甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒及其製備方法

2023-04-30 08:46:51

專利名稱：甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒及其製備方法
甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒及其製備方法本發明涉及一種免疫分析醫學中的檢測試劑盒，具體設計一種甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒及其製備方法。該試劑盒結合了免疫磁微粒分離技術和突光免疫分析技術，檢測範圍寬，靈敏度高，抗幹擾強。甲狀腺疾病是常見的內分泌疾病，全球患病人數已超3億，中國患者超過6. 7千萬，且呈逐年增加。最新的《中國十城市甲狀腺病流行病學調查》統計結果顯示，我國十城市的甲亢患病率為3.7%、甲減患病率為6.5%、甲狀腺結節患病率為18.6%。因甲狀腺疾病具有多發性，臨床症狀多樣性及複雜性的特點，血清甲狀腺激素測定在臨床中應用十分廣泛。本試劑盒用於定量檢測人血清中的總甲狀腺素(TT4)的含量。 T4是甲狀腺分泌的主要產物，也是構成下丘腦-垂體前葉-甲狀腺調節系統完整性不可缺少的成份。對合成代謝有影響作用。T4由二分子的二碘酪氨酸(DIT)在甲狀腺內偶聯生成。T4與甲狀腺球蛋白結合貯存在甲狀腺濾泡的殘腔中，在TSH的調節下分泌釋放。T4及其相關的甲狀腺激素T3負責對人體中各種生化過程進行調節，這些過程是正常新陳代謝和神經活動的基礎。儘管T3具有很強的生物能量，但T4通常以約50倍於循環T3的形式存在於人血清中。血清中99%以上的T4以與其它蛋白質結合的形式存在，不具生物學活性。由於血清中運輸蛋白質的濃度易受外源性和內源性作用的影響，因此，在檢測血清T4濃度的過程中需考慮到結合蛋白質的狀況。如果忽略這一點，會導致反映甲狀腺代謝狀況檢測的錯誤結果。血清總T4檢測是最早應用於臨床檢測甲狀腺功能的甲狀腺激素，對於評價甲狀腺功能可以說功不可沒。正常成人血清TT4水平為64-154nmol/L(5-12ug/dl)。T4水平升高見於甲亢，高TBG血症(妊娠，口服雌激素及口服避孕藥，家族性)，急性甲狀腺炎，亞急性甲狀腺炎，急性肝炎，肥胖症，應用甲狀腺激素時，進食富含甲狀腺激素的甲狀腺組織等。水平降低可見於甲減，低TBG血症(腎病症候群，慢性肝病，蛋白丟失性腸病，遺傳性低TBG血症等)，全垂體功能減退症，下丘腦病變，劇烈活動等。T4測定可用於甲亢、原發性和繼發性甲減的診斷以及TSH抑制治療的監測等，具有較高的臨床診斷價值。免疫學測定是以抗體-抗原的特異性識別、抗體標記技術和示蹤技術為基礎的定量技術。在腫瘤標誌物的體液檢測中具有廣泛應用。現有的甲狀腺激素的測定方法有平衡透析法、放射免疫法、酶聯免疫吸附分析法、時間分辨螢光免疫分析法、電化學發光檢測及微孔板酶促化學發光免疫分析法等。但這些方法都具有一定局限性，，如平衡透析法操作步驟繁瑣，操作時間長；放射免疫分析方法的試劑具有放射性，會對操作人員的身體健康產生影響，操作不能實現自動化；酶聯免疫分析方法靈敏度低，步驟繁瑣；時間分辨螢光免疫分析法與電化學發光檢測法都需要較為昂貴的稀土元素作為試劑，不利於大範圍的推廣使用；微孔板酶促化學發光免疫分析法則受到固相載體表面積的限制，無法實現較寬範圍的檢測。
在實際的免疫檢測中，由於待測樣品中所含的雜質成分較多，一定程度上影響了檢測靈敏度和準確性，所以從複雜的樣品基質中快速分離、純化出目的待測無，是臨床檢驗工作者面臨的難題之一。免疫磁微粒技術是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學偶聯等方法包被上具有特異性親合力的各種免疫活性物質(抗原或抗體)，使其致敏為免疫磁微粒，具有分離速度快、效率高、可重複性好；操作簡單；不影響被分離細胞或其它生物材料的生物學性狀和功能等特點，在外加磁場作用下定向運動，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化。免疫磁微粒分析技術與螢光發光免疫分析技術結合檢測待測物，可大大提高檢測 的靈敏度和準確性，它以毫米級磁微粒為載體，利用表面有機物提供的羧基活性集團與蛋白質氨基共價結合，採用抗體進行「搭橋」成免疫磁微粒，可進行抗原、抗體反應。該技術的新穎之處有(I)採用微小的磁微粒作為固相可增加包被表面積，從而增加了抗原抗體的有效包被量，不僅節省了原料，而且有助於建立寬分為的免疫檢測方法，尤其適合於高濃度臨床樣本的測定，避免HOOK效應的發生；(2)利用順磁鐵微粒為固相載體，外包抗原或抗體，增加抗原、抗體的接觸面積及底物發光面積，提高反應的靈敏度，並採用旋轉磁場使磁微粒起攪拌作用及分離結合抗原-抗體與游離抗體的作用。鑑於國內化學發光和電化學發光分析儀器幾乎全為國外廠商生產，而絕大多數廠商採用儀器加試劑盒捆綁銷售的壟斷模式，並在儀器中人為設置排它性檢測程序，從而抬高了配套試劑盒價格，增加了檢測成本。而時間分辨螢光免疫分析法在我國的起步較晚，很多測量儀器及試劑還要依靠進口 ；很多國產分析軟體的編制還存在操作繁瑣，功能不全，界面不簡潔等缺點。本發明為了克服現有技術的不足，提供了一種甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒及其製備方法。為了實現上述目的，本發明設計了一種甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒，包括甲狀腺素系列標準品，T4-IgG包被的磁微粒，鹼性磷酸酶標記的甲狀腺素抗體，螢光發光底物，樣本稀釋液，濃縮洗漆液，還包括一個反應測試杯。所述反應測試杯為不透明聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯中的一種材料製成。所述甲狀腺素系列標準品為多克隆抗體或單克隆抗體。所述的螢光發光底物，包括凍乾粉和底物溶解液；其中，底物凍乾粉為磷酸-4-甲基傘形酮；底物溶解液為2-氨基-2甲基-I丙酮。所述濃縮洗滌液為，濃度0. 01-0. 05M、pH值為7. 0-7. 6的磷酸鹽緩衝液，且緩衝液中含有0. 01-0. 05%的吐溫20和終濃度為8-14g/L的氯化鈉。所述樣本稀釋液為磷酸鹽緩衝液。一種甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒的製備方法，採用如下工藝步驟A)甲狀腺素系列標準品的製備用去激素人血清甲狀腺素純品稀釋成標準品，其濃度為 0-360ng/ml ；B)T4-IgG包被磁微粒的製備將粒徑為0. 5-lmm的磁微粒靜置於含1_1. 5ug/mlT4-IgG，濃度為0. OlM的碳酸鹽緩衝液中，室溫混勻10-30min後37°C過夜，取出，用稀釋好的濃縮洗滌液清洗1-3次，4°C封閉液過夜，洗1-3次並抽真空乾燥，平均分配到反應測試杯中；C)鹼性磷酸酶標記的甲狀腺素抗體標記物的製備T4單克隆抗體採用過碘酸鈉法與鹼性磷酸酶交聯，用酶標記物稀釋液進行稀釋，稀釋比例為I : 3000，製成酶標工作液；D)螢光發光底物的製備去離子水中含0. 01-0. 05mM磷酸_4_甲基傘形酮，製成凍乾粉；底物溶解液為，濃度0. 1-0. 5M、pH值9. 0-11. 0的2-氨基-2-甲基_1丙酮；E)樣本稀釋液的製備濃度為0. 01-0. 05M的磷酸鹽緩衝液，pH值為7. 0-7. 6。F)濃縮洗滌液的製備向步驟E中的磷酸鹽緩衝液中加入體積百分比為0. 01-0. 05%吐溫20和終濃度為8-14g/L的氯化鈉；
G)分裝步驟取步驟C中製得的酶標工作液100ul-200ul平均分配到步驟B中含有磁微粒的反應杯中，並凍幹封口 ；H)將上述試劑組裝成試劑盒。所述步驟B中,磁微粒為直徑0. 05-lmm粒徑、四氧化三鐵內核、表面包裹帶有氨基活性基團的聚合物。所述步驟B中，封閉液是含有質量百分比濃度為0. 05 % -0. 5 %明膠和0. 05% -0. 2%疊氮鈉的pH為7. 4的濃度為0. 05mol/L的磷酸鹽緩衝液。所述步驟C中，酶標記物稀釋液為，含有0. 4mg/ml ANS和0. 05% BSA的Tris-CL緩衝液，緩衝液的PH值為8. O。本發明同現有技術相比，使用的磁微粒具有超順磁、高分散、表面積大的特點。對樣本的前處理要求低，樣品前處理過程簡單快捷，可高速、大通量的檢測大批樣本，便於操作和生產。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解這些實施例僅用於說明本發明不用於限制本發明的範圍。實施例,一、甲狀腺素磁微粒突光發光免疫分析試劑盒的製備A)甲狀腺素系列標準品的製備(I)將60ml的正常人血清等份裝入四個容量瓶中，然後分別加入8. Og活性炭，倒置用漩渦振蕩器混合均勻，振蕩8h後，以6000rpm，離心20min，將上清過濾，向濾液中加入體積百分比濃度為0. 05% Proclin-300，冷凍保存。(2)向上述步驟中得到的去激素人血清中加入不同量的T4純品稀釋成標準品，經電化學發光測定濃度後，分裝成濃度為0ng/ml, 15ng/ml,45ng/ml,90ng/ml, 180ng/ml和360ng/ml的6瓶T4校準品。B) T4-IgG包被磁微粒的製備將粒徑為0. 5-lmm的磁微粒靜置於含I. 5ug/ml T4_IgG，濃度為0. OlM的碳酸鹽緩衝液中，室溫混勻30min後37°C過夜，取出，用稀釋好的濃縮洗滌液清洗I次，4°C封閉液過夜，洗3次並抽真空乾燥，每反應測試杯中放置10粒。C)鹼性磷酸酶標記的甲狀腺素抗體標記物的製備
用含有0. 4mg/ml ANS和0. 05 % BSA的Tris-CL，pH8. 0緩衝液配製成酶標稀釋液。T4單克隆抗體用過碘酸鈉法與鹼性磷酸酶交聯。並加入如上述稀釋液，以I 3000稀釋成酶標工作液。D)螢光發光底物的製備在 去離子水中加入濃度為0. OlmM磷酸_4_甲基傘形酮，冷凍乾燥，製成底物凍乾粉。在去離子水中加入濃度為0. IM 2-氨基-2-甲基-I丙酮，pH10. 0，製成底物溶解液。E)樣本稀釋液的製備濃度為0. 05M的磷酸鹽緩衝液，pH值為7. 2。F)濃縮洗滌液的製備向步驟E中的磷酸鹽緩衝液中加入體積百分比為0. 05%吐溫20和終濃度為14g/L的氯化鈉。G)分裝步驟取步驟C中製得的酶標工作液150ul平均分配到步驟B中含有磁微粒的反應杯中，並凍幹封口。H)將用上述方法製備的各組分分裝並裝入試劑盒中。以檢測100個樣本的試劑盒為例，包括(I) T4系列標準品共6瓶，Iml/瓶。(2)內含有反應體系的密閉反應杯100個。(3)樣本稀釋液I瓶，IOOml/瓶。(4)螢光發光底物凍乾粉I瓶，淨重20g ;底物溶解液I瓶IOOml ;在使用前將底物溶解液倒入螢光發光底物凍乾粉瓶中，混合均勻。(5)濃縮洗滌液一瓶100ml，使用時用去離子水稀釋20倍。二、本發明試劑盒的使用方法如下I)試劑的準備A.將試劑盒置室溫(18_26°C )平衡20分鐘。B.從試劑盒中取出濃縮洗滌液，用去離子水以I : 20配製成工作液。C.發光底物凍乾粉充分溶解於底物溶解液中。2)樣本準備取人空腹晨血清樣本,3000rpm離心IOmin,去上層血清進行分析。3)操作步驟A.取出所需數量的反應杯置於板架上。B.加入標準品1-6和待測樣本，每反應杯20ul。C.加入樣本稀釋液每反應杯150ul。D.置於磁力混合分離器上37°C孵育IOmin。E.棄去液體，每反應杯加入稀釋後的濃縮洗滌液500ul，反覆洗滌五次，去洗液。F.每反應杯加入200ul螢光發光底物。G.於螢光分光光度計中檢測FU值。4)實驗結果的計算以T4系列標準品濃度對數值為橫坐標，FU值Logit轉換為縱坐標，進行直線回歸，繪製出標準曲線，將待測樣本的FU值代入方程即可求出對應濃度值。
實驗結果如下按照本領域中常規的製造及檢定規程對本實施例中製備的試劑盒進行檢定，結果如下I、試劑盒靈敏度測定平均測定10個Stl標準點，計算其FU的平均值和標準偏差，帶入線性方程，計算出對應的濃度值，並重複該操作5次，得到該試劑盒的最低檢出限，本試劑盒的最低檢測限為3ng/ml。2、試劑盒精密度實驗將實施例I製備的試劑盒分別取三批進行精密度實驗，分別測定低、中、高三種不同濃度的血清，平行測定10次，得出每次分析的批內和多次分析的批間變異。其批內和批間變異係數均小於15%。3、試劑盒特異性實驗
權利要求
1.一種甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒，包括甲狀腺素系列標準品，T4-IgG包被的磁微粒，鹼性磷酸酶標記的甲狀腺素抗體，螢光發光底物，樣本稀釋液，濃縮洗滌液，還包括一個反應測試杯。
2.根據權利要求I所述的甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒，其特徵在於所述反應測試杯為不透明聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯中的一種材料製成。
3.根據權利要求I所述的甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒，其特徵在於所述甲狀腺素抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。
4.根據權利要求I所述的甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒，其特徵在於所述的螢光發光底物，包括凍乾粉和底物溶解液；其中，底物凍乾粉為磷酸-4-甲基傘形酮；底物溶解液為2-氨基-2甲基-I丙酮。
5.根據權利要求I所述的甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒，其特徵在於所述濃縮洗滌液為，濃度O. 01-0. 05M、pH值為7. 0-7. 6的磷酸鹽緩衝液，且緩衝液中含有O.01-0. 05%的吐溫20和終濃度為8-14g/L的氯化鈉。
6.根據權利要求I所述的甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒，其特徵在於所述樣本稀釋液為磷酸鹽緩衝液。
7.一種甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒的製備方法，採用如下工藝步驟 A)甲狀腺素系列標準品的製備用去激素人血清稀釋甲狀腺素純品，其濃度為0_360ng/ml ； B)T4-IgG包被磁微粒的製備將粒徑為O. 5-lmm的磁微粒靜置於含1_1. 5ug/mlT4-IgG，濃度為O. OlM的碳酸鹽緩衝液中，室溫混勻10-30min後37°C過夜，取出，用稀釋好的濃縮洗滌液清洗1-3次，4°C封閉液過夜，洗1-3次並抽真空乾燥，平均分配到反應測試杯中； C)鹼性磷酸酶標記的甲狀腺素抗體標記物的製備T4單克隆抗體採用過碘酸鈉法與鹼性磷酸酶交聯，用酶標記物稀釋液進行稀釋，稀釋比例為I : 3000，製成酶標工作液； D)螢光發光底物的製備去離子水中含O.01-0. 05mM磷酸-4-甲基傘形酮，製成凍乾粉；底物溶解液為，濃度O. 1-0. 5M、pH值9. 0-11. O的2-氨基-2-甲基_1丙酮； E)樣本稀釋液的製備濃度為O.01-0. 05M的磷酸鹽緩衝液，pH值為7. 0-7. 6。
F)濃縮洗滌液的製備向步驟E中的磷酸鹽緩衝液中加入體積百分比為O.01-0. 05%吐溫20和終濃度為8-14g/L的氯化鈉； G)分裝步驟取步驟C中製得的酶標工作液100ul-200ul平均分配到步驟B中含有磁微粒的反應杯中，並凍幹封口 ； H)將上述試劑組裝成試劑盒。
8.根據權利要求7所述的甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒的製備方法，其特徵在於所述步驟B中，磁微粒為直徑O. 05-lmm粒徑、四氧化三鐵內核、表面包裹帶有氨基活性基團的聚合物。
9.根據權利要求7所述的甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒的製備方法，其特徵在於所述步驟B中，封閉液是含有質量百分比濃度為0.05%-0.5%明膠和O. 05% -O. 2%疊氮鈉的pH為7. 4的濃度為O. 05mol/L的磷酸鹽緩衝液。
10.根據權利要求7所述的甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒的製備方法，其特徵在於所述步驟C中，酶標記物稀釋液為，含有O. 4mg/ml ANS和O. 05% BSA的Tris-CL 緩衝液，緩衝液的PH值為8. O。
全文摘要
本發明涉及一種免疫分析醫學中的檢測試劑盒，具體設計一種甲狀腺素磁微粒螢光發光免疫分析試劑盒，包括甲狀腺素系列標準品，T4-IgG包被的磁微粒，鹼性磷酸酶標記的甲狀腺素抗體，螢光發光底物，樣本稀釋液，濃縮洗滌液，還包括一個反應測試杯。本發明同現有技術相比，使用的磁微粒具有超順磁、高分散、表面積大的特點。對樣本的前處理要求低，樣品前處理過程簡單快捷，可高速、大通量的檢測大批樣本，便於操作和生產。
文檔編號G01N33/543GK102662068SQ20121011685
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月19日 優先權日2012年4月19日
發明者曹紋野, 李子樵 申請人:上海藍怡科技有限公司