C型肝炎病毒抗體診斷試劑盒及其製備方法
2023-04-29 22:01:26
專利名稱：C型肝炎病毒抗體診斷試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫診斷技術，具體地說是一種磁微粒作為載體的C型肝炎病毒 抗體診斷試劑盒及其製備方法。
背景技術：
丙型病毒性肝炎由C型肝炎病毒(HCV)引起的傳染病，呈全世界分布，主要通過輸 血或血製品傳播，近年發現C型肝炎也多見於非輸血人群，主要通過注射、針刺、含HCV血 液汙染傷口和其他密切接觸傳播，並證實也可通過母嬰傳播。研究表明，209Γ50%的HCV感 染者會發生自發性病毒清除，509Γ80%感染者會持續感染，其中85%進展為慢性肝炎，1(Γ30 年後，部分慢性C肝患者(尤其年齡較長患者)發展為肝硬化，2^10年後，可能發展為肝細胞 癌。由於與慢性B肝相比，C肝更隱蔽，潛伏期為216周；症狀更不明顯，高達75%的感染 者無任何症狀，因此很容易被忽視，中國C肝漏報率高達52%。至今還沒有研製成功可以預防C肝的疫苗，防治C肝只有早期進行診斷，才能在 早期進行治療並防治病情的進一步惡化，否則將會傳染給他人和使自身病情加重、影響身 體健康和傳給後代。因此有必要開發出一種性能較好的診斷方法，能有效地在早期就將該 疾病診斷出來，及時治療，減少因C肝帶來的健康和財產的損失。目前HCV感染的診斷實驗室化驗方法有1.檢測HCV抗體的血清化驗；2.定量檢 測HCV RNA的分子試驗(包括RT-PCR，TMA, bDNA) ；3.基因分型技術。由於感染者體內HCV RNA水平的有限以及不穩定性，使方法2的商業化具有局限性。另外商品化的基因型確定 方法已經出現，但是均未通過FDA批准，基因分型技術也未普及。HCV抗體的血清化驗主要 是酶聯免疫吸附法(ELISA)。ELISA檢測C肝抗體的方法已得到了大量的推廣，該方法具有 很多優點，但在檢測的靈敏度，穩定性等方面還有待進一步提高。全自動微粒子化學發光免 疫分析是在酶免疫分析基礎上結合了高靈敏度的化學發光測定技術和磁性微粒分離技術， 與其他方法相比，這種方法有許多獨特的優點，首先它用順磁性微粒作為固相載體，由於顆 粒體積小，表面積大，擴大了反應面積，大大提高了檢測靈敏度；其次由於使用全自動儀器 及配套試劑，使人為因素減至最低，提高了方法的穩定性和結果的重複性，同時也使得批內 差異與批間差異都較小。與放射免疫法相比，磁微粒子化學發光法除具有高靈敏度、高精確 度、高可靠性等優點外，還具有如下優點a.無放射性汙染，穩定性好；b.特異性高；c.試 劑可隨用隨取，測定方便迅速，可作為急診檢測項目。根據大量的實驗結果以及臨床應用資 料，從實用性、穩定性、準確性及其發展前景來看，該方法逐漸成為取代放射性免疫分析和 酶免疫分析的首選。但是目前國內尚無生產用於C肝抗體檢測的微粒子化學發光法診斷試 劑，目前急需靈敏度和特異性較高的微粒子化學發光診斷試劑，可以作為ELISA試劑和其 他試劑的替代品，用於C肝的診斷。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服上述現有技術的不足，提供一種具有高靈敏度和特異性，適合於臨床C型肝炎病毒的輔助診斷和獻血員篩查的微粒子化學發光法丙型肝 炎病毒抗體診斷試劑盒及其製備方法。本發明解決上述技術問題採用的技術方案是一種C型肝炎病毒抗體診斷試劑 盒，其包括測抗HCV磁微粒、測抗HCV示蹤結合物、測抗HCV樣品稀釋液、質控品。其特徵是 所述測抗HCV磁微粒為標記有C肝病毒特異性重組抗原(含蓋Core、NS3、NS4、NS5的基因 片段)的磁性微粒子；測抗HCV示蹤結合物為標記有特異性抗人IgG的異魯米諾；測抗HCV 樣品稀釋液為含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液；質控品溯源至國家參考品，包括一低含量 HCV抗體的血清和一高含量HCV抗體的血清。本發明還提供了上述C肝病毒抗體診斷試劑盒的製備方法，其特徵是具體步驟 如下
(1)製備測抗HCV磁微粒將帶羧基磁微粒與EDC的重量比為1:2，磁微粒與C肝病毒 特異性重組抗原(即含蓋Core、NS3、NS4、NS5的基因片段)比例為每毫克磁微粒標記20 μ g 的抗原，在室溫下進行標記，標記時間1小時，標記後採用甘氨酸封閉EDC的多餘的位點，使 之濃度達到25mM，反應30分鐘，洗滌三次，加入含1%牛血清白蛋白的0. 0IMPBS, 2_8°C保 存；
(2)製備測抗HCV示蹤結合物特異性抗人IgG與異魯米諾的標記，反應體系為戊 二醛最佳使用濃度為1. 25%，特異性抗人IgG與異魯米諾的最佳重量比為2 :1，在室溫反應 1. 5小時，用0. OlM PBS (ρΗ7· 2-7. 4)進行透析，透析後加入等體積甘油_20°C存放；
(3)製備測抗HCV樣品稀釋液磷酸二氫鈉0.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉 8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳汞1.0g/L，按上述配方配製稀釋液；
(4)質控品溯源至國家參考品，包括質控品1和2，其中質控品1為低含量HCV抗體的 血清，質控品2為高含量HCV抗體的血清。本發明的原理是利用微粒子化學發光免疫分析技術，用特異性的HCV重組多抗原 組份(即含蓋Core、NS3、NS4、NS5的基因片段)標記磁微粒，特異性抗人IgG標記異魯米諾， 反應體系採用兩步法，即測抗HCV磁微粒與待測樣本先溫育一段時間，再加入測抗HCV示蹤 結合物，形成抗原一HCV抗體一特異性抗人IgG免疫複合物，再加入激發液，催化產生光子， 通過化學發光分析儀檢測相對發光單位，發光值的高低與樣本中HCV抗體的含量成正比， 樣本的含量可以利用該批號試劑盒已設定的曲線，通過全自動化學發光測定儀自動計算出 來。本發明試劑盒的優點是採用了微粒子化學發光免疫分析技術，比ELISA具有更高 的靈敏度和更好的特異性，填補了國內HCV抗體檢測的微粒子化學發光法診斷試劑生產的空白。
具體實施例方式本發明試劑盒採用微粒子化學發光免疫分析技術，檢測血清中是否存在HCV抗 體。下面具體描述HCV抗體診斷試劑盒及其製備方法。一種C型肝炎病毒抗體診斷試劑盒，其包括測抗HCV磁微粒、測抗HCV示蹤結合 物、測抗HCV樣品稀釋液、質控品。所述測抗HCV磁微粒為標記有C肝病毒特異性重組多抗 原組份(含蓋Core、NS3、NS4、NS5的基因片段)的磁性微粒子；測抗HCV示蹤結合物為標記有特異性抗人IgG的異魯米諾；測抗HCV樣品稀釋液為含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液； 質控品溯源至國家參考品，包括質控品1和2，其中質控品1為低含量HCV抗體的血清，質控 品2為高含量HCV抗體的血清。本發明上述HCV抗體診斷試劑盒的製備方法，其具體步驟如下
(1)製備測抗HCV磁微粒。將帶羧基磁微粒與EDC的重量比為1 :2，磁微粒與C肝病 毒特異性重組多抗原組份(即含蓋Core、NS3、NS4、NS5的基因片段)比例為每毫克磁微粒 標記20 μ g的抗原，在室溫進行標記，標記時間1小時，標記後採用甘氨酸封閉EDC的多餘 的位點，使之濃度達到25mM，反應30分鐘，洗滌三次，加入含1%牛血清白蛋白的0. 0IMPBS， 2-8 °C保存。(2)製備測抗HCV示蹤結合物。特異性抗人IgG與異魯米諾通過戊二醛作用形成 示蹤結合物，反應體系為戊二醛最佳使用濃度為1.25%，特異性抗人IgG與異魯米諾的最 佳重量比為2 :1，在室溫反應1. 5小時，用0. OlM PBS (pH7. 2-7. 4)進行透析，透析後加入 等體積甘油-20°C存放。(3)製備測抗HCV樣品稀釋液取磷酸二氫鈉0. 39g/L、磷酸氫二鈉2. 68g/L、氯 化鈉8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳汞1.0g/L，按上述配方配製稀釋液。(4)質控品溯源至國家參考品，包括質控品1和2，其中質控品1為低含量HCV抗 體的血清，質控品2為高含量HCV抗體的血清。本發明上述各種原材料的選擇要求如下。磁微粒標記用HCV抗原的選擇要求具有天然抗原的主要免疫活性區、純度高、 效價高、特異性高等。將HCV特異性重組多抗原組份(含蓋Core、NS3、NS4、NS5的基因片 段)作為抗原來源，這種多抗原組份為大腸桿菌表達的基因重組蛋白，包含HCV多種抗原優 勢表位，能夠保證HCV抗體具有較高的檢出率。首先就蛋白的外觀、含量、純度、效價進行驗 證，結果抗原溶液外觀澄清、無肉眼可見異物、無搖不散的沉澱，純度較高(均> 95%)，並具 有較高的效價和很好的活性，特異性和靈敏度較好，研究結果表明重組多抗原組份完全可 用於本發明診斷試劑盒的製備。異魯米諾標記用特異性抗人IgG的選擇首先分析抗人IgG抗體的外觀；用紫外 吸收法測定蛋白質含量；用SDS - PAGE鑑定純度；用ELISA法檢測效價。根據上述多次 試驗研究，本發明製備試劑盒所用的抗人IgG抗體的質量標準為微帶乳光的澄清液體，不 含異物，無搖不散的沉澱；SDS-PAGE檢測，主帶清晰無明顯雜帶，蛋白含量3 2mg/ml，效價 糹 1:10000。磁微粒的選擇通過對磁微粒的外觀，標記蛋白的比率，磁響應性，磁微粒吸附一 致性等方面進行分析，經過多次分析研究，將磁微粒混勻，在燈光下觀察，易分散，無聚集， 無異物；將蛋白採用不同的方法進行標記，標記率應大於90% ；將磁微粒置370-380特斯拉 的磁鐵上，觀察磁微粒的聚集速度，分散均勻的磁微粒在10秒鐘內完全聚集；磁微粒吸附 一致性CVS 10%。研究結果表明黙克的直徑為0.90-1. IOym的磁微粒，含有羧基基團，標 記率最高，可用於本發明診斷試劑盒的製備。異魯米諾的選擇將異魯米諾用DMSO (二甲基亞碸)進行溶解，用純化水進行稀 釋至1. 2X10_5M/L的量，加入10 μ 1異魯米諾液體，各加入200 μ 1激發液，測定其發光值， 發光值應> 160000，經過研究，採用Sigma-Aldrich提供的異魯米諾作為發光的原料。
本發明HCV抗體診斷試劑盒檢測樣品中HCV抗體的檢測方法是首先取出濃縮洗 液，用純化水按照倍數進行稀釋。而後取出激發液A液和B液，放置化學發光儀合適的位 置。激發液A液為含有l%NaOH的緩衝液，激發液B液為含有1%。H2O2的緩衝液。接著將試 劑盒從冰箱中取出後，放於儀器試劑區至少混勻30分鐘後方可使用，並嚴格按照設定的程 序進行加樣和溫育。具體加樣方法如下10 μ L血清/血漿樣本、100 μ L樣品稀釋液以及 20 μ L測抗HCV磁微粒在37°C的條件下反應10分鐘，然後用稀釋好的洗液洗滌5次，再加入 150 μ L測抗HCV示蹤結合物，370C反應10分鐘，再用洗液洗滌5次，最終分別加入200 μ L 激發A液和激發B液，測定發光值。樣本的含量可以利用該批號試劑盒已設定的曲線，通過 發光儀自動計算出來。本發明質量控制要求是試劑盒第一次操作，必須採用定標質控品進行定標，每間 隔兩周用定標質控品對試劑盒的主曲線進行修正，按照修正的主曲線對樣本進行定量。定 標質控品的測定值須在允許範圍內，方可進行定標，如果定標質控結果與預期不符，提示檢 測結果不可靠，不應出具檢測報告。本發明試劑盒檢測HCV國家參考品，檢測的結果顯示該試劑盒的陰陽參考品符 合率、靈敏度、特異性、精密性、穩定性等各項質量指標均符合國家標準。陰性符合率30份 陰性參比品符合率30/30 ；陽性符合率30份陽性參比品符合率30/30 ；靈敏度檢測L1應 檢出陽性，L2應檢出陽性，L3可檢出陽性或陰性，L4應檢出陰性；精密性10孔檢測變異系 數(CV) ( 10% ；穩定性試劑各組分於37°C放置6天，檢定結果達到標準。本發明試劑盒由河南中醫學院第三附屬醫院、中國人民解放軍第一五三中心醫 院、中國人民解放軍第三七一醫院三家醫院進行臨床考核，結果為
(1)河南中醫學院第三附屬醫院考核2 例陰性樣本和85例陽性樣本，本發明試劑盒 陰性樣本2 例全部檢出，陽性樣本85例全部檢出。該試劑盒陰性符合率為100%，陽性符 合率為100%。(2)中國人民解放軍第一五三中心醫院考核186例陰性樣本和77例陽性樣本，本 發明試劑盒陰性樣本186例全部檢出，陽性樣本檢出76例。該試劑盒陰性符合率為100%， 陽性符合率為98. 7%。(3)中國人民解放軍第三七一醫院考核2M例陰性樣本和81例陽性樣本，本發明 試劑盒陰性樣本224例全部檢出，陽性樣本81例全部檢出。該試劑盒陰性符合率為100%， 陽性符合率為100%。該診斷試劑盒總的靈敏度為99. 5%，特異性為100%，診斷試劑盒(間接法微粒子化 學發光法)靈敏度為99. 5%，特異性為100%，適合於臨床C肝的輔助診斷和獻血員篩查。
權利要求
1.一種C型肝炎病毒抗體診斷試劑盒，其包括測抗HCV磁微粒、測抗HCV示蹤結合物、 測抗HCV樣品稀釋液、質控品。其特徵是所述測抗HCV磁微粒為標記有C肝病毒特異性重 組抗原(含蓋Core、NS3、NS4、NS5的基因片段)的磁性微粒子；測抗HCV示蹤結合物為標記 有特異性抗人IgG的異魯米諾；測抗HCV樣品稀釋液為含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液； 質控品溯源至國家參考品，包括一低含量HCV抗體的血清和一高含量HCV抗體的血清。
2.—種權利要求1所述C型肝炎病毒抗體診斷試劑盒的製備方法，其特徵是具體步驟 如下(1)製備測抗HCV磁微粒將帶羧基磁微粒與EDC的重量比為1:2，磁微粒與C肝病毒 特異性重組抗原(即含蓋Core、NS3、NS4、NS5的基因片段)比例為每毫克磁微粒標記20 μ g 的抗原，在室溫下進行標記，標記時間1小時，標記後採用甘氨酸封閉EDC的多餘的位點，使 之濃度達到25mM，反應30分鐘，洗滌三次，加入含1%牛血清白蛋白的0. 0IMPBS, 2_8°C保 存；(2)製備測抗HCV示蹤結合物特異性抗人IgG與異魯米諾的標記，反應體系為戊 二醛最佳使用濃度為1. 25%，特異性抗人IgG與異魯米諾的最佳重量比為2 :1，在室溫反應 1. 5小時，用0. OlM PBS (ρΗ7· 2-7. 4)進行透析，透析後加入等體積甘油_20°C存放；(3)製備測抗HCV樣品稀釋液磷酸二氫鈉0.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉 8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳汞1.0g/L，按上述配方配製稀釋液；(4)質控品溯源至國家參考品，包括質控品1和2，其中質控品1為低含量HCV抗體的 血清，質控品2為高含量HCV抗體的血清。
全文摘要
本發明屬於免疫診斷技術領域，具體涉及一種微粒子化學發光法C型肝炎病毒抗體診斷試劑盒及其製備方法。試劑盒由測抗HCV磁微粒、測抗HCV示蹤結合物、測抗HCV樣品稀釋液、質控品組成，本發明還公開了該診斷試劑盒的製備方法，其採用的是微粒子化學發光免疫分析技術，比ELISA具有更高的靈敏度和特異性，適合於臨床HCV的輔助診斷和獻血員篩查，填補了國內微粒子化學發光法檢測HCV抗體診斷試劑生產的空白。
文檔編號G01N33/569GK102072957SQ20111000990
公開日2011年5月25日 申請日期2011年1月18日 優先權日2011年1月18日
發明者周雷, 姚繼承, 蒙紅勝, 賈向陽, 郭蘭英 申請人:威海威高生物科技有限公司