日2008年12月31日
發明者青 劉, 北裏海雄, 張美英, 張穎君, 楊崇仁, 王一飛, 贏 裴, 錢垂文 申請人:暨南大學