一種基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法

2023-04-30 07:12:56 2

一種基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法，生物素修飾的腺苷核酸適配體和生物素修飾的酪蛋白通過生物素-親合素結合方法固定於親合素修飾微球的表面形成功能化微球；將辣根過氧化物酶和巰基修飾的捕獲探針修飾到納米顆粒上作為信號標記；將功能化納米顆粒流入微流控微珠陣列檢測晶片的檢測區與微珠陣列雜交，洗脫後流入腺苷溶液與雜交微球孵育；流入過氧化物酶底物溶液，將生物素化的酪胺結合到微球表面的酪蛋白上，洗脫後流入親合素標記的量子點；通過計算流入腺苷後微球表面螢光與未流入腺苷微球表面螢光的比值對腺苷進行定性和定量。本發明可高靈敏檢測分析目標，實現了血清樣品中腺苷的特異及準確的定量分析。
【專利說明】—種基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於微全分析系統的生物學檢測【技術領域】，涉及一種基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法。
【背景技術】
[0002]腺苷是一種內源性核苷，因其在中樞神經和周圍神經系統信號表達中的重要作用，受到廣泛關注及研究。同時腺苷作為腺苷脫氨酶的作用底物，其含量變化也會間接反應腺苷脫氨酶的體內代謝水平，而腺苷脫氨酶活性的檢測對於臨床許多疾病的診斷都具有重要參考價值，因此發展腺苷的新型檢測方法對於醫學臨床診斷及機體代謝水平具有重要意義。傳統腺苷檢測方法主要為HPLC、紫外檢測、流式檢測法及螢光分析法等技術，這類技術檢測靈敏度有限，而且需要較大體積的檢測溶液，使得在高靈敏微量分析領域的應用受到局限。微流控微珠陣列晶片是微流控晶片研究領域中發展的一種新型晶片模式，該技術的發展較好解決了微量樣品條件下高通量、高靈敏檢測的難題，同時檢測過程簡單，不需要昂貴的檢測儀器，為發展未來自動化高性能生物分子檢測平臺技術提供了新的方向。
[0003]核酸適配體是指通過指數富集配體系統進化技術(SELEX)從隨機單鏈寡聚核苷酸文庫中篩選的能特異結合蛋白或其他小分子物質的單鏈寡聚核苷酸，長度一般為25-60個核苷酸。與抗體相比，核酸適配體具有易合成、易修飾、易固定、可反覆使用、可長期保存及沒有或極小的免疫原性等特點，而且與目標分子結合表現出高效、專一的特性，因而核酸適配體生物傳感器在蛋白質研究、藥物檢測、醫學診斷等方面得到廣泛應用。酶功能化納米顆粒作為一種檢測標記材料，由於一個納米顆粒上能攜帶多個酶分子，已經成為信號放大【技術領域】中的一種極具應用前景的信號放大方法。

【發明內容】

[0004]為了克服現有技術中存在的缺陷，本發明提供一種基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法，將微流控晶片、核酸適配體識別、多酶納米信號放大技術有機結合起來，發展了一種用於腺苷檢測的高性能生物傳感技術，將具有廣闊的應用前景。其技術方案如下:
[0005]一種基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法，包括以下步驟:
[0006](I)生物素修飾的腺苷核酸適配體和生物素修飾的酪蛋白通過生物素-親合素結合方法固定於親合素修飾微球的表面形成功能化微球，所述微球固定在微流控晶片檢測區的相應微型小室中，形成微流控微珠陣列檢測晶片；
[0007](2)將辣根過氧化物酶和巰基修飾的捕獲探針修飾到納米顆粒上作為信號標記；
[0008](3)將步驟(2)形成的功能化納米顆粒流入微流控微珠陣列檢測晶片的檢測區與微珠陣列雜交，洗脫後流入腺苷溶液與雜交微球孵育，由於腺苷核酸適配體能與腺苷結合形成特定的空間構型，會導致功能化納米顆粒從微球表面脫離；[0009](4)流入過氧化物酶底物溶液，通過多酶納米信號放大技術將生物素化的酪胺結合到微球表面的酪蛋白上，洗脫後流入親合素標記的量子點，所述量子點能與微球表面酪蛋白上結合的生物素識別並固定；
[0010](5)通過計算流入腺苷後微球表面螢光與未流入腺苷微球表面螢光的比值對腺苷進行定性和定量。
[0011]進一步優選，步驟(I)中所述的功能化微球表面修飾的生物素修飾的腺苷核酸適配體和生物素修飾的酪蛋白，其摩爾濃度比值為1: 100?1: 120。
[0012]進一步優選，步驟(I)中所述的微球是二氧化矽微球、聚苯乙烯類有機聚合物微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的任意一種。
[0013]進一步優選，步驟(2)中所述的納米顆粒為金納米顆粒、二氧化矽納米顆粒和聚苯乙烯納米顆粒中的任意一種。
[0014]進一步優選，步驟(3)中所述的腺苷溶液與雜交微球孵育，孵育時間為20?25min。
[0015]進一步優選，步驟(4)中所述的過氧化物酶底物溶液包含0.007%?0.009% H2O2>250?350 μ M生物素化的酪胺、50?IOOmM的NaCl。
[0016]進一步優選，步驟(4)中所述的量子點為CdSe、CdTe、CdS和複合型量子點中的一種，其發射範圍為400nm?700nm。
[0017]與現有技術相比，本發明的有益效果:
[0018]本發明微流控晶片具有微量檢測和高通靈敏檢測的雙重特性，能夠較好的解決常規分析方法中微量檢測、高靈敏檢測以及高通量分析等性能難以兼容的問題，可實現微量樣品的高靈敏分析；本發明採用多酶納米信號放大及量子點螢光技術，可高靈敏檢測分析目標，能夠檢測0.1pM的腺苷，而且實現了血清樣品中腺苷的特異及準確的定量分析；本發明的建立為腺苷的微量及高靈敏檢測提供了一種有力的檢測手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發明的基於微珠傳感和核酸適配體識別技術的腺苷檢測原理示意圖；
[0020]圖2為本發明實施例的微流控晶片內外檢測腺苷的靈敏度對比曲線圖；
[0021]圖3為本發明實施例的血清樣品檢測結果。
【具體實施方式】
[0022]下面結合附圖和具體實施例進一步說明本發明的技術方案。
[0023]參照圖1，是本發明方法的原理示意圖。圖1所示的具體原理如下:
[0024]首先，生物素修飾的核酸適配體3及生物素修飾的酪蛋白2按照一定比例修飾到親和素修飾的微球表面1，製備出可用於腺苷檢測的功能化微球4 ;流入修飾了辣根過氧化物酶(HRP)和捕獲探針的功能納米顆粒5，與晶片內的功能化微球雜交，捕獲探針與核酸適配體通過雜交結合起來，將功能化納米顆粒固定在微球表面6 ;流入目標分子腺苷7，腺苷與核酸適配體結合形成特定空間結構並將功能納米顆粒從微球表面解離下來8 ;然後流入酶催化底物溶液，包含生物素化的酪胺9和雙氧水，辣根過氧化物酶在雙氧水存在下能催化生物素化的酪胺形成活性分子10，該生物素化的活性分子能與酪蛋白功能化微球表面攜帶的羥苯基團發生共價交聯，從而形成生物素基團功能化的微球表面11 ;流入親和素修飾的量子點12，量子點利用親和素與生物素的結合特性固定在微球表面形成了識別微球13 ；最後根據識別微球表面螢光信號獲取檢測信息。
[0025]下面是本發明實施例的具體實施過程:
[0026](I)酪蛋白的製備:將0.3-0.5g酪蛋白溶解在10mL150-200mM的NaHCO3溶液中，將溶解有2-4mg羥苯基丙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯和0.5-1.0mg生物素化的琥珀醯亞胺酯的二甲基甲醯胺在攪動下逐滴加入到酪蛋白溶液中。混合溶液在室溫下連續攪動lh，然後在去離子水中透析12-24h，再在磷酸緩衝液(20mM，pH7.6)中透析12_24h，溶液離心去除輕微的渾濁溶液，沉澱凍幹備用。 [0027](2)用於腺苷檢測的功能化聚苯乙烯微珠的製備:採用10-30 μ m親和素修飾聚苯乙烯微球作為核酸適配體固定的固相界面,取100 μ L濃度為1% -3%的親和素修飾微球於離心管中，用 IOOyL 親和洗脫液(20mM Tris ρΗ7.5，IM NaCl, ImM EDTA,0.0005%Triton X-100)洗滌兩次，離心條件為3500rpm，5min，去上清；分別加入44 μ L的親和洗脫液、3 μ L10-15 μ M的生物素化的酪蛋白及3 μ L0.1-0.3μ M如表1所示的核酸適配體，常溫孵育10-15h ;通過離心洗滌方法去除未結合的分子並將功能化微球懸浮於100 μ L親和洗脫液。核酸適配體及酪蛋白通過修飾的生物素與微球表面的親和素特異性結合併固定在微球表面，從而形成了具有目標分子檢測能力的功能化聚苯乙烯微球。
[0028](3)微流控微珠陣列晶片的製備:首先將設計的晶片結構圖樣通過繪圖軟體(CorelDRAW 9.0)繪製出來，並以2400dpi的解析度列印在Kodak的菲林膠片上製備出晶片的光掩膜；然後將光掩膜的圖案通過紫外曝光的方法轉移到覆蓋有光刻膠的PCB板上，並用化學刻蝕方法在曝光PCB板上製備出晶片的陽模板；最後將聚二甲基矽氧烷前聚體與固化劑按10: I比例混合後於真空泵中除去氣泡，然後平鋪在晶片陽模板上(厚約1mm)。置於65°C烘箱中3h，待固化後取出，將聚二甲基矽氧烷(PDMS)片基從陽模板上剝離下來。功能化微球通過微珠裝載片基固定在以微型小室為單位構成的陣列中；功能化微珠固定後，剝離微珠裝載片基並將微球固定陣列片基和試劑傳送片基貼合構建檢測晶片。
[0029](4)功能化金納米顆粒探針的製備:取600 μ L製備的金納米顆粒在1000Orpm下離心15min去上清並濃縮至150 μ L，用0.1M K2CO3調pH為8.0左右，隨後加入9.0 μ L辣根過氧化物酶溶液(5μ g/μ L)，室溫下反應30分鐘，加入如表1所示的捕獲探針6(^1^(1(^]\0，101:下搖床中200印111反應2011。加入緩衝液使體系中含IOmM PBS,0.02%Tween-20,0.15MNaCl (終濃度)，10°C下搖床中 200rpm 反應 20h。最後 10000rpml5min 離心去上清，並
[0030]表1合成的寡核苷酸探針(5，-3』端)
[0031]
【權利要求】
1.一種基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)生物素修飾的腺苷核酸適配體和生物素修飾的酪蛋白通過生物素-親合素結合方法固定於親合素修飾微球的表面形成功能化微球，所述微球固定在微流控晶片檢測區的相應微型小室中，形成微流控微珠陣列檢測晶片； (2)將辣根過氧化物酶和巰基修飾的捕獲探針修飾到納米顆粒上作為信號標記； (3)將步驟(2)形成的功能化納米顆粒流入微流控微珠陣列檢測晶片的檢測區與微珠陣列雜交，洗脫後流入腺苷溶液與雜交微球孵育； (4)流入過氧化物酶底物溶液，通過多酶納米信號放大技術將生物素化的酪胺結合到微球表面的酪蛋白上，洗脫後流入親合素標記的量子點，所述量子點能與微球表面酪蛋白上結合的生物素識別並固定； (5)通過計算流入腺苷後微球表面螢光與未流入腺苷微球表面螢光的比值對腺苷進行定性和定量。
2.根據權利要求1所述的基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法，其特徵在於:步驟(I)中所述的功能化微球表面修飾的生物素修飾的腺苷核酸適配體和生物素修飾的酪蛋白，其摩爾濃度比值為1: 100?1: 120。
3.根據權利要求1所述的基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法，其特徵在於:步驟(I)中所述的微球是二氧化矽微球、聚苯乙烯類有機聚合物微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的任意一種。
4.根據權利要求1所述的基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法，其特徵在於:步驟(2)中所述的納米顆粒為金納米顆粒、二氧化娃納米顆粒和聚苯乙烯納米顆粒中的任意一種。
5.根據權利要求1所述的基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法，其特徵在於:步驟(3)中所述的腺苷溶液與雜交微球孵育，孵育時間為20?25min。
6.根據權利要求1所述的基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法，其特徵在於:步驟(4)中所述的過氧化物酶底物溶液包含0.007%?0.009% H2O2,250?350 μ M生物素化的酪胺、50?IOOmM的NaCl。
7.根據權利要求1所述基於微流控晶片和核酸適配體識別技術的腺苷檢測方法，其特徵在於:步驟(4)中所述的量子點為CdSe、CdTe, CdS和複合型量子點中的一種，其發射範圍為 400nm ?700nm。
【文檔編號】G01N33/68GK103713138SQ201310702881
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】張何, 傅昕, 胡鑫江 申請人:湖南工程學院