ATP核酸適配體、利用納米金顯色檢測ATP的方法及試劑盒與流程
2023-04-30 04:23:41
本發明涉及生物檢測技術領域，更具體地，涉及atp核酸適配體、利用納米金顯色檢測atp的方法及試劑盒。
背景技術：
atp作為所有生物體生存和繁殖的細胞合成中必不可少的普遍能量來源，在機體代謝過程中扮演著非常重要的角色。研究表明atp可以作為細胞存活率和細胞損傷的指示劑。atp在細胞中的異常濃度和許多疾病，比如腫瘤，心血管疾病，帕金森症候群等有著密切的聯繫。因此，對atp快速準確的檢測在臨床應用上有著重大的意義。
目前已有的atp的檢測方法主要包括hplc法、螢光素/螢光素酶法以及電泳法。這些方法的靈敏度和特異性都很好，但是需要昂貴的儀器和繁瑣的操作步驟，並且耗時耗力。
核酸適配體(aptamer)是一段dna，rna或者是xna序列。通常是利用體外篩選技術-指數富集的配體系統進化技術(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)，從核酸分子文庫中得到的寡核苷酸片段。核酸適配體能與多種目標物質高特異性、高選擇性地結合，因此被廣泛應用於生物傳感器領域。相對於傳統的抗原-抗體反應，核酸適配體更容易合成，更穩定，成本更低，而且擁有與抗原-抗體反應相匹敵的特異性和靈敏度。這些優勢使核酸適配體成為了各種化學分子探測的有力武器。基於核酸適配體的生物傳感器受到了人們越來越多的關注和研究應用。這些生物傳感器主要分為：螢光法、電化學法、化學發光法以及比色法。其中比色法相對於其它方法有許多優勢，比如成本低，操作簡單，結果容易讀取等。在未來的分析檢測領域甚至臨床應用方面有著很好的前景。
納米金是指金的微小顆粒，其直徑在1-100nm，其顏色依直徑大小而呈紅色至紫色。由於其特殊的物理化學性質，比如高消光係數、強大的距離相關的光學性質、低成本等，使其在比色法的檢測手段中作為信號顯示劑非常具有競爭力。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種操作簡單、靈敏度高、特異性好、成本低的atp檢測方法。
根據本發明的第一方面，本發明提供一種atp核酸適配體(或稱dna探針)，該atp核酸適配體具有如seqidno：1所示鹼基序列。5』-accttcctgggggagtattgcggaggaaggt-3』(seqidno：1)。
通過對atp核酸適配體序列的優化，能夠提高檢測的特異性和靈敏度。
根據本發明的第二方面，本發明提供一種利用納米金顯色檢測atp的方法，該方法包括以下步驟：
(1)使含有atp的待測溶液與含有上述的atp核酸適配體的檢測溶液混合；
(2)將步驟(1)得到的混合液與納米金溶液混合，然後加入鹽溶液並混勻；
(3)儀器檢測或觀測步驟(2)得到的混合溶液。
優選地，步驟(1)中，含有atp的待測溶液中的atp與含有atp核酸適配體的檢測溶液中的atp核酸適配體的摩爾比為1：1-1000，優選為1：50-200。
優選地，步驟(1)中，含有atp核酸適配體的檢測溶液中atp核酸適配體的濃度為0.1μm-10μm，含有atp適配子的檢測溶液優選為tris-hcl緩衝液。
優選地，步驟(2)中，步驟(1)得到的混合液中的atp核酸適配體與納米金溶液中的納米金顆粒的摩爾比為1：0.001-0.01。
優選地，步驟(2)中，所述鹽溶液的加入量使得步驟(2)得到的混合溶液中鹽的終濃度為10-100mm；所述鹽溶液優選為無機鹽溶液，進一步優選為氯化鈉溶液。
上述優選範圍內的各組分用量能夠進一步提高檢測的靈敏度。
步驟(1)中混合後可適當放置1-5分鐘，以使結合更充分。步驟(2)中加入鹽溶液後優選迅速混勻。
根據本發明，所述納米金溶液中納米金顆粒的粒徑優選為10-20nm，最優選為14nm。
根據本發明的第三方面，本發明提供一種利用納米金顯色檢測atp的試劑盒，該試劑盒包括以下組成：
1)含有上述的atp核酸適配體的檢測溶液；
2)鹽溶液；
3)納米金溶液。
優選地，含有atp核酸適配體的檢測溶液中atp核酸適配體的濃度為0.1μm-10μm，含有atp適配子的檢測溶液優選為tris-hcl緩衝液。
優選地，所述鹽溶液為氯化無機鹽溶液，進一步優選為氯化鈉溶液；所述鹽溶液的濃度優選為1-2m。
優選地，所述納米金溶液中納米金顆粒的粒徑優選為10-20nm，最優選為14nm，所述納米金溶液中納米金顆粒的濃度優選為0.5-5nm。
根據本發明，所述納米金溶液可以通過本領域常規的方法製備得到，該方法已為本領域技術人員公知。例如檸檬酸鈉還原法：將5ml檸檬酸鈉溶液(1wt％)加入到正在沸騰的金氯酸溶液中，迅速混勻，反應液的顏色變為紅色以後，再回流20分鐘。然後將上述反應液置於冰上冷卻，最後置於4度保存。所述納米金溶液通常為納米金顆粒的檸檬酸鈉緩衝溶液。
本發明的方法基於以下原理：如圖1所示，本發明的檢測體系中包含一個以atp核酸適配體(藍色dna鏈)作為待檢測物的識別器的發卡結構的dna探針，以及納米金作為信號顯示劑。在沒有待檢測物atp的時候，該dna探針不能吸附在納米金上，因此，在溶液鹽的濃度升高時，納米金髮生聚集，從紅色變為藍色。在atp存在的時候，atp與其核酸適配體相結合，暴露出一段dna單鏈(紅色dna鏈)，此段單鏈可以通過靜電作用與納米金相結合，從而使納米金在高濃度鹽溶液裡更加穩定，溶液顏色保持紅色或者紫色的狀態。根據此原理，溶液中atp的含量越高，溶液越趨近於紅色。因此，通過肉眼觀測溶液的顏色變化，可以對atp的含量進行定性檢測。
此外，也可以利用紫外可見分光光度計，通過製作標準曲線的方式，實現對atp的定量檢測。
利用本發明的方法對atp進行測定，不需要任何化學修飾，沒有複雜的反應過程，也不需要昂貴的儀器，甚至可以通過肉眼觀測，操作簡便，成本低。該方法檢測時間短(5分鐘)，靈敏度高，特異性好。
本發明的其它特徵和優點將在隨後具體實施方式部分予以詳細說明。
附圖說明
通過結合附圖對本發明示例性實施方式進行更詳細的描述。
圖1示出了本發明的檢測原理。
圖2示出了納米金在不同溶液中的紫外吸收光譜和相對應的顏色狀態。
圖3a和圖3b分別示出了納米金在有無atp存在時不同的分散狀態。
圖4a示出了納米金在不同濃度atp存在時的顏色變化。圖4b示出了納米金在不同濃度atp存在時的紫外吸收光譜。圖4c示出了在不同濃度atp的存在下，納米金的紫外吸收光譜峰的比值(a522/a656)，內插圖為atp濃度在0-5μm時金的紫外吸收光譜峰的比值(a522/a656)的標準校準曲線。
圖5示出了納米金在atp以及其類似物(gtp、utp、ctp)存在下的紫外吸收光譜和相對應的溶液顏色。
具體實施方式
下面將參照附圖更詳細地描述本發明的優選實施方式。
實施例1
試劑盒組成
a)檢測溶液：20mmtris-hcl緩衝液(100mmnacl,5mmmgcl2,ph7.4)(內含具有seqidno：1所示序列的dna探針：1μm)
b)nacl溶液(1.6m)
c)納米金檸檬酸鈉緩衝溶液(14nm，濃度為1nm)
含有atp的待測溶液
atp水溶液，其中atp濃度為10μm。
驗證實驗
圖2示出了納米金在不同溶液中的紫外吸收光譜和相對應的顏色狀態，其中納米金檸檬酸鈉溶液的用量為190μl，含有atp的待測溶液的用量為5μl，nacl的用量為5μl，dna探針的用量為5μl。
其中，a：納米金+nacl；b：納米金+atp+nacl；c：納米金+dna探針+nacl；d：納米金+atp+dna探針+nacl。如圖2所示，當納米金溶液裡只含有鹽(a)、atp和鹽(b)、dna探針和鹽(c)的時候都不穩定，會發生聚集，從而在紫外吸收光譜中656nm處出現一個高的吸收峰，相應的溶液顏色呈現藍色。當atp、dna探針、鹽同時存在的時候，atp可以使dna探針的構型發生改變，進而吸附在納米金上，使其在高鹽狀態下保持穩定的單分散狀態。在紫外吸收光譜中522nm處出現一個高的吸收峰，相應的溶液呈現紅色。這些實驗現象和圖1所示檢測原理相符，有力地證明了本發明方法的可行性。
圖3a和圖3b分別示出了納米金在有無atp存在時不同的分散狀態。如圖3a所示，納米金在沒有atp存在的檢測液裡，不能穩定分散而發生聚集。在有atp存在的檢測液裡，穩定的保持原有的單分散的狀態(如圖3b所示)。這一實驗結果又進一步證明了該技術方案的可行性。
檢測步驟
(1)將5μl含有atp的待測溶液與5μl檢測溶液充分混勻；
(2)取10μl步驟(1)得到的反應液，加入到190μl納米金溶液中，再加入5μlnacl溶液，迅速混勻；
(3)用紫外可見分光光度計讀取結果，或者直接使用肉眼讀取結果。
檢測結果
圖4a示出了納米金在不同濃度atp存在時的顏色變化。圖4b示出了納米金在不同濃度atp存在時的紫外吸收光譜。圖4c示出了在不同濃度atp的存在下，納米金的紫外吸收光譜峰的比值(a522/a656)，內插圖為atp濃度在0-5μm時金的紫外吸收光譜峰的比值(a522/a656)的標準校準曲線。
如圖4a-圖4c所示，納米金隨著atp濃度的升高逐漸從藍色變為紅色(a)，相應的紫外吸收光譜在656nm處的峰值逐漸降低，在522nm處的峰值逐漸升高(b)。納米金的紫外吸收光譜峰的比值(a522/a656)隨著atp濃度的升高而逐漸升高，最後達到平衡(c)。atp濃度在0-5μm時金的紫外吸收光譜峰的比值(a522/a656)可以畫出標準校準曲線(c插圖)，該線性回歸方程為：a522/a656＝0.1239[catp]+0.8367(線性相關係數：0.9989)，通過計算得出該方法對atp的檢測限為0.1μm，說明本發明方法的靈敏度極高。
圖5示出了納米金在atp以及其類似物(gtp、utp、ctp)存在下的紫外吸收光譜和相對應的溶液顏色。
如圖5所示，納米金在atp的類似物(gtp、utp、ctp)的存在下，紫外吸收光譜在656nm處有高峰值，相對應的溶液顏色為藍色。只有在atp的存在下，紫外吸收光譜在522nm處有高峰值，溶液顏色為紅色。這一實驗現象證明了該技術方案具有很高的特異性。
以上已經描述了本發明的各實施例，上述說明是示例性的，並非窮盡性的，並且也不限於所披露的各實施例。在不偏離所說明的各實施例的範圍和精神的情況下，對於本技術領域的普通技術人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。
sequencelisting
深圳市坤健創新藥物研究院
atp核酸適配體、利用納米金顯色檢測atp的方法及試劑盒
a1700028
1
patentinversion3.3
1
31
dna
人工序列
1
accttcctgggggagtattgcggaggaaggt31