作為t－型鈣通道阻滯劑的3,4－二氫喹唑啉衍生物及其製備方法

2023-04-30 01:05:11

專利名稱：作為t－型鈣通道阻滯劑的3,4－二氫喹唑啉衍生物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及作為T-型鈣通道阻滯劑的3，4-二氫喹唑啉衍生物或其鹽及其製備方法。本發明進一步涉及含有上述化合物的用於阻滯T-型鈣通道的組合物。
背景技術：
神經細胞中的鈣在神經細胞之間的信號傳遞中起著重要的作用。鈣具有多種通道。然而，當向其傳遞末端刺激時，電壓依賴性Ca2+通道起主要作用。也就是說，作為膜蛋白的電壓依賴性Ca2+通道，通過控制細胞外鈣離子的內流，調節各種細胞內功能(如肌肉收縮、神經組織的形成、突觸的適應性、神經遞質和激素的分泌、基因表達等)。
根據其生物物理性質電壓依賴性Ca2+通道在功能上可以分為兩種類型低電壓激活Ca2+通道(以下稱為「LVA」)，其在低電壓下被激活；以及高電壓激活Ca2+通道(以下稱為「HVA」)，其在高電壓下被激活。根據其誘導的電流的藥理學性質，HVA鈣通道又可以被細分為L-、P/Q、N-和R-型。LVA鈣通道的特徵在於其傳導性小，可以被快速地激活或滅活。因此，其屬於T(瞬時)-型鈣通道(Tsien，R.W.等，Trends Neurosci.1988，11，431-438)。
據報導，T-型鈣通道與神經細胞的激發(Huguenard，J.R.等，Annu.Rev.Physiol.1996，58，329-348)、心臟起搏器活性(Zhou，Z.等，J.Mol.Cell.Cardiol.1994，26，1211-1219)、醛固酮的分泌(Rossier，M.F.等，Endocrinology 1996，137，4817-4826)、受精作用(Arnoult，C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.1996，93，13004-13009)以及疼痛的緩解(Ikeda，H.等，Science 2003，299，1237-1240)有關。
T-型鈣通道可由於遺傳或環境原因，例如癲癇(Tsakiridou，E.等，J.Neurosci.1995，15，3110-3117)、高血壓(Self，D.A.等，J.VACS.Res.1994，31，359-366)、心室肥厚(Nuss，H.B.等，Circ.Res.1995，73，777-7825)、疼痛(Shin，H.S.等，Science 2003，302，117-119)以及心絞痛(Van der Vring，J.A.et al，Am.J.Ther.1999，6，229-233)而變得過度表達。通過基因克隆技術，已發現T-型鈣通道中具有三種類型的基因α1G、α1H和α1I(Talley，E.M.等，J.Neurosci.1999，19，1895-1911)。現已作了很多努力試圖開發選擇性地抑制T-型鈣通道的阻滯劑。然而，除了咪拉地爾和ZD7288(Felix，R.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.2003，311，187-192)以外，還沒有發現有效的T-型鈣通道阻滯劑。因此，通過開發一種選擇性T-型鈣通道阻滯劑，可能開發出用於癲癇、高血壓和疼痛相關的疾病的全新治療劑。
阻滯T-型鈣通道的代表性藥物為Hoffman La Roche Ltd.的咪拉地爾(註冊商標Posicor)。已發現該藥物能夠有效地治療高血壓、心絞痛和腦中風。自1997年5月以來，該藥物已作為治療高血壓的藥物上市。然而人們發現由於抑制CYP3A4肝酶而產生的藥物-藥物的相互作用可導致副作用。於是，1999年6月該藥物退出了市場，自其第一次進入市場至此僅13個月。
因此，在本領域需要開發一種具有可以替代咪拉地爾的新結構的選擇性T-型鈣通道阻滯劑。
發明概述本發明的目的是提供一種具有新結構骨架的T-型鈣通道阻滯劑，其比咪拉地爾的治療效果更好，而且不產生任何副作用。
具體地說，本發明提供以式1表示的新3，4-二氫喹唑衍生物及其鹽，其可以有效用作選擇性T-型鈣通道阻滯劑，以及其製備方法。並且，本發明還提供用於阻滯T-型鈣通道的組合物，包括上述3，4-二氫喹唑衍生物或其鹽和藥學上的可接受載體。此外，本發明還提供一種通過給予治療有效量的3，4-二氫喹唑啉衍生物或其藥學上的可接受鹽來治療選自心絞痛、高血壓、心肌疾病、疼痛和癲癇的疾病的方法。
式1
其中，n為1至4的整數；R1選自氫、羥基、滷素、硝基、C1-C8烷基、C3-C6環烷基、C2-C6鏈烯基、C2-C6炔基、取代或未取代的芳基和雜芳基、C1-C6烷氧基、C3-C6環烷氧基、(芳基或雜芳基)氧基、C1-C6硫代烷氧基、C3-C6環硫代烷氧基、(芳基或雜芳基)硫代氧基以及氨基；R2為C1-C6烷基、C3-C6環烷基、C1-C6烷氧基烷基、C3-C6環烷氧基烷基、C1-C6鏈烯基、取代或未取代的芳基和雜芳基；4-嗎啉基；4位上隨機取代的哌嗪基；1-吡咯烷基；1-哌啶基；或-NR1R2，其中R1和R2各自獨立地選自C1-C6烷基、C3-C6環烷基、取代或未取代的芳基和雜芳基；R3選自C1-C6烷基、C3-C6環烷基、C1-C6烷氧基烷基、C3-C6環烷氧基烷基、取代或未取代的芳基和雜芳基；R4為R4為X-(CH2)n-Y(NH)o-S(O)m-Z，其中X為氧或氮；n為1至4的整數；Y為取代或未取代的C3-C6環烷基、芳基或雜芳基；o為0或1的整數；m為0至2的整數；Z選自取代或未取代的C3-C6環烷基、芳基或雜芳基；在o為0的條件下，-S(O)m-Z不存在。
附圖的簡單說明

圖1為表示T-型鈣通道性質的曲線圖，其主要在-30mV的低電壓下被激活。
圖2為表示T-型鈣通道性質的曲線圖，其中的激活電流可以快速激活和滅活。
圖3為表示Ni2+對T-型鈣通道產生的抑制效果的曲線圖。
圖4為表示咪拉地爾對T-型鈣通道的抑制效果的曲線圖。
圖5為表示本發明化合物對T-型鈣通道的抑制效果圖。
圖6為表示本發明化合物細胞毒性圖。
優選實施方式的詳細描述本發明內容是基於對3，4-二氫喹唑啉衍生物的研究結果，該衍生物能夠有效地選擇性阻滯T-型鈣通道。
優選的本發明的式1化合物的代表性例子有4-(N-苄基乙醯氨基)-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氫喹唑啉(KYS05001)，4-(N-苄基乙醯氨基)-3-苯基-2-(嗎啉-1-基)-3，4-二氫喹唑啉(KYS05026)，
4-(N-苄基乙醯氨基)-3-苯基-2-(4-甲基哌嗪基)-3，4-二氫喹唑啉(KYS05028)，4-[N-(4-硝基苄基)乙醯氨基)-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氫喹唑啉(KYS05034)，4-{N-[4-(4-甲基苯磺醯氨基)苄基]乙醯氨基}-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氫喹唑啉(KYS05041)，以及4-{N-[4-(4-氟苯磺醯氨基)苄基]乙醯氨基}-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氫喹唑啉(KYS05042)。上述化合物各自的化學式如下
本發明的化合物可以通過如反應圖解1和2所示的方法製備，這些方法僅僅是為了示範性目的，而不是對本發明的範圍進行限定。
反應圖解1 本發明化合物的碳化二亞胺化合物(4)中間體可以按照Wang，F.等所描述的常規方法(Tetrahedron Lett.1997，38，8651-8654)適當地加以改進來合成。在本發明的一個優選的實施方式中，在合適的溫度(優選70℃)下用SnCl2處理起始物2-硝基肉桂酸酯(1)將硝基還原成氨基。通常，碳化二亞胺通過使亞氨基正膦與雜-累積多烯(異氰酸酯或硫代異氰酸酯(tioisocyanate))進行氮雜-維蒂希反應製得(Wamhoff，H.等，Adv.Heterocycl.Chem.1995，64，159；Molina，P.等，Synthesis 1994，1197-1217)。然而，當脲型化合物製備，而非具有三個苯基環的亞氨基正膦時，在室溫下可以得到定量的產率。因此，其反應條件更加簡單。因此，本發明採用由脲型化合物製備碳化二亞胺的方法。
因此，將如此得到的胺化合物(2)溶於四氫呋喃(THF)或苯(優選苯)中，向其中加入異氰酸苯酯。然後，將混合物在室溫下攪拌以獲得脲型化合物(3)。將脲型化合物用二溴三苯基膦和三乙胺進行脫水反應製得碳化二亞胺化合物(4)(Gololobov，Y.G.等，Tetrahedron 1992，48，1353-1406；Larksarp，C.等J.Org.Chem.1998，63，6229-6233)。在該步驟中，若用異氰酸酯或硫代異氰酸酯(tioisocyanate)代替異氰酸苯酯，則可以在二氫喹唑啉的3位上引入各種取代基。
當碳化二亞胺化合物(4)與各種雜原子親核試劑如醇、硫醇和胺(優選反應圖解1中所示的哌啶)在溶劑(如苯)的存在下進行反應時，雜原子對碳化二亞胺基團的中間碳進行親核加成反應。使化合物(5)進行分子間連續1，4-加成反應，以製得本發明化合物中間體的3，4-二氫喹唑啉(6)。
反應圖解2 本發明中間體化合物(6)的甲基酯基團在溶於THF和水的混合溶劑的氫氧化鋰中於適當的溫度(優選60℃)下定量地水解，得到游離的羧酸化合物(7)。採用1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)和1-羥基苯並三唑(HOBT)使游離羧酸化合物(7)與各種醇和胺(優選反應1圖解2中的硝基苄胺)進行偶合反應，以製得醯胺化合物(8)(Gaucher，A.等，TetrahedronAsymmetry 2001，12，2571-2580；Dhaon，M.K.等，J.Org.Chem.1982，47，1962-1965)。在作為溶劑的甲醇和作為催化劑的鈀(Pd)的存在下，將醯胺化合物(8)進行氫化使其硝基還原成氨基。這樣獲得胺化合物(9)。將胺化合物(9)與各種磺醯滷(優選反應圖解2中的4-氟苯磺醯氯)進行偶合反應，製得磺醯胺化合物(10)，即本發明的最終產物。
現在參照以下實施例對本發明進行詳細的描述，但不是對本發明的範圍進行限定。
實施例12-氨基肉桂酸甲酯(2)的製備將2-硝基肉桂酸甲酯(1)(0.202g，0.975mmol)溶於20ml乙酸乙酯中，向其中加入SnCl2·2H2O(1.11g，4.87mmol)。將反應混合物於70℃下加熱1小時。反應完成後，將反應混合物冷卻至室溫。將反應混合物用飽和碳酸氫鈉溶液調節至弱鹼性溶液，然後用細粘土層(Celite545)過濾。水層用乙酸乙酯萃取三次，將從中收集的有機層用無水硫酸鎂乾燥。此後，減壓除去溶劑。將反應混合物通過柱色譜(己烷∶乙酸乙酯＝5∶1)加以純化，得到黃色晶體狀態的標題化合物(2)(0.161g，93％)(mp 67℃)。
IR(KBr)3365，2364，1704，1622，1330，1198，756cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.86(d，J＝15.9Hz，1H，-CH＝CH-CO2Me)，7.40(d，J＝7.5Hz，1H，芳香族的)，7.19(t，J＝7.2Hz，1H，芳香族的)，6.78(t，J＝7.8Hz，1H，芳香族的)，6.72(d，J＝7.5Hz，1H，芳香族的)，6.38(d，J＝15.9Hz，1H，-CH＝CH-CO2Me)4.02(br，2H，-NH2)，3.82(s，3H，-OCH3)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ168.0，145.9，140.6，131.6，128.3，120.1，119.2，117.9，117.0，51.9.
實施例23-[2-(3-苯基脲基)苯基]丙烯酸甲酯(3)的製備將2-氨基肉桂酸甲酯(2)(6.35g，35.8mmol)溶於150ml苯中，在室溫下向其中緩慢滴加異氰酸苯酯(5.12g，43.0mmol)。將反應混合物攪拌12小時，得到固體沉澱。然後，將沉澱用乙醚洗滌，得到標題化合物(3)白色晶體(10.2g，96％)(mp 184℃)。
IR(KBr)3346，3278，1724，1650，1548，1322，1172，758，672cm-1；1H NMR(300MHz，DMSO)δ8.94(s，1H，-NH-CO-)8.49(s，1H，-NH-CO-)7.89(d，J＝15.9Hz，1H，-CH＝CH-CO2Me)，7.76(d，J＝7.8Hz，2H，芳香族的)，7.46(d，J＝8.4Hz，2H，芳香族的)7.39(t，J＝8.1Hz，1H，芳香族的)，7.28(t，J＝7.8Hz，2H，芳香族的)7.12(t，J＝7.5Hz，1H，芳香族的)6.97(t，J＝7.8Hz，1H，芳香族的)，6.58(d，J＝15.3Hz，1H，-CH＝CH-CO2Me)，3.73(s，3H，-OCH3)；13C NMR(75MHz，DMSO)δ167.4，153.5，140.5，140.3，138.5，131.4，129.5，127.8，126.8，124.6，124.4，122.7，119.5，118.9，52.2.
實施例33-[2-(苯基亞氨基亞甲基氨基)苯基]丙烯酸甲酯(4)的製備將化合物(3)(6.04g，20.4mmol)和三乙胺(6.19g，6.12mmol)溶於30ml二氯甲烷中，在0℃下向其中緩和地加入二溴三苯基膦(12.9g，30.6mmol)。將反應混合物攪拌1小時，並用二氯甲烷萃取三次。將從中收集的有機層用無水硫酸鈉乾燥，減壓除去溶劑。將反應混合物通過柱色譜(己烷∶乙酸乙酯＝20∶1)純化標題化合物(4)，得到白色晶體碳化二亞胺(4)，(4.26g，75％)(mp 54℃)。
IR(KBr)2142，1716，1484，1172，756，59cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.18(d，J＝16.2Hz，1H，-CH＝CH-CO2Me)，7.56(d，J＝7.8Hz，1H，芳香族的)，7.36-7.29(m，3H，芳香族的)，7.25(d，J＝7.8Hz，1H，芳香族的)，7.20-7.13(m，4H，芳香族的)，6.52(d，J＝16.2Hz，1H，-CH＝CH-CO2Me)，3.80(s，3H，-OCH3)；13CNMR(75MHz，CDCl3)δ167.5，140.5，138.4，138.0，134.3，131.3，129.8，129.0，127.8，126.1，126.0，125.9，124.6，119.6，52.0.
實施例44-甲氧羰基甲基-2-(1-哌啶基)-3-苯基-3，4-二氫喹唑啉(6)的製備將化合物(4)(0.605g，2.17mmol)溶於20ml苯中，在室溫下向其中緩和地滴加哌啶(0.222g，2.60mmol)。將反應混合物攪拌2小時。兩小時後，將反應混合物用水和鹽水洗滌。有機層用無水硫酸鎂乾燥，減壓除去溶劑。將反應混合物通過柱色譜(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)純化標題化合物(6)，得到白色晶體(0.632g，80％)(mp 109℃)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.28-7.17(m，4H，芳香族的)，7.09-7.01(m，3H，芳香族的)，6.97-6.89(m，2H，芳香族的)，5.10(dd，J＝4.5和10.8Hz，1H，-CH2-CH-N-)，3.79(s，3H，-OCH3)，3.42(s，4H，哌啶基)，2.85(dd，J＝10.8和15.3Hz，1H，-CO-CH2-)，2.52(dd，J＝4.7和15.5Hz，1H，-CO-CH2-)，1.55-1.50(m，2H，哌啶基)，1.43-1.40(m，4H，哌啶基)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ172.2，153.2，146.3，144.4，129.4，128.6，126.1，124.9，124.1，123.1，122.6，122.4，61.2，52.0，47.0，39.8，25.7，25.0；HRMS(FAB，M+H)計算值C22H26N3O2364.2025，實測值364.2019.
實施例54-羧基-2-(1-哌啶基)-3-苯基-3，4-二氫喹唑啉(7)的製備將化合物(6)(0.235g，0.645mmol)溶於10ml THF/水(1∶1)中，在室溫下向其中加入水合氫氧化鋰(0.135g，3.23mmol)。將反應混合物在60℃下攪拌2小時。反應完成後，將反應混合物的pH值調至3～4，然後用二氯甲烷將反應混合物萃取三次。有機層用無水硫酸鎂乾燥，減壓除去溶劑，定量地獲得標題化合物白色晶體(7)(mp 238℃)。
1H NMR(300MHz，DMSO)δ7.57(d，J＝7.8Hz，1H，芳香族的)，7.45-7.26(m，7H，芳香族的)，7.19(m，1H，芳香族的)，5.29(dd，J＝6.3和9.3Hz，1H，-CH2-CH-N-)，3.36(s，4H，哌啶基)，2.88(dd，J＝9.3和15.0Hz，1H，-CO-CH2-)，2.69(dd，J＝6.3和15.1Hz，1H，-CO-CH2-)，1.46-1.23(m，6H，哌啶基)；13C NMR(75MHz，CD3OD)δ174.6，153.1，143.7，132.7，130.1，129.1，127.5，127.3，126.3，125.7，124.7，118.0，62.8，49.5，42.6，24.6，23.3.
實施例64-[N-(4-硝基苄基)乙醯氨基)-2-(1-哌啶基)-3-苯基-3，4-二氫喹唑啉(8)的製備將化合物(7)(0.22g，0.63mmol)和1-羥基苯並三唑(HOBT)(0.13g，0.94mmol)溶於20ml二氯甲烷/THF(1∶1)中，在0℃下向其中滴加4-硝基苄胺(0.18mg，0.94mmol)。將反應混合物在相同的溫度下攪拌1小時。然後向反應混合物中加入1-[3-(二甲基胺)丙基]-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(RDC)(0.14g，0.75mmol)，進一步攪拌12小時。反應完成後，減壓除去溶劑，將所得溶液溶於二氯甲烷中。將反應混合物用0.5M鹽酸水溶液連續萃取兩次。然後，用NaHCO3水溶液飽和兩次，以及用水飽和一次，然後用鹽水洗滌。有機層用無水硫酸鎂乾燥，減壓除去溶劑。將反應混合物通過柱色譜(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)純化標題化合物，得到白色晶體(8)(0.24g，80％)。
IR(KBr)3192，2932，2848，1668，1552，1486，1430，1344，1282，756cm-1；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.58(br，1H，-CO-NH-CH2-)，8.15(d，J＝8.7Hz，2H，-CH2-C4H4-NO2)，7.49(d，J＝8.1Hz，2H，-CH2-C4H4-NO2)，7.27-7.20(m，2H，芳香族的)，7.15-7.02(m，4H，芳香族的)，6.95-6.87(m，3H，芳香族的)，5.23(dd，J＝6.0和8.7Hz，1H，-CH2-CH-N-)，4.67(dd，J＝6.7和12.1Hz，1H，-NH-CH2-)，4.58(dd，J＝5.7Hz和15.3Hz，1H，-NH-CH2-)，3.10(br，4H，哌啶基)，2.58(dd，J＝9.0和14.7Hz，1H，-CO-CH2)，2.32(dd，J＝6.1和14.2Hz，1H，-CO-CH2-)，1.35(br，2H，哌啶基)，1.13(br，4H，哌啶基)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ170.9，154.3，147.4，146.5，145.9，143.1，129.5，129.0，128.5，127.0，125.4，124.7，124.0，123.1，123.0，122.0，60.8，47.5，43.2，41.6，25.2，24.6；HRMS(FAB，M+H)計算值C28H30N5O3484.2349，實測值484.2341.
實施例74-[N-(4-氨基苄基)乙醯氨基)-2-(1-哌啶基)-3-苯基-3，4-二氫喹唑啉(9)的製備將化合物(8)(1.39g，2.87mmol)和10％Pd(C)(0.28g)溶於40ml甲醇中，在氫氣氛圍下攪拌2小時。反應完成後，將反應混合物用Celite545過濾，減壓除去溶劑。將反應混合物通過柱色譜(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)純化胺化合物(1.26g，97％)。
IR(KBr)3218，2930，2850，1648，1550，1480，1430，1350，1282，732cm-1；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.26-7.22(m，2H，芳香族的)，7.20-7.11(m，4H，芳香族的)，7.07-7.02(m，3H，芳香族的)，6.96-6.90(m，2H，芳香族的)，6.60-6.56(m，2H，芳香族的)，6.37(br，1H，-CO-NH-CH2-)，5.17(dd，J＝5.1和9.6Hz，1H，-CH2-CH-N-)，4.32(d，J＝5.7Hz，2H，-NH-CE2-)，3.51(br，2H，-C4H4-NH2)，3.26(br，4H，哌啶基)，2.57(dd，J＝10.2和14.1Hz，1H，-CO-CH2)，2.31(dd，J＝5.4和14.1Hz，1H，-CO-CH2-)，1.43(br，2H，哌啶基)，1.26(br，4H，哌啶基)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ169.7，153.3，145.7，145.2，141.0，129.5，129.2，128.2，128.1，126.7，124.8，124.6，123.2，123.1，121.5，115.0，61.2，47.6，43.2，41.7，24.8，24.2；HRMS(FAB，M+H)計算值C28H32N5O 454.2607，實測值454.2654.
實施例84-{N-[4-(4-氟苯磺醯氨基)苄基]乙醯氨基}-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氫喹唑啉(10KYS05042)的製備將化合物(9)(0.11g，0.26mmol)溶於10ml二氯甲烷中，向其中加入吡啶(0.06g，0.76mmol)。在0℃下將4-氟苯磺醯氯(0.06g，0.31mmol)溶於5ml二氯甲烷中，將其緩慢滴加到反應混合物中，室溫攪拌24小時。反應完成後，將反應混合物用二氯甲烷萃取三次，並用鹽水洗滌。有機層用無水硫酸鎂乾燥，減壓除去溶劑。將反應混合物通過柱色譜(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)純化標題化合物，得到白色晶體(10)(0.11g，73％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.66-7.62(m，2H，芳香族的)，7.28-7.23(m，2H，芳香族的)，7.20-7.06(m，9H，芳香族的)，7.04-6.90(m，4H，芳香族的)，6.72(br，1H，-CO-NH-CH2-)，5.19(dd，J＝6.0和9.9 Hz，1H，-CH2-CH-N-)，4.41(dd，J＝6.1和14.8Hz，-NH-CH2-)，4.24(dd，J＝5.5和14.8Hz，-NH-CH2-)，3.28(br，4H，哌啶基)，2.74(dd，J＝9.6Hz和14.1Hz，1H，-CO-CH2)，2.44(dd，J＝6.0和14.1Hz，1H，-CO-CH2-)，1.39(br，2H，哌啶基)，1.25(br，4H，哌啶基)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ170.1，166.7，153.9，145.3，141.7，135.9，135.0，129.9，129.7，129.3，128.9，128.4，126.7，125.2，124.8，123.2，121.5，116.3，116.0，61.4，47.9，43.3，42.0，25.2，24.6；HRMS(FAB，M+H)計算值C34H35FN5O3S 612.2445，實測值612.2436.
實施例3至8所製備的化合物的理化性質列於下表1中。
表1





生物活性測試為了篩選有效的T-型鈣通道阻滯劑，作為初篩方法，採用表達T-型鈣通道α1H的蛙未受精卵母細胞對上述實施例中製備的化合物進行通道抑制活性測試。作為初篩結果，選取顯示50％或更強抑制效果的T-型鈣通道阻滯受試化合物，按照電生理全細胞膜片鉗方法測試其對T-型鈣通道的活性。這種方法採用在T-型鈣通道編碼基因中選擇性表達α1G的哺乳動物HEK 293細胞系，其中α1G主要在神經細胞中被表達(來源於人腎癌細胞，由美國維吉尼亞的維吉尼亞大學的Edwards Ferez-Reyes教授確定)。對確認具有T-型鈣通道阻滯活性的受試化合物，按照3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二甲基四唑溴化物(MTT)試驗測試其細胞毒性。結果發現本發明化合物顯示良好的T-型鈣通道抑制活性。
試驗實施例1-1未受精非洲蟾蜍卵母細胞的製備以及α1HT-型鈣通道的cRNA合成為了在未受精非洲蟾蜍卵母細胞中表達基因編碼的T-型鈣通道α1H(Cav3.2)(Cribbs，L.L.等，Circ.Res.，1998，83，103-109)，用限制酶AflII處理pGEM-HEA，得到DNA片段(AF051946)該片段含具有T-型鈣通道cDNA的5』-末端區。用T7 RNA聚合酶按照廠商的說明書(mMESSAGEmMACHINE試劑盒，Ambion，奧斯汀，美國)合成具有與該片段的序列相對應的序列的cRNA。合成的cRNA通過分光光度計測定O.D.值進行定量。此時，根據以下方法由雌爪蟾(Xenopus laevis)(Xenopus I，美國)製備未受精卵母細胞。將蛙的腹部切開約1cm後，用剪刀從中分離出三到四葉，並分離成其上附著一些卵母細胞的小碎片。將小碎片在OR溶液(82.5mM NaCl，2.5mM KCl，1mM MgCl2，5mM HEPES，pH7.6)中進行水解，並補充IA型膠原酶(Sigma，美國)以去除脫泡囊作用(defolliculation)。通過解剖顯微鏡篩選健康卵母細胞後，將其在SOS溶液(100mM NaCl，2mM KCl，1.8mM CaCl2，1mM MgCl2，5mM HEPES，2.5mM丙酮酸鹽，50μM/ml慶大黴素，pH7.6)中浸泡3至4小時使其復活。用毫微注射器向每個卵母細胞中注射2至5ngcRNA。注射後在18℃維持4至5天後，測試卵母細胞，以測定由其所表達的通道的電性能。
試驗實施例1-2採用雙電極電壓鉗方法測定α1HT-型鈣通道的電生理性能由非洲蟾蜍(Xenopus)未受精卵母細胞表達的鈣通道的電流，根據雙電極電壓鉗方法進行測定。在10mM Ba2+溶液(10mM Ba(OH)2，90mM NaOH，1mM KCl，0.1mM EDTA，5mM HEPES，用甲磺酸調節至pH7.4)中進行電流測定。此時，電壓鉗和電流測定通過一個用於未受精卵母細胞的放大器(Model OC-725C，Warner Instrument Corp.，美國)進行調節，並用Digidata2000A(模擬-數字轉換器，Axon Instrument)將模擬信號轉換成數位訊號。所有數據的收集、儲存和分析通過pCLAMP8記錄在Pentium IV計算機上。主要在5KHz處收集數據，並在1KHz處進行過濾(902型濾波器，頻率裝置安置於Harverhill，MA，美國)。通過每隔15秒鐘向未受精卵母細胞施加-20mV測試電位，產生T-型電流，其電位固定在-90mV處。通過對藥物處理前後的電位進行比較，計算阻滯百分數。結果列於表2。
試驗實施例2HEK 293細胞的培養方法以及用電生理方法測定T-型鈣通道活性的方法在補充10％胎牛血清(FBS)和1％青黴素/鏈黴素(v/v)的Dulbecco’s改性Eagle’s介質(DMEM)中，在36.5℃加溼培養箱(95％空氣-5％CO2)中培養HEK 293細胞。每隔3至4天用新鮮介質更換培養液，且每周將培養的細胞進行次代培養。此時，將培養液用G-418(0.5mg/ml)溶液處理，使只表達α1G-T型鈣通道的HEK 293細胞能夠生長。當次代培養時，均將用於T-型鈣通道活性分析的細胞在塗有聚-L-賴氨酸(0.5mg/ml)的蓋玻片上進行培養，且在培養2至7天後記錄其鈣通道活性。單細胞水平的T-型鈣通道電流採用EPC-9放大器(HEKA，德國)，按照電生理全細胞膜片鉗方法進行測定。此時，應用細胞外液[140mM NaCl，2mM CaCl2，10mM HEPES(pH 7.4)]和細胞內液[KCl 130mM，HEPES 10mM，EGTA 11mM，MgATP 5mM(pH 7.4)]。由T-型鈣通道活化導致的向內電流，根據低電流激活的T-型鈣通道規程(protocol)進行測定。當通過插入一個電阻為3～4MΩ的微玻璃電極而將細胞轉化成全細胞記錄模式時會產生這種電流，該電極充有細胞內液，插入單細胞中，每隔10秒鐘在-30mV(50ms持續時間)下進行去極化，使固定膜電位達到-100mV。
試驗實施例3採用電生理方法篩選T-型鈣通道阻滯劑的方法為了確證試驗實施例2中所使用的細胞和方法是否是一種合適的選擇T-型鈣通道阻滯劑的篩選系統，將實施例2中所得結果與發表的文獻(Monteil，A.等，J.Biol.Chem.275，6090-6100，2000)中所報導的α1G-T型鈣通道研究結果進行比較。從圖1中可見，既然本發明篩選系統顯示1)在-30mV的低電壓下被最大激活(圖1)；2)激活電流的快速激活-滅活(圖2)；以及3)與被作為T-型鈣通道阻滯劑的Ni2+和咪拉地爾具有相同的IC50(圖3和圖4)，因而證實其適合於篩選T-型鈣通道阻滯劑。因此，受試化合物對T-型鈣通道的抑制效果按照本發明篩選系統進行如下測試。將每個化合物溶於100％二甲基亞碸(DMSO)中配成10mM原液。對T-型鈣通道電流的抑制效果通過將原液稀釋1000倍配成10μM的樣品溶液(含0.1％DMSO)進行測定。將細胞用含有細胞外液的濃度為10μM的每種化合物處理30至60秒鐘。然後，計算化合物所導致的峰電流的抑制百分數，如圖5所示。
試驗實施例4採用MTT分析法分析T-型鈣通道阻滯劑的細胞毒性為了分析HEK 293細胞中T-型鈣通道阻滯劑的細胞毒性，進行如下MTT分析試驗。將培養的HEK 293細胞用10μM和100μM濃度的每一種化合物進行處理。此時，用溶劑(即0.1％DMSO)處理的細胞作為陰性對照，用H2O2(125μM)處理引發細胞毒性的細胞作為陽性對照。用藥物處理6小時後，將細胞用50μl溶於pBS的MTT(1mg/ml)處理4小時。然後，離心反應混合物，除去上清液，把這樣得到的甲晶體溶於100μl的DMSO中。用自動分光光度板讀數器在560nm處測定溶液的吸光度。結果，所有對HEK 293細胞顯示50％或更強抑制活性的化合物在10μM濃度下沒有顯示出任何細胞毒性，一些化合物僅僅在高濃度(10OμM)下顯示出細胞毒性(圖6)。
本發明化合物對非洲蟾蜍未受精卵母細胞(α1H)和HEK 293細胞(α1G)中T-型鈣通道抑制效果的測定結果匯總在表2中。
表2
作為對照的咪拉地爾的鈣通道抑制效果按照本發明活性篩選方法進行測定。如圖2所示，咪拉地爾對非洲蟾蜍受精卵母細胞(α1H)顯示86％的抑制效果(100μM)，對HEK293細胞(α1G)顯示95.9％的抑制效果(10μM，IC50＝0.84μM)。同時，本發明的一個化合物KYS05001，對非洲蟾蜍受精卵母細胞(α1H)顯示77％的抑制效果(100μM)，對HEK 293細胞(α1G)顯示90.1％的抑制效果(10μM，IC50＝0.9μM)。此外，KYS05041和KYS05042對非洲蟾蜍受精卵母細胞(α1H)分別顯示84.7％和80.5％的抑制效果(100μM)，對HEK 293細胞(α1G)分別顯示89.9％和89.0％的抑制效果(10μM)。它們的IC50值分別為0.25μM和0.20μM。因此，當對IC50進行比較時，KYS05001與咪拉地爾幾乎具有相同的鈣通道抑制效果，而KYS05041和KYS05042比咪拉地爾的鈣通道抑制效果分別強3.4和4.2倍。
試驗實施例5確證化合物對其它離子通道的選擇性為了測定本發明化合物對其它離子通道的選擇性，用MPG(主骨盆神經節)按照常規方法(Lee，J.-H.等，J.Neurophysiol.2002，87，2844-2850)，對KYS05001、KYS05041和KYS05042對Na+通道和高電壓-激活Ca2+通道(HVA)的抑制效果進行測定。
用平均體重為約250g的雄性Sprague-Dawley大鼠作為試驗動物。用戊巴比妥鈉(50mg/kg，i.p.)將大鼠麻醉以後，立即切開腹部。提取前列腺左側的MPG，然後轉移至冷(4℃)Hank’s平衡鹽溶液(HBSS，GibcoBRL)中。分離出包裹神經節的結締組織，用快刀小心地在剝離出的神經節上切一個小口。然後將神經節在補充了0.7mg/ml膠原酶(D型)、0.3mg/ml胰蛋白酶以及0.1mg/ml I型DNA酶的10ml改性Earle’s平衡鹽溶液(EBSS，pH7.4，GibcoBRL)中，在35℃下培養1小時(Zhu等，J.Physiol.Lond.1995，489，363～375)。此時，向EBSS中加入3.6g/l的葡萄糖和10mM HEPES。培養完成後，振搖培養瓶將細胞簇分離成單個神經細胞，並在臨床離心機(International Equipment Company，MA，美國)中，於100rpm下進行離心。將分離的單個神經細胞於補充於10％胎牛血清、1％谷醯胺和1％青黴素/鏈黴素的MEM(GibcoBRL)中再混懸。然後，將其鋪在塗有聚-L-賴氨酸的聚苯乙烯培養皿(35mm)上。將培養皿置於加溼培養箱(95％空氣-5％CO2)中在37℃下進行培養，分出細胞後在24小時內將其用於下面的試驗。
電壓依賴性鈣電流和鈉電流應用膜片鉗放大器(Axopatch 1D，AxonInstruments，Foster City，CA，美國)，按照典型的膜片鉗方法以全細胞破裂構造(whole-cell ruptured configuration)(Hamill等，Pflügers Arch.1981，391，85-100)進行記錄。電極由硼矽酸鹽玻璃毛細管(外徑1.65mm，內徑1.2mm，Corning 7052，Garner Glass Co.，Claremont，CA，美國)使用P-97 Flaming-Brown微量移液管拉制儀(Sutter Instrument Co.，Novato，CA，美國)製成，並用顯微拉制儀加熱使鑄造光滑。電極充滿液體後，顯示電阻為1～3MΩ，將其用於以下試驗。將含有神經細胞的培養皿置於倒裝顯微鏡上，使細胞外液以約1～2ml/分鐘的流速流入培養皿中。用放大器將膜電容和串聯電阻用80％或更大進行校正。採用裝在Macintosh計算機中的S4軟體(由Dr.Stephen R.Ikeda，National Institute on Alcohol Abuse和Alcoholism，NIH，USA提供)進行電壓的產生和鈣電流的記錄，該計算機與模擬/數字轉換器(Digidata1200，Axon Instruments Co.)相聯。把經過2～5kHz低頻段濾過器的鈣電流存儲在Macintosh計算機中，並通過IGOR PRO(Wave-Metrics，Lake Oswego，OR，U.S.A)進行分析。所有試驗均在20～22℃的室溫下進行。
用於測定鈣電流的電極充滿含有N-甲基-D-葡糖胺(NMG)甲磺酸鹽(MS)120mM、20mM四乙基銨(TEA)-MS、20mM HCl、11mM EGTA、10mMHEPES、1mM CaCl2、4mM MgATP、0.3mM Na2GTP和14mM三-磷酸肌酸(pH7.2，290mOsm)的溶液。細胞外輸注液包括140mM MS、145mM TEA-OH、10mM HEPES、15mM葡萄糖、10mM CaCl2和0.0003mM河豚毒素(TTX，pH7.4，320mOsm)。用於測定鈉電流的電極充滿含有30mM NaCl、140mMNMG-MS、11mM EGTA、10mM HEPES、1mM CaCl2、4mM MgATP和0.3mMNa2GTP(pH 7.2，290mOsm)的溶液。細胞外輸注液包括50mM NaCl、90mMTEACl、10mM HEPES、15mM葡萄糖、10mM CaCl2和10mM MgCl2(pH 7.4，320mOsm)。
結果匯總於表3。
表3

從表3可見，KYS05001、KYS05041和KYS05042對鈣通道比對鈉通道具有更高的選擇性。而且，當對鈣通道亞型的選擇性進行測定時，KYS05041和KYS05042顯示相對較小的選擇性。這是因為它們對T-型(LVA)和N-型(HVA)鈣通道都能夠抑制。然而，KYS05001顯示出更高的選擇性，其僅僅選擇性地抑制T-型(LVA)通道。
權利要求
1.化學式1的3，4-二氫喹唑啉衍生物或其鹽 其中，n為1至4的整數d；R1選自氫、羥基、滷素、硝基、C1-C8烷基、C3-C6環烷基、C2-C6鏈烯基、C2-C6炔基、取代或未取代的芳基和雜芳基、C1-C6烷氧基、C3-C6環烷氧基、(芳基或雜芳基)氧基、C1-C6硫代烷氧基、C3-C6環硫代烷氧基、(芳基或雜芳基)硫代氧基以及氨基；R2為C1-C6烷基、C3-C6環烷基、C1-C6烷氧基烷基、C3-C6環烷氧基烷基、C1-C6鏈烯基；取代或未取代的芳基和雜芳基；4-嗎啉基；4位上隨機取代的哌嗪基；1-吡咯烷基；1-哌啶基；或-NR1R2，其中R1和R2各自獨立地選自C1-C6烷基、C3-C6環烷基、取代或未取代的芳基和雜芳基；R3選自C1-C6烷基、C3-C6環烷基、C1-C6烷氧基烷基、C3-C6環烷氧基烷基、取代或未取代的芳基和雜芳基；R4為X-(CH2)n-Y(NH)o-S(O)m-Z，其中X為氧或氮；n為1至4的整數；Y為取代或未取代的C3-C6環烷基、芳基或雜芳基；o為0或1的整數；m為0至2的整數；Z選自取代或未取代的C3-C6環烷基、芳基或雜芳基；在o為0的條件下，-S(O)m-Z不存在。
2.權利要求1的3，4-二氫喹唑啉衍生物或其鹽，其為4-(N-苄基乙醯氨基)-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氫喹唑啉。
3.權利要求1的3，4-二氫喹唑啉衍生物或其鹽，其為4-(N-苄基乙醯氨基)-3-苯基-2-(嗎啉-1-基)-3，4-二氫喹唑啉。
4.權利要求1的3，4-二氫喹唑啉衍生物或其鹽，其為4-(N-苄基乙醯氨基)-3-苯基-2-(4-甲基哌嗪基)-3，4-二氫喹唑啉。
5.權利要求1的3，4-二氫喹唑啉衍生物或其鹽，其為4-[N-(4-硝基苄基)乙醯氨基)-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氫喹唑啉。
6.權利要求1的3，4-二氫喹唑啉衍生物或其鹽，其為4-{N-[4-(4-甲基苯磺醯氨基)苄基]乙醯氨基}-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氫喹唑啉。
7.權利要求1的3，4-二氫喹唑啉衍生物或其鹽，其為4-{N-[4-(4-氟苯磺醯氨基)苄基]乙醯氨基}-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氫喹唑啉。
全文摘要
本發明涉及作為T－型鈣通道阻滯劑的3，4－二氫喹唑啉衍生物及其製備方法。本發明進一步涉及含有上述化合物的組合物。含有本發明的3，4－二氫喹唑啉衍生物的組合物可以通過阻滯T－型鈣通道有效地用於預防或治療心絞痛、高血壓、心肌疾病、疼痛和癲癇。
文檔編號A61P25/04GK1660820SQ20041009544
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月27日 優先權日2004年2月24日
發明者李龍燮, 李在烈, 林惠媛 申請人:韓國科學技術研究院