節桿菌穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法

2023-04-30 07:26:26 1

專利名稱：節桿菌穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌的穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法，特別是一種節桿菌穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。
背景技術：
氮元素是生物體從環境中吸收量最多的礦物質元素，用於合成生物體所需的胺基酸和核苷酸及多種不同的含氮化合物。氮利用在農作物生產中佔重要地位。目前我國已成為世界氮肥的第一生產和消費國，且使用量仍呈每年遞增態勢，氮肥利用率低及過量施用氮肥造成水環境汙染的問題是世界性難題。正因為如此，需要降低氮肥的使用量，並尋找氮利用率更高的植物基因型。更高的氮利用率可以保證農作物在產量不下降的前提下，減少氮肥的使用量，從而減少因施肥造成地表水富營養化等問題的發生。對於生物體的生長和發育而言，氮素的同化是個十分重要的生理過程，無機氮必須同化為穀氨醯胺形式的有機氮才能被生物體所吸收和利用。穀氨醯胺合成酶(glutamine synthetase，GS)是氮同化路徑上的關鍵酶,在ATP功能的情況下,催化NH4+同化成穀氨醯胺，而穀氨醯胺又在穀氨酸合酶的催化下，將其醯胺轉移到α -酮戊二酸上，從而生成兩分子的穀氨酸。穀氨醯胺在生物體內含氮有機物的生物合成中作為氮供體，而外界的無機氮元素也通過這個途徑進入生物體內的整個氮素循環。因此穀氨醯胺合成酶在生物體氮同化過程中起到了十分重要的作用。細菌的穀氨醯胺合成酶涵蓋了目前所發現的三大類穀氨醯胺合成酶GS1、GSII和GSIII，相比高等植物的穀氨醯胺合成酶基因而言，有種類多和容易克隆的優越性。節杆MiArthrobacter sp.)是土壤中常見的一種革蘭氏陽性細菌類群，其穀氨醯胺合成酶基因的克隆及功能鑑定對於改善逆境下農作物的生理性狀有重要的應用前景。

發明內容
本發明的目的之一在於提供了一種節桿菌穀氨醯胺合成酶基因。本發明的目的之二在於提供了該基因的編碼蛋白。本發明的目的之三在於提供該基因的克隆方法。為達到以上目的，本發明通過下述方案實現:
一種節桿菌穀氨醯胺合成酶基因，其特徵在於該基因的序列為SEQ ID N0.1所示的鹼基序列。一種上述的基因編碼的蛋白，其特徵在於該蛋白的序列為SEQ ID N0.2所示的氨
基酸序列。一種重組表達載體，該重組載體含有上述的基因。一種宿主細胞，該宿主細胞含有上述的重組載體。

一種克隆上述的節桿菌穀氨醯胺合成酶基因的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為:參考NCBI資料庫中的節桿菌屬細菌的穀氨醯胺合成酶基因序列，設計兼併引物，再從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴增出了一個穀氨醯胺合成酶基因；所述的兼併引物為:Ar2F: 5』 -ATGTTYAAGACTGCGGACGA-3』 和 Ar2R: 5』 -CTAGACGCCGTAGTAGAGCT-3 』。上述的方法，其特徵在於所述的PCR擴增的條件為:94°C 5分鐘；94°C 50秒，54°C 50秒，72 °C I分30秒，25個循環；72°C 8分鐘。本發明的互補實驗驗證了穀氨醯胺合成酶基因JriAr0J 所編碼的穀氨醯胺合成酶能夠在大腸桿菌中發揮穀氨醯胺合成酶的功能，能恢復大腸桿菌突變體合成穀氨醯胺的能力，同時也預示了它在其他生物氮高效利用方面的應用價值。


圖1和2為本發明的穀氨醯胺合成酶基因編碼的蛋白亞細胞定位預測圖，表明該編碼蛋白定位在細胞質的可能性很大；
圖3為本發明的穀氨醯胺合成酶基因編碼的蛋白的進化分析圖，表明該編碼蛋白屬於穀氨醯胺合成酶家族；
圖4為本發明的穀氨醯胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl50 (strR), Δ (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互補分析圖。培養基中添加穀氨醯胺，轉入和未轉入心的菌株均可以正常生長； 圖5為本發明的穀氨醯胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl
50(strR), Δ (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互補分析圖。培養基中未添加穀氨醯胺，只有轉入XriAroJ 的菌株可以正常生長。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)》，或按照製造廠商所建議的條件。實施例一 -.Arthr02基因全長編碼區的克隆與分析:
通過參考NCBI資料庫中的節桿菌(Arthrobacter spp.)屬細菌的穀氨醯胺合成酶基因序列，設計了兼併引物:Ar2F: 5，-ATGTTYAAGACTGCGGACGA-3』和Ar2R:5』 -CTAGACGCCGTAGTAGAGCT-3』，從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴增出了一個穀氨醯胺合成酶基因，命名為Arthro2。將該基因插入克隆載體pMD 18-T，挑選相應的陽性克隆，對該基因進行了全長DNA測序，獲得了含有該基因完整ORF的DNA序列。測序結果表明的ORF全長1425bp。DNAstar軟體的分析結果顯示:該基因編碼一個含474個胺基酸的蛋白，蛋白分子量大小約為53kDa，等電點為4.7。利用Cell-PLoc網站的Gpos-PLoc 2.0以及Softberry網站的ProtComp Version 9.0軟體對AriAroJ 基因編碼的蛋白進行亞細胞定位預測，預測數據顯示該蛋白定位在細胞質的可能性很大，參見圖1和2，這與其它物種中的穀氨醯胺合成酶的定位信息相符。進化分析表明，JriAr0J 基因編碼的蛋白屬於穀氨醯胺合成酶家族，參見圖3。
實施例二在大腸桿菌突變體中的功能分析
通過DNA測序分析，挑選JriAroJ 基因ORF轉錄方向與載體pMD18_T上乳糖啟動子轉錄方向一致的克隆,抽提該克隆的質粒,並轉入大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169,flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725 (fruA25),relAl,rpsL150 (strR)，Δ (glnG-glnA) 229，ha_10, deoCl)中。請參見文獻:Merida, A., Flores E.,Florencio F.J., Regulation of Anabaena sp.strain PCC7120 glutamine synthetaseactivity in a Synechocystis sp.strain PCC6803 derivative strain bearing theAnabaena glnA gene and a mutated host glnA gene.J Bacteriol, 1992, 174(2):650-654.。該突變體由於缺失編碼穀氨醯胺合成酶的基因，所以在不添加穀氨醯胺的培養基中無法正常生長。該菌株購買於E.coli Genetic Stock Center, Yale University。由圖4和圖5說明Arthro2能夠互補大腸桿菌突變體ET6017的穀氨醯胺合成酶缺失表型。Arthro2的表達，使得大腸桿菌突變體ET6017在不添加穀氨醯胺的培養條件下生長。該互補實驗在大腸桿菌中驗證了基因JriAr0J 所編碼的穀氨醯胺合成酶能夠在大腸桿菌中發揮穀氨醯胺合成酶的功能，證明該基因能夠恢復大腸桿菌突變體合成穀氨醯胺的能力，同時也預示了它在其他生物氮高效利用方面的應用價值。儘管本發明描述了具體的例子，但是有一點對於本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和範圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明範圍內的變動。`
權利要求
1.一種節桿菌穀氨醯胺合成酶基因，其特徵在於該基因的序列為SEQ ID N0.1所示的鹼基序列。
2.一種根據權利要求1所述的基因編碼的蛋白，其特徵在於該蛋白的序列為SEQ IDN0.2所示的胺基酸序列。
3.—種重組表達載體，該重組載體含有根據權利要求1所述的基因。
4.一種宿主細胞,該宿主細胞含有根據權利要求3所述的重組載體。
5.一種克隆根據權利要求1所述的節桿菌穀氨醯胺合成酶基因的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為:參考NCBI資料庫中的節桿菌屬細菌的穀氨醯胺合成酶基因序列，設計兼併引物，再從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴增出了一個穀氨醯胺合成酶基因；所述的兼併引物為:Ar2F: 5』 -ATGTTYAAGACTGCGGACGA-3』和Ar2R:5， -CTAGACGCCGTAGTAGAGCT-3，。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述的PCR擴增的條件為:94°C5分鐘；94°C 50 秒，54°C 50 秒，72 °C I 分 30 秒，25 個循環；72°C 8 分鐘。
全文摘要
本發明涉及一種節桿菌穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。本發明的基因來源於節桿菌屬細菌，為SEQIDNO1所示的鹼基序列。該基因具有編碼穀氨醯胺合成酶的功能，能夠顯著提高模式生物大腸桿菌合成穀氨醯胺的能力。這預示了所公開的全長基因及胺基酸序列，在提高生物體的氮利用效率和增加生物體氮元素含量的基因工程方面具有應用價值。
文檔編號C12N15/52GK103205440SQ20131012790
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月15日 優先權日2013年4月15日
發明者朱晨光, 王偉, 沈春磊, 李朝斌, 俞頔, 唐遠平, 梅冰, 宋任濤 申請人:上海大學