用於製備馬來醯亞胺聚合物的方法

2023-04-30 02:27:46 2

專利名稱：：用於製備馬來醯亞胺聚合物的方法
技術領域：
：本發明涉及用於製備帶有馬來醯亞胺官能團的水溶性和非肽的聚合物的方法，特別是用於製備馬來醯亞胺封端的聚(乙二醇)聚合物的方法，並且涉及包括所述聚合物的組合物和製劑。發明背景馬來醯亞胺是具有多用途的衍生物，其廣泛地用於化學合成、生物和藥理用途。馬來醯亞胺作為麥可受體，易與巰基反應形成穩定的硫醚鍵。與其中同時存在巰基和胺基的蛋白質等的這種反應被廣泛應用。在大約為中性的pH下，馬來醯亞胺具有高度的選擇性，巰基的反應性比胺基的反應性高約l,OOO倍(Smyth等，Biochem.J.，91,589，1964'，Gorin等.Arch.Biochem.Biophys.U^，593,1966;Partis等，J.ProteinChem，2，263-277，1983)。在8或8以上的較高pH值下，馬來醯亞胺與胺基的反應開始具有顯著的竟爭性(Brewer和Riehm，Anal.Biochem.18，248，1967)。儘管馬來醯亞胺是公知的麥可受體，但因其反應性還用作親雙烯體(Baldwin等，TetrahedronLett.，32，5877，1991;Philp和Robertson,J.Chem.Soc.,Chem.Commun.，1998，879;Bravo等，Heterocycles，53，81，2000)和親偶極物(Grigg等，J.Chem.Soc.,PerkinTrans.1，1988，2693;Ko,ikova等，Collect.Czech.Chem.Commun.,57，1521，1991;Philp和Booth,TetrahedronLett.，39，6987，1998)。聚合::例如，i常使用親^性聚合物"聚(乙二醇)"(縮寫為''PEG")來軛合生物活性分子，而使得所述生物活性分子可溶於水性介質(Harris等."Poly(EthyleneGlycol)ChemistryandBiologicalApplications"，ACSSymposiumSeries,ACS,Washington,DC，1997)。PEG-馬來醯亞胺是適合與生物活性分子上的巰基或胺基反應的反應性聚合物的例子。來醯亞胺基團的小的連接體分子相連，所述連接體分子大多數在商業上可獲得。一些已知的PEG馬來醯亞胺及其生產方法具有許多缺點。例如，通常採用兩種方法中的一種來從PEG胺直接製備所謂的"無連接體，，PEG馬來醯亞胺，即，PEG和馬來醯亞胺基團之間無連接基團(參見美國專利第6,602,498號)。但是，這些方法一般得到相對不純的產物，原因如下將討論的，在終產品中存在數量相當多的含有開環馬來醯胺酸的衍生物。在美國專利第6,602,498號所公開的第一種方法中，水溶性和非肽的聚合物骨架與馬來酐反應形成開環的羧酸醯胺中間體(馬來醯胺酸中間體)。然後在第二步驟中，通過在乙酸酐和乙酸鹽(如乙酸鈉或乙酸鉀)存在下將所述中間體加熱到約50。C至約140。C的溫度大約0.2小時至大約5小時，而閉合所述中間體的環。將這種二步法概括於以下給出的反應圖解I中步驟i聚合物-nh2聚合物一n步驟2oh一聚合物—S、乙酸酐加熱聚合物-n:《反應圖解I由該方法製備的、含有馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物粗品的組合物可以包括大量開環的馬來醯胺酸中間體。所述開環的馬來醯胺酸中間體的外觀的主要成因在於加熱步驟，尤其是在乙酸酐中產生或汙染任何酸性物質時。在這些條件下，如果可能的話，就會使c-c鍵異構化並由此造成環閉合困難。因此，希望通過某些能夠去除雜質的方法來純化聚合物產品，其中所述方法如離子交換色鐠法。然而，馬來醯亞胺環系統不能耐受具有鹼性或親核部位的色譜柱，由此使得純化更加困難。該合成途徑的第二個問題源於PEG胺的使用。同樣地，Sakanoue等人的美國專利申請乂>布文本No.2003/0065134Al描述了相關的方法，不同之處在於其中生成的PEG-馬來醯亞胺在最後的PEG氧與馬來醯亞胺氮之間所包括的是丙烯基而不是乙烯基。但是，Sakanoue等人描述的方法面臨如上所述的相同問題。此外，該參考文獻教導PEG胺一般是通過使用氬和鎳催化劑來還原腈基而製備的，其可能因胺產物與亞胺中間體之間的反應而導致引入另外的雜質。在美國專利第6，602，498號所描述的第二種合成途徑("含水的N-烷氧羰基馬來醯亞胺途徑")中，N-烷氧羰基馬來醯亞胺與聚胺反應形成馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物產品。開環和閉環反應在以上描述的相似條件下進行。該反應在緩慢增加的溫度梯度下於pH約8.5的碳酸氫鈉水性緩沖液中進行。然而，馬來醯亞胺基團在那些條件下不穩定，其被水解為馬來醯胺酸。因此，在合成期間存在兩種平行反應馬來醯亞胺環的形成和馬來醯亞胺環的水解。用於解決此問題的一種方法是在形成最大量的馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物產物的同時，停止該反應。儘管這種方法理論上顯得有道理，但是因改變反應溫度而使得其在商業實踐上幾乎是不可能的任務，其中很難在連續生產批次間重複實現該溫度梯度。例如，發現某些馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物在商業上的連續批次具有的馬來醯亞胺純度為65%至80%，馬來醯胺酸的含量為約20%至35%。同樣，因馬來醯亞胺基團對離子交換柱官能團的敏感性，而使得色譜法並不是可行的選擇。此外，即使可能再現地控制此溫度梯度並在適當的時間停止反應，該方法也需要中止監控和關閉另外的設備(如，熱電偶、加熱套，等等)，從而增加了該方法的複雜性。國際專利公布文本W005/056636描述了用於製備馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的其他方法。在一種方法(以下標為"反應圖解II")中，包括離去基團("IX")的聚合物與亞胺鹽(顯示為三環醯胺的鉀鹽)經由親核取代反應，形成聚合物中間體，然後通過反向第爾斯-阿爾德反應得到馬來醯亞胺官能化的聚合物和呋喃。formulaseeoriginaldocumentpage11反應圖解II儘管以上顯示的反應利用相對簡單的官能化的聚合物和笫爾斯-阿爾德加成物試劑來反應形成所謂的"無連接體，，馬來醯亞胺(指馬來醯亞胺基團直接與聚合物相連)，但是該反應需要商業上不可獲得的試劑。儘管具有以上描述的方法，但是仍需提供其他用於製備馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的方法，以便例如可以使用最適於特定需求的方法。除了別的以外，認為本文描述的新方法提供了高收率的馬來醯亞胺封端的聚合物，並且該聚合物不含大量聚合雜質，特別是使用常規的純化技術(如離子交換色謙法)不能輕易除去的大量聚合物雜質。
發明內容在一個或多個實施方案中，提供了用於製備取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的方法，所述方法包括a)在大體上非水的條件下，將胺封端的水溶性聚合物與馬來醯亞胺試劑結合，以形成取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物；和aO任選地，分離所述取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物。在一個或多個實施方案中，提供了用於製備馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的方法，所述方法包括a)在大體上非水的條件下，將胺封端的水溶性聚合物與馬來醯亞胺試劑結合，以形成取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物；和b)在大體上非水的條件下，將所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物暴露於消除條件，從而得到馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物。在本發明的一個或多個實施方案中，提供了含有馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物，所述組合物由包括以下步驟的方法產生a)在大體上非水的條件下，將胺封端的水溶性聚合物與馬來醯亞胺試劑結合，以形成馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物；和b)在大體上非水的條件下，將所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物暴露於消除條件，從而得到含有馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物。在本發明的一個或多個實施方案中，提供了用於製備含有軛合物的組合物的方法，所述方法包括將含有巰基的生物活性劑與本文所提供的馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物結合，從而得到含有軛合物的糹且合物。在本發明的一個或多個實施方案中，提供了含有軛合物的組合物，所述組合物由包括以下步驟的方法產生將含有巰基的活性劑與本文所提供的含有馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物結合。在本發明的一個或多個實施方案中，提供了化合物，所述化合物為分離的形式，其具有以下結構formulaseeoriginaldocumentpage12'(式I)其中POLY是水溶性聚合物；(b)是0或1;其中存在的Xi是間隔部分；Y'是0或S;丫2是0或S;(a)是從1至20的整數；在各種情況下，R4蟲立地為H或有機基；在各種情況下，f獨立地為H或有機基；在各種情況下，R3獨立地為H或有機基；和在各種情況下，f獨立地為H或有機基。發明詳述在詳細地描述本發明的一個或多個實施方案之前，應理解的是本發明不受限於特定的聚合物、試劑等，因為這些可以改變。應注意的是，如本說明書和權利要求所使用的單數形式"一(a)"、"一(an)，，和"所述(the)"包括複數對象，除非上下文以其他方式清楚地指明。因此，例如，所提及的"聚合物"包括一種聚合物和兩種或多種相同或不同的聚合物，所提及的"乾燥劑，，是指一種乾燥劑和兩種或多種相同或不同的乾燥劑，等等。在描述和要求本發明的權利時，將依據以下給出的定義使用下列術語。如本文所使用的"PEG"、"聚乙二醇，，和"聚(乙二醇)"可互換。通常，依據本發明使用的PEG包括以下結構"-(OCH2CH2)n-，，，其中(n)是2至4000。如本文所使用的PEG還包括"-CH2CH2-0(CH2CH20)n-CH2CH2-，，和"-(OCH2CH2)n0-"，其取決於末端氧是否已被置換。應注意，遍及整個說明書和權利要求的術語"PEG"包括具有不同末端基團或"封端"基團的結構。術語"PEG"還指含有多數(即大於50%)的-0CH2CH廠或-CH2CH20-重複亞基的聚合物。就具體形式而言，PEG可以採用有待在下文更詳細描述的多種分子量中的任何數值和結構或幾何形狀，如"支鏈"、"直鏈"、"叉狀"、"多官能的"等等。術語"封端的"和"末端封端的"在本文可互換使用，其指具有封端部分的聚合物的末端或端點。儘管不是必需的，但是所述封端部分通常包括羥基或d-2。烷氧基，更優選Cw。烷氧基，還更優選Cw烷氧基。因此，封端部分的實例包括烷氧基(如曱氧基、乙氧基和苄氧基)和芳基、雜芳基、環、雜環，等等。必須注意的是，所述封端部分可以包括聚合物中末端單體[如，CH3(OCH2CH2)n-中的封端部分"甲氧基"]的一個或多個原子。此外，預想了前述每一種形式的飽和、不飽和、取代和未取代的形式。其次，所述封端基團還可以是矽烷。所述封端基團還可以有利地包括可檢測的標記物。當聚合物具有包括可檢測的標記物的封端基團時，與所述聚合物偶聯的聚合物和/或部分(如，活性劑)的數量或位置可以通過採用合適的檢測器進行測定。這樣的標記物包括，但不限於螢光增白劑、化學發光劑、酶標記中使用的部分、比色部分(如染料)、金屬離子、放射性部分等。合適的檢測器包括光度計、膜、分光計，等等。所述封端基團還可以有利地包括磷脂。當聚合物具有包括磷脂的封端基團時，其使得所述聚合物和得到的軛合物具有獨特的性能。示例性的磷脂包括，但不限於選自稱為磷脂醯膽鹼的磷脂類別的那些。具體的磷脂包括，但不限於選自由二月桂醯磷脂醯膽鹼、二油基磷脂醯膽鹼、二棕櫚基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、山蓊炔醯磷脂醯膽鹼(behe呵lphosphatidylcholine)、花生四烯酸基磷月旨醯膽械(arachidoylphosphatidylcholine)和印確月旨糹且成的糹且的秀卩些。如本文就聚合物描述的"非天然存在的"，是指自然界中完全不存在的聚合物。但是，非天然存在的聚合物可以含有天然存在的一個或多個單體或單體的片段，只要整個聚合物結構在自然界中不存在即可。如"水溶性聚合物，，中的術語"水溶性"，是指在室溫下可溶於水的任何聚合物。通常，在過濾後，水溶性聚合物透射的光是相同溶液過濾後透射的光的至少約75%，更優選至少約95%。以重量為基礎，水溶性聚合物在水中優選溶解至少約35%(按重量計)，更優選在水中溶解至少約50%(按重量計)，還更優選在水中溶解約70%(按重量計)，並且還更優選在水中溶解約85%(按重量計)。但是，所述水溶性聚合物最優選在水中溶解約95%(按重量計)或在水中完全上下文中水溶性聚合物(如PEG)的分子量，可以表示為數均分子量或重均分子量。除非另有說明，本文所有提及的分子量是指重均分子量。數均分子量和重均分子量的測定，均可釆用凝膠滲透色譜法或其他的液相色譜技術進行測量。還可以使用其他用於測量分子量值的方法，比如使用端基分析或測定依數性(如，冰點降低、沸點升高或滲透壓)來確定數均分子量，或使用光散射技術、超離心法或粘度測定法來確定重均分子量。本發明的聚合物通常為多分散(即，聚合物的數均分子量和重均分子量不相等)，其所具有的低多分散性值優選小於約1.2，更優選小於約1.15，還更優選小於約1.10,仍更優選小於約1.05,最優選小於約1.03。如本文所使用的，有時提及具有重均分子量或數均分子量的單種水溶性聚合物做出參考；這樣的提及應理解為是指由具有所述分子量的水溶性聚合物組合物得到的單種水溶性聚合物。當術語"活性"或"活化的"與特定的官能團一起使用時，是指容易與另一分子上的親電體或親核體反應的反應性官能團。這與那些為了發生反應而箭要強催化劑或極度不切實際的反應條件的基團(即，"非反應性"基團或"惰性"基團)大不相同。如本文所使用的術語"官能團"或其任何同義詞，是指包括其受保護的形式和未受保護的形式。如本文所使用的術語"間隔部分"、"鍵"或"連接體"，是指用來連接互連部分與活性劑或活性劑的親電體或親核體的原子或原子集合，所述互連部分如聚合物的末端。所述間隔部分是水解穩定的或者可包括生理上可水解的鍵或酶可降解的鍵。"烷基"是指烴鏈，其長度範圍一般為約1至15個原子。這樣的烴鏈優選但不是必須為飽和的，並且雖然一般優選直鏈，但是其可以為支鏈或直鏈。示例性的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、l-曱基丁基、l-乙基丙基、3-曱基戊基，等等。如本文所使用的"烷基"包括環烷基和含有環亞烷基的烷基。"低級烷基"是指含有1至6個碳原子的烷基，且可為直鏈或支鏈。低級烷基的非限制性實例包括甲基、乙基、正丁基、異丁基和叔丁基。"環烷基"是指飽和或不飽和的環狀烴鏈，其包括橋連的、稠合的或螺環化合物，優選由3至約12個碳原子構成，更優選由3至約8個碳原子構成。"環亞垸基"是指通過環狀的環系統中的任何兩個碳使鏈鍵合而插入烷基鏈的環烷基。"烷氧基"是指-0-R基團，其中R為烷基或取代的烷基，優選Cw烷基(如，曱氧基、乙氧基、丙氧基等)。例如，在"取代的烷基"中的術語"取代的"，是指使用一個或多個不相互幹擾的取代基取代的部分(如烷基)，所述不相互幹擾的取代基例如，但不限於烷基；C3—8環烷基，如環丙基、環丁基等；滷素，如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基；低級苯基；取代的苯基等。"取代的芳基"是指具有一個或多個不相互幹擾的取代基的芳基。對於苯環上的取代而言，所述取代基可以是任何取向(即，鄰、間或對)。"不相互幹擾的取代"是指在分子中存在時，通常不與所述分子內含有的其他官能團發生反應的那些基團。"芳基"是指分別具有5個或6個中心碳原子的一個或多個芳香環。芳基包括多個稠合的芳環(如萘基)或未稠合的芳環(如聯苯)。芳環還可以與一個或多個環烴、雜芳基或雜環稠合或不稠合。如本文所使用的"芳基"包括雜芳基。"雜芳基"是指含有1至4個雜原子的芳基，所述雜原子優選為硫、氧或氮，或其組合。雜芳環還可以與一個或多個環烴、雜環、芳基或雜芳環稠合。"雜環"或"雜環的"是指5-12個原子，優選5-7個原子的一個或多個環，其具有或沒有不飽和現象或芳香特徵，且具有至少一個不是碳的環原子。優選的雜原子包括硫、氧和氮。"取代的雜芳基，，是指具有一個或多個不相互幹擾的基團(如取代基)的雜芳基。"取代的雜環，，是指具有由不相互幹擾的取代基形成的一個或多個側鏈的雜環。如本文所使用的"有機基"應包括烷基、取代的烷基、芳基和取代的芳基。"親電體"和"親電基團"是指可以為離子的、具有親電中心(即莧電子(electronseeking)的、能夠與親核體反應的中心)的離子或原子或原子集合。"親核體"和"親核基團"是指可以為離子的、具有親核中心(即莧親電中心或能夠與親電體反應的中心)的離子或原子或原子集合。"生理上可裂解的"或"可水解的"鍵是指在生理條件下與水反應(即被水解)的鍵。優選的是在pH8、"。C下具有小於約30分鐘的水解半衰期的鍵。鍵在水中水解的傾向不僅取決於連接兩個給定原子的鍵的一般類型，而且取決於連接在這兩個給定原子上的取代基。合適的水解不穩定或弱的鍵包括，但不限於羧酸酯、磷酸酯、酐、縮醛、縮酮、醯氧基烷基醚、亞胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。"酶可降解的鍵"是指經受一種或多種酶降解的鍵。"水解穩定的"鍵(linkage)或鍵(bond)，是指在水中大體上穩定，即，在延長的時間周期內於生理條件下不會經受任何明顯程度水解的化學鍵，其通常為共價鍵。水解穩定的鍵的實例包括，但不限於以下(如，在脂肪族鏈中的)碳-碳鍵、醚、醯胺、氨基曱酸乙酯，等等。一般而言，水解穩定的鍵是指在生理條件下表現出的水解速率低於約1-2%/天的鍵。具代表性的化學鍵的水解速率在大多數標準的化學教科書中均可見到。"藥學上可接受的賦形劑"是指可任選地包括在組合物中且一經施用對患者不造成顯著毒副作用的賦形劑。本文所使用的"治療有效量，，是指繼施用後在血流或靶組織中產生期望的軛合物(或相應的非共軛活性劑)水平所需的輥合物量。精確的量取決於多種因素並可容易由本領域技術人員進行確定，所述因素如特定的活性劑、治療組合物的組分和物理特性、預期的患者群、遞送的方式、個體患者的考慮，等等。"多官能的，，是指其中含有三個或多個官能團的聚合物，其中所述官能團相同或不同。多官能的聚合物試劑通常含有的官能團數目為以下範圍中的一種或多種約3-IOO個官能團、3-50個官能團、3-25個官能團、3-15個官能團、3-10個官能團。聚合物骨架內的示例性官能團數目包括3、4、5、6、7、8、9和10個官能團。"任選的"或"任選地"是指隨後描述的可能或不可能發生的情例子。"大體上"(除非其它地方的特定內容做出具體定義，或上下文清楚地以其他方式指明)，是指接近全部或完全，例如，滿足以下的一種或多種大於所述條件的50%、51%或更大、75%或更大、80%或更大、90%或更大以及95%或更大。短語"大體上非水的條件"是指具有少於百萬分之10，000的水(少於1%)，更優選具有少於百萬分之1，000的水(少於0.1%)，還更優選少於百萬分之100的水(少於0.01%)，還更優選少於百萬分之10的水(少於0.001%)的組合物或反應介質。優選地，但不是必須地，大體上非水的條件包括惰性氣氛。除非上下文以其他方式清楚地指明，當術語"約，，在數值之前時，該數值理解為所述數值的平均值±10%。用於製備取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的方法在本發明的一個或多個實施方案中，提供了用於製備取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的方法。所述方法包括a)在大體上非水的條件下，將胺封端的水溶性聚合物與馬來醯亞胺試劑結合，以形成取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物；和a')任選地，分離所述取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物。所述結合步驟需要作為原材料的胺封端的水溶性聚合物。如本文所使用的"胺封端的水溶性聚合物"是指含有至少一個胺基("-NH2")的任何水溶性聚合物，而不考慮所述胺基實際上是否位於所述水溶性聚合物的末端。通常，但不是必須地，所述胺封端的水溶性聚合物可以只有一個胺基，而且所述胺封端的水溶性聚合物也可以具有超過一個的胺基。因此，所述胺封端的水溶性聚合物(例如)具有的胺基總數可以為1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何一種。示例性的胺封端的水溶性聚合物包括以下結構POLY-(X2)e-NH2POLY是水溶性聚合物(優選直鏈或支鏈的，且優選為CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-，其中當POLY為直鏈時，(n)是2至4000);(c)是0或1(優選0);和其中存在的X2是間隔部分，所述結合步驟還需要馬來醯亞胺試劑。馬來醯亞胺試劑是一經與胺封端的水溶性聚合物結合，即導致以下一種形成的試劑馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物或取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物。示例性的馬來醯亞胺試劑包括以下結構(式III)其中Y'是O或S(優選O);丫2是0或S(優選O);(a)是從1至20的整數(優選1或2);在各種情況下，R'獨立地為H或有機基(優選H);(式II)其中:在各種情況下，f獨立地為H或有機基(優選H);在各種情況下，f獨立地為H或有機基(優選H);和在各種情況下，R4蟲立地為H或有機基(優選H)。優選的馬來醯亞胺試劑是N-烷氧羰基馬來醯亞胺，特別地其中的烷氧基是低級烷氧基。優選的N-烷氧羰基馬來醯亞胺是以下顯示的N-甲氧羰基馬來醯亞胺所述結合步驟包括將所述胺封端的水溶性聚合物與所述馬來醯亞胺試劑接觸，其可採用本領域普通技術人員已知的任何方法來實現。例如，可將包括胺封端的水溶性聚合物的組合物與包括馬來醯亞胺試劑的組合物在反應容器中結合。但是，該結合步驟的實施是使引入的水減到最少。繼結合步驟之後，用於製備取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的方法任選地包括分離所述取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的步驟。當預期分離所述取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物(並由此實施分離所述取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的任選步驟)時，可以使用任何本領域已知的技術來分離所述取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物，並且在這點上本發明不受到限制。例如，可以使用選自由色譜法(如，矽膠色譜法、HPLC色譜法、親合色譜法、離子交換色譜法，等等)、電泳、沉澱(例如，包括重結晶)和提取組成的組的分離技術，來分離所述取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物。優選的分離技術是可以採用本領域已知的方法(比如添加過量的異丙醇、二乙醚、MTBE、庚烷、THF、己烷等，以使產物沉澱)實現的沉澱。沉澱技術將獲得乾燥的取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物。也可以使用其他技術來得到乾燥的取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物。(式IV)所述取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物可以採用任何數目的形式。優選的形式是取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物，其包括以下結構formulaseeoriginaldocumentpage21(式I)其中POLY是水溶性聚合物；(b)是0或1;其中存在的X)是間隔部分；Y'是0或S;丫2是0或S;(a)是從1至20的整數；在各種情況下，W獨立地為H或有機基；在各種情況下，f獨立地為H或有機基；在各種情況下，R'獨立地為H或有機基；和在各種情況下，R'獨立地為H或有機基。優選的，以分離的形式提供取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物是指組合物，其中在所述組合物的所有聚合物物質中，有至少約70%(更優選至少80%，最優選至少90%)為取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物形式(而不是胺封端的水溶性形式或馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物形式)。在使用任何分離的取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物之前，通常進行再溶解所述分離的(一般為乾燥的)取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的另外步驟，以在非水液體系統中復原所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物。所述方法用來製備馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的步驟通常在有機溶劑中進行。雖然可以使用任何的有機溶劑並且本發明在這點上不受到限制，但是示例性的有機溶劑包括那些選自由以下組成的組的溶劑卣代的脂肪族烴、醇、芳香烴、醇、卣代的芳香烴、醯胺(包括DMF)、腈(包括乙腈)、酮(包括丙酮)、乙酸酯(包括乙酸乙酯)、醚、環醚，及其組合。優選的有機溶劑的實例包括選自由以下組成的組的那些亞曱基氯(或二氯甲烷)、氯仿、辛醇、甲苯、甲基叔丁基醚、THF(四氫呋喃)、乙酸乙酯、碳酸二乙酯、丙酮、乙腈、DMF(二曱基曱醯胺)、DMS0、二甲基乙醯胺、N-環己基吡咯烷酮、環己烷及其組合。除了別的以外，用於製備取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的方法具有提供用於形成馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的中間體的效用(如本文所討論的)。通過施行此方法，有可能從胺封端的水溶性聚合物得到更高的、可再現收率的取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物，從而提供更純的中間體，並由其形成更純的馬來醯亞胺封端的聚合物的組合物和相應的軛合物組合物。此外，針對組合物提供了使組合物中具有更少的基於馬來醯胺酸的雜質的方法。用於製備馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的方法在本發明的一個或多個實施方案中，提供了用於製備馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的方法，所述方法包括a)在大體上非水的條件下，將胺封端的水溶性聚合物與馬來醯亞胺試劑結合，以形成取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物；和b)在大體上非水的條件下，將所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物暴露於消除條件，從而得到馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物。在大體上非水的條件下，將胺封端的水溶性聚合物與馬來醯亞胺試劑結合，以形成取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的所述步驟，可以如以上就用於製備取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的方法所描述的進行。所述結合步驟一經實施，當前用於製備馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的方法還包括分離和再溶解取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的任選步驟。這些任選的步驟中的每一項(任選的分離步驟和任選的再溶解步驟)均可如以上就用於製備取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的方法所描述的進行。當前用於製備馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的方法的步驟包括將馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物暴露於消除條件的步驟，該步驟包括加熱所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物。可以使用本領域已知的任何消除條件，並且在這點上本發明不受限制。例如，合適的消除條件包括在大於至少約35°C，更優選至少約40°C的溫度回流酸封端的水溶性聚合物。暴露於消除條件還可以包括從所述反應介質中除去水，其通過例如將所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物暴露於乾燥劑(如，添加NaHC03、Na2C03、CaCh、CaS04、MgS(h、K0H、Na2S04、K2C03、KHC03及其組合)、分子篩(如，矽酸鋁)、共沸蒸餾及任何前述的組合。還可使用催化劑來促進所述方法的動力學。基於這點考慮，優選在催化劑(如非親核的胺催化劑或鹼性催化劑)存在下，實施當前用於製備馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的方法。就非親核的胺催化劑而言，優選空間位阻的非親核的胺催化劑。非親核的胺催化劑的實例包括選自由以下組成的組的那些DMAP(N，N-二甲基-4-氨基吡啶)、DBU(1，8-二氮雜雙環[5.4.O]i---7-烯)、DABC0(1，4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷)、二異丙基乙胺、三乙胺、正甲基嗎啉。空間位阻的非親核的胺催化劑的實例包括DMAP(N，N-二甲基-4-氨基吡啶)、DBU(1，8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯)、DABCO(1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷)和二異丙基乙胺。鹼性催化劑的實例包括碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀和碳酸氫鉀。所述方法用來製備馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的步驟通常在有機溶劑中進行。雖然可以使用任何的有機溶劑並且本發明在這點上不受到限制，但是示例性的有機溶劑包括那些選自由以下組成的組的溶劑卣代的脂肪族烴、醇、芳香烴、醇、滷代的芳香烴、醯胺(包括DMF)、腈(包括乙腈)、酮(包括丙酮)、乙酸酯(包括乙酸乙酯)、醚、環醚，及其組合。優選的有機溶劑的實例包括選自由以下組成的組的那些亞甲基氯(或二氯曱烷)、氯仿、辛醇、甲苯、甲基叔丁基醚、THF、乙酸乙酯、碳酸二乙酯、丙酮、乙腈、DMF、DMS0、二甲基乙醯胺、N-環己基吡咯烷酮、環己烷及其組合。馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物可以具有多種結構，並且將取決於衍生其的取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的結構。依據本方法製備的示例性馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物應具有以下結formulaseeoriginaldocumentpage24(式V)其中每一P0LY、X2和(c)如式II所給的定義，每一R3和r如式in所給的定義。特別優選的馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物應包括以下結構其中(n)是從2至約4000的整數。含有馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物在本發明的一個或多個實施方案中，提供了含有馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物，所述組合物由包括以下的方法產生a)在大體上非水的條件下，將胺封端的水溶性聚合物與馬來醯亞胺試劑結合，以形成馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物；和b)在大體上非水的條件下，將所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物暴露於消除條件，從而得到含有馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物。(式VI)因此，包括在本發明內的是依據所提供的方法形成的馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物。認為由該方法得到的組合物的純度比先前已知的方法得到的更高。具體地，含有馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物具有相對低百分比的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物(如，一般小於4%，經常小於2%)。此外，含有馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物大體上不含呋喃，優選完全不含呋喃。在本發明的另一個實施方案中，提供了含有馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物，這樣的組合物包括聚合物物質，其中在所述組合物中，有至少70%的所述聚合物物質為馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物，並且進一步地，其中所述組合物包括開環的酯聚合物物質。所述開環的酯聚合物物質具有以下結構formulaseeoriginaldocumentpage25其中每一P0LY、X1、(a)、(b)、R1、R2、R3、R4、Y、和y2如就式I所定義的。未發現這種"開環的酯"與用於製備馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的基於含水的N-烷氧羰基馬來醯亞胺途徑有關。用於製備含有軛合物的組合物的方法在本發明的一個或多個實施方案中，提供了用於製備含有軛合物的組合物的方法，所述方法包括(在反應容器中)將含有巰基的生物活性劑(如含有半胱氨酸的蛋白質或多肽)與本文所提供的馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物結合，從而得到含有軛合物的組合物。儘管已經描述了用於將馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物與含有巰基的生物活性劑共軛的方法，但是示例性的方法包括將所述馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物溶解於去離子水中，以製備10%的試劑溶液，並與含有巰基的生物活性劑結合(聚合物與含有巰基的生物活性劑相比，摩爾數過量5至20倍)且充分混合。在室溫下反應大約1小時後，冷卻反應管形瓶並混合約12小時，以確保充分的反應時間。該反應的pH可以控制在約7。因此，包括在本發明內的是採用本發明具創造性的馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物來製備含有軛合物的組合物的方法。含有巰基的活性劑可以是含有半胱氨酸殘基的任何蛋白質，所述半胱氨酸殘基不參與蛋白質內的二硫化物結合。含有軛合物的組合物在本發明的一個或多個實施方案中，提供了含有軛合物的組合物，所述組合物由包括以下的方法產生將含有巰基的活性劑與本文所提供的含有馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物結合。因此，包括在本發明內的是依據所提供的用於製備含有軛合物的組合物的方法形成的含有軛合物的組合物。認為由該方法得到的組合物的純度比先前已知的方法得到的更高。與用來生成它們的馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的組合物一樣，所述含有軛合物的組合物具有相對低百分比的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物(如，一般小於4%，經常小於2%)。此外，含有輒合物的組合物大體上不含呋喃，優選完全不含呋喃。水溶性聚合物("P0LY")如本文所使用的術語"水溶性聚合物"包括那些生物相容的和非免疫原性的水溶性聚合物，其明確地排除了不是生物相容的和不是非免疫原性的任何水溶性聚合物片段。就生物相容性而言，如果通過臨床醫生(如內科醫生)的評價，物質單獨使用或與另一種物質(如活性劑)一起使用在活組織(如，施用於患者)方面相關的有益效果優於任何有害的效果，那麼就認為該物質是生物相容的。就非免疫原性而言，如果物質在體內的預期使用不產生不期望的免疫反應(如，形成抗體)，或者即使產生免疫反應，這樣的反應通過臨床醫生的評價認為不是臨床顯著或重要的，那麼就認為該物質是非免疫原性的。特別優選的是，本文描述的水溶性聚合物片段以及軛合物是生物相容的和非免疫原性的。當提及聚合物時，應理解的是，所述聚合物可以是任何數目的水溶性和非肽的聚合物，比如本文所描述的適用於本發明的那些。優選地，所述聚合物為聚(乙二醇)(即PEG)。術語PEG包括的聚(乙二醇)具有任何數目的幾何形狀或形式，其包括有待在下文更充分描述的直鏈形式、支鏈形式或多臂形式(如叉狀的PEG或與多元醇中心相連的PEG)、側鏈(pendant)PEG或其中具有可降解的鍵的PEG。聚合物帶有的官能團數目和官能團的位置可以改變。通常，所述聚合物包括1至約25個官能團，優選l、2、3、4、5、6、7、8、9或10個官能團。諸如PEG聚合物的直鏈聚合物，通常包括位於聚合物鏈末端的一個或兩個官能團。如果PEG聚合物是單官能的(即，直鏈mPEG)，則該聚合物應包括一個官能團。如果PEG聚合物是雙官能的，則該聚合物可以包括兩個獨立選定的官能團，每個官能團位於聚合物鏈的每個末端。同樣應理解的是，多臂或支鏈的聚合物可包括更多數目的官能團。還可以將諸如美國專利第5，932，462號中所描述的那些多臂或支鏈的PEG分子用作PEG聚合物。一般而言，多臂或支鏈的聚合物具有從中央支點伸出的兩個或多個聚合物"臂，，。例如，示例性的支鏈PEG聚合物具有以下結構formulaseeoriginaldocumentpage27其中PEG,和PEG2是本文描述的任何形式或幾何形狀的PEG聚合物，並且其可以相同或不同，I/是水解穩定的鍵。示例性的支鏈PEG具有以下結構formulaseeoriginaldocumentpage27其中polya和polyb是PEG骨架，如曱氧基聚(乙二醇)；R"是非反應性部分，如H、甲基或PEG骨架；P和Q是非反應性鍵。在優選的實施方案中，支鏈的PEG聚合物是甲氧基聚(乙二醇)二取代的賴氨酸。支鏈的PEG結構可以與如下顯示的第三低聚物或聚合物鏈相連formulaseeoriginaldocumentpage28其中PEGs是第三PEG低聚物或聚合物鏈，其與PEG,和PEG2相同或不同。PEG聚合物可選地包括叉狀的PEG。一般而言，具有叉狀結構的聚合物的特徵是具有聚合物鏈，所述聚合物鏈經由從聚合物中水解穩定的支點伸出的共價鍵與兩個或多個官能團相連。叉狀的PEG的例子由PEG-YCHZ2表示，其中Y是連接基團，Z是用於共價連接生物活性劑的活化的末端基團。Z基團通過所定義長度的原子鏈與CH相連。美國專利第6，362，254號公開了能夠用於本發明的各種叉狀的PEG結構。將Z官能團(如羥基)與用作系留基團(tetheringgroup)的分支碳原子相連的原子鏈可包括，例如烷基鏈、醚鍵、酯鍵、醯胺鍵，或其組合。PEG聚合物可包括具有反應性基團(如羥基)的側鏈PEG分子，所述反應性基團沿著PEG骨架的長度而不是在PEG鏈的端部共價相連。側鏈的反應性基團可直接或通過連接部分(如亞烷基)來與PEG骨架相連。除了以上描述的PEG形式之外，所述聚合物(包括以上描述的聚合物中的任何一種)還可製備成在聚合物骨架中具有一個或多個水解穩定的或可降解的鍵。例如，可將PEG製備成在聚合物骨架中具有經受水解的酯鍵。如下所示，這種水解導致聚合物裂解為低分子量的片段-PEG-CO廣PEG-+H20——-PEG-C02H+HO-PEG-在聚合物骨架內用作可降解的鍵的其他水解可降解的鍵包括碳酸酯鍵、由例如胺與醛反應得到的亞胺鍵(參見，如0uchi等，PolymerPreprints,38(1):582-3(1997))、由例如醇與磷酸基團反應形成的磷酸酯鍵、通常由醯肼與醛反應形成的腙鍵、通常由醛與醇之間的反應形成的縮醛鍵、由例如酸衍生物與醇之間的反應形成的原酸酯鍵，以及由例如聚合物端部的亞磷醯胺基團與寡核苷酸的5'羥基形成的寡核苷酸鍵。由於多種不穩定的鍵與胺基的親核反應性，而使得上述多種可降解的鍵的使用是次優的。本領域技術人員應理解的是，術語聚(乙二醇)或PEG代表或包括上述所有形式的PEG。本發明還可使用包括其他非肽和水溶性聚合物鏈的多種其他聚合物中的任何一種。所述聚合物可以是直鏈的，或者可以是上述形式中的任何一種(如，支鏈的、叉狀的，等等)。合適的聚合物的實例包括，但不限於如美國專利第5，629，384號所描述的其它聚(烷撐二醇)、乙二醇和丙二醇的二元共聚物、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羥烷基曱基丙烯醯胺)、聚(羥烷基曱基丙烯酸酯)、聚(糖類)、聚(a-羥基乙酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯醯嗎啉)及其二元共聚物、三元共聚物和混合物。儘管所述水溶性聚合物的分子量可以根據所希望的應用、聚合物結構的構型、分支的程度等等而改變，但是該分子量應滿足以下值中的一種或多種大於100道爾頓、大於200道爾頓、大於400道爾頓、大於500道爾頓、大於750道爾頓、大於900道爾頓、大於l，OOO道爾頓、大於1，400道爾頓、大於1，500道爾頓、大於1,900道爾頓、大於2，000道爾頓、大於2，200道爾頓、大於2,500道爾頓、大於3，000道爾頓、大於4，000道爾頓、大於4,900道爾頓、大於5，000道爾頓、大於6，000道爾頓、大於7，000道爾頓、大於7，500道爾頓、大於9，000道爾頓、大於10，000道爾頓、大於11，000道爾頓、大於14，000道爾頓、大於15，000道爾頓、大於16，000道爾頓、大於19，000道爾頓、大於20，000道爾頓、大於21，000道爾頓、大於22，000道爾頓、大於25，000道爾頓和大於30，000道爾頓。應理解的是，本文給定的任何有用的水溶性聚合物片段的分子量最高限值是小於約300,OOO道爾頓。所述聚合物的分子量通常會落入以下的至少一種範圍約100道爾頓至約100，000道爾頓、約200道爾頓至約60，OOO道爾頓、約300道爾頓至約40，000道爾頓。水溶性聚合物的示例性分子量包括約100道爾頓、約200道爾頓、約300道爾頓、約350道爾頓、約400道爾頓、約500道爾頓、約550道爾頓、約600道爾頓、約700道爾頓、約750道爾頓、約800道爾頓、約900道爾頓、約1，000道爾頓、約2，000道爾頓、約2，200道爾頓、約2，500道爾頓、約3，000道爾頓、約4，000道爾頓、約4，400道爾頓、約5，000道爾頓、約6，000道爾頓、約7，000道爾頓、約7，500道爾頓、約8，000道爾頓、約9，000道爾頓、約10，000道爾頓、約11，000道爾頓、約12，000道爾頓、約13，000道爾頓、約14，000道爾頓、約15，000道爾頓、約20，000道爾頓、約22，500道爾頓、約25，000道爾頓、約30，000道爾頓、約35,000道爾頓、約40，000道爾頓、約50，000道爾頓、約60，000道爾頓和約75，000道爾頓。就支鏈形式的聚合物而言，聚合物合適的總分子量大小(基本上基於兩種水溶性聚合物部分的合併重量)的示例性範圍包括以下約200道爾頓至約100，000道爾頓、約1，000道爾頓至約80，000道爾頓、約2，000道爾頓至約50，000道爾頓、約4，000道爾頓至約25，000道爾頓和約10，000道爾頓至約40，000道爾頓。更特別地，本發明支鏈形式的聚合物的總重均分子量對應於以下的一種400、l，OOO、1,500、2,000、3000、4,000、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60，000或80，000。就PEG而言，其中提供了包括重複的環氧乙烷單體，如"_(CH2CH20)n-"或"-(OCH2CH2)n，，的結構，(n)的優選值包括:約3至約3，000、約10至約3，000、約15至約3，000、約20至約3，000、約25至約3，000、約30至約3，000、約40至約3，000、約50至約3，000、約55至約3，000、約75至約3，000、約100至約3，000和約225至約3，000。間隔部分("X'"、"X2"等等)任選地，間隔部分可以將水溶性聚合物連接於馬來醯亞胺，和/或從所述馬來醯亞胺基部分連接於含有巰基的活性劑的殘基。示例性的間隔部分包括以下-0-、-S-、-C(O)-、-0-C(0)-、-C(0)-0-、-C(0)-NH-、-NH-C(0)-NH-、-O-C(0)-NH-、-C(S)-、-CH廣、-CH廣CH廣、-CH2-CH2—CH2—、一CH廣CH廣CH廣CH廣、-0-CH廣、-CH廣O-、-O-CH廣CH廣、-CH廣O-CH廣、-CH廣CH「0-、-0-CH2-CH「CH「、-CH2-0-CH2-CH2-、-CH「CH2-0-CH2-、-CH2-CH2-CH「0-、-0-CHrCHfCH2-CH2-、-CH廣0-CH廣CH廣CH2-、-CH2-CH2-0-CH2-CH2-、-CH廣CH廣CH廣0-CH2-、-CH廣CH廣CH廣CH2-0-、-C(O)-NH-CH廣、-C(0)-NH-CH「CH2-、-CH廣C(O)一NH-CH廣、-CH2-CH2—C(0)-NH-、-C(0)-NH-CH2-CH2-CH2—、—CH廣C(0)-NH-CH2-CH2-、-CH廣CH廣C(0)-NH-CH2-、-CH廣CH廣CH廣C(0)-NH-、-C(O)-NH-CH廣CH廣CH廣CH廣、-CH廣C(0)-NH-CH廣CH廣CH廣、-CH廣CH廣C(O)-NH-CH廣CH2-、-CH廣CH2-CH2-C(0)-NH-CH廣、-CH2-CH2-CH廣C(0)-NH-CH廣CH廣、-CH2-CH2-CHfC^-C(0)-NH-、-C(0)-O-CH廠、-CH廣C(O)-O-CH2-、-CH廣CH廣C(O)-0-CH廣、-C(0)-O-CH廣CH廣、-NH-C(0)-CH2-、-CH2-NH-C(0)-CH2-、-CH2-CH廣NH-C(0)-CH廣、-NH-C(0)-CH廣CH「、-CH廣NH-C(0)-CH廣CH廣、-CH2-CH2-NH-C(0)-CH廣CH廣、-C(0)-NH-CH廣、-C(O)-NH-CH廣CH廠、-O-C(0)-NH-CH廣、-O-C(0)-NH-CH廣CH2-、-O-C(O)-NH-CH廣CH廣CH廣、-NH-CH廣、-NH-CH廣CH廣、-CH廣NH-CH廣、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(0)-CH2-、-C(0)-CH廣CH廣、-CH廣C(O)一CHf、-CH廣CH廣C(O)-CH廣、-CH2-CH2-C(0)-CH廣CH廣、-CH2-CH2-C(0)-、-CH廣CH廣CH2-C(0)-NH-CH廣CH廣NH-、-CH2-CH2-CH廣C(0)-NH-CH廠CH廣NH-C(0)-、-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH廣CH廣NH-C(0)-CH2-、-CH廣CH廣CH廣C(0)-NH-CH廣CH廣NH-C(0)-CH廣CH廣、-O-C(0)-NH-[CH2]。—6-(OCH2CH2)。-廣、-C(0)-NH-(CH2)卜廣NH-C(0)-、-NH-C(0)-NH-(CH丄-6-NH-C(0)-、-O-C(O)-CH廣、-O-C(0)-CH2-CH2-、-O-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-、-CH廣CH廣CH廣C(O)-NH-CH廣CH廣NH-C(O)-CH廣、二價的環烷基、-CH-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-、0-C(0)-NH-[CH2〗f-(OCH2CH2)n-及任何前述中的兩種或多種的組合，其中(f)是0至6，(n)是0至20(優選0至10，如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更優選4)。此外，每一前述的含有碳的間隔部分具有與其相連的支鏈烷基。二價環烷基(如，環亞烷基)的非限制性實例包括Cw環烷基，如環丙二基(cyclopropadiyl)(如，1，1-、順式-11、2-或反式-1，2-環丙烯)、環丁二基(cyclobutadiyl)、環戊二基(cyclopentadiyl)、環己二基(cyclohexadiyl)和環庚二基(cycloheptadiyl)的各種異構體。所述環亞烷基可以被一個或多個烷基取代，優選被C「C6烷基取代。生物活性軛合物本發明還包括穩定的生物活性軛合物，所述軛合物包括能夠通過琥珀醯亞胺環鍵進行麥可加成而共價連接於反應性聚合物的親核生物活性分子。該生物活性劑優選為含有巰基或氨基的蛋白質。合適的生物活性劑可選自，例如安眠藥和鎮靜藥、精神興奮劑、安定藥、呼吸系統藥物、抗驚厥藥、肌肉鬆弛藥、抗帕金森劑(多巴胺拮抗劑(antagnonists))、鎮痛藥、抗炎藥、抗不安藥(抗焦慮藥)、食慾抑制劑、抗偏頭痛藥、肌肉收縮劑、抗感染藥(抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑、疫苗)、抗關節炎藥、抗瘧疾藥、止吐藥、抗癲癇藥(anepilepUcs)、支氣管擴張藥、細胞活素類、生長因子、抗癌劑、抗血栓藥、抗高血壓藥、心血管藥、抗心率失常藥、抗氧化劑(antioxicants)、平喘劑、激素類藥物(包括避孕藥)、擬交感神經藥、利尿藥、調血脂藥、抗雄激素劑、抗寄生蟲藥、抗凝血藥、腫瘤劑(neoplastics)、抗腫瘤藥、降血糖藥、營養劑和營養添加劑、生長添加劑、抗腸炎劑、疫苗、抗體、診斷用藥和對比劑。適合用來與本發明的反應性聚合物共價連接的活性劑的實例包括，但不限於降4丐素、紅細胞生成素(epo)、因子nn、因子ix、西利酶(ceredase)、伊米香酶(cerezyme)、環孢菌素、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、血小板生成素(tp0)、oc-l蛋白酶抑制劑、依降鈣素、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)、生長激素、人生長激素(HGH)、生長激素釋放激素(GHRH)、肝素、低分子量肝素(LMWH)、a幹擾素、P幹擾素、y幹擾素、白細胞介素-l受體、白細胞介素-2、白細胞介素-1受體拮抗劑、白細胞介素-3、白細胞介素-4、白細胞介素-6、促黃體激素釋放激素(LHRH)、因子IX、胰島素、胰島素原、胰島素類似物(如美國專利第5,922,675號所描述的單乙醯代的胰島素)、糊精、C-肽、促生長素抑制素、促生長素抑制素類似物(包括奧曲肽)、加壓素、濾泡刺激激素(FSH)、胰島素樣生長因子(IGF)、促胰島素激素(insulintropin)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、神經生長因子(NGF)、組織生長因子、角質形成細胞生長因子(KGF)、神經膠質生長因子(GGF)、腫瘤壞死因子(TNF)、內皮生長因子、甲狀旁腺素(PTH)、高血糖素樣肽胸腺素a-1、nb/IIIa抑制劑、cc-l胰蛋白酶抑制藥、磷酸二酯酶(PDE)化合物、VLA-4抑制劑、二磷酸鹽類、呼吸道合胞病毒抗體、嚢性纖維化跨膜調節因子(CFTR)基因、脫氧核糖核酸酶(deoxyreibonuclease)(DNA酶)、殺菌/通透性增加蛋白(BPI)、抗-CMV抗體、13-順式視黃酸；大環內酯類，如紅黴素、竹桃黴素、醋竹桃黴素、羅紅黴素、克拉黴素、環酯紅黴素(davercin)、阿奇黴素、氟紅黴素、地紅黴素、交沙黴素、螺旋黴素、麥迪黴素、柱晶白黴素、米卡黴素、羅他黴素、andazithromycin和swinolideA;氟喹諾酮類，如環丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、曲伐沙星、阿拉曲沙星、moxifloxicin、諾氟沙星、依諾沙星、格帕沙星、加替沙星、洛美沙星、司帕沙星、替馬沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟羅沙星、託氟沙星、普盧利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙星和西他沙星；氨基葡糖苷，如慶大黴素、奈替米星、草履蟲素、妥布黴素、阿米卡星、卡那黴素、新黴素、鏈黴素、萬古黴素、替考拉寧、rampolanin、麥地拉寧、粘菌素、達託黴素、短桿菌肽、粘菌素甲烷磺酸鈉；多粘菌素，如多粘菌素B、巻麴黴素、桿菌肽、表黴烯；青黴素，包括青黴素酶敏感的藥劑，如青黴素G、青黴素V，青黴素酶耐受的藥劑，如曱氧西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林、萘夫西林；革蘭氏陰性微生物活性劑，如氨苄西林、阿莫西林、海他西林、cillin和galampicillin;抗假單胞青黴素樣羧苄青黴素、替卡西林、阿洛西林、美洛西林和哌拉西林；頭孢菌素樣頭孢泊肟、頭孢羅齊、頭孢布坦(ceftbuten)、頭孢唑肝、頭孢曲松、頭孢金素、頭孢匹林、頭孢氨千、cephradrine、頭孢西丁、頭孢孟多、頭孢唑林、頭孢噻啶、頭孢克洛、頭孢幾氨節、頭孢菌素in、頭孢呋辛、頭孢雷特、頭孢噻肟、頭孢曲秦、頭孢乙腈、頭孢吡肟、頭孢克肟、頭孢尼西、頭孢哌酮、頭孢替坦、頭孢美唑、頭孢他啶、氯碳頭孢、拉氧頭孢和單環P-內醯胺類樣氨曲南；碳青黴烯類，如亞胺培南、美羅培南、依西酸戊雙脒(pentamidineisethiouate)、沙丁胺醇、利多卡因、硫酸間羥異丙腎上腺素、二丙酸倍氯米松(beclomethasonediprepionate)、曲安西龍乙酖胺(triamcinoloneacetamide)、布地奈德丙酉同4匕物(budesonideacetonide)、氟替卡松、異丙託溴銨、氟尼縮松、色甘酸鈉、麥角胺；以及上述可應用的類似物、激動劑、拮抗劑、抑制劑和藥學上可接受的鹽形式。提及肽和蛋白質時，本發明預期包括合成形式、天然形式、糖基化的形式、未糖基化的形式、聚乙二醇化的形式，及其生物活性片段和類似物。本發明還包括藥物製劑，所述藥物製劑包括本文所提供的軛合物和藥物賦形劑。一般而言，所述軛合物本身為固體形式(如，沉澱)，其可與固體或液體形式的合適的藥物賦形劑結合。示例性的賦形劑包括，但不限於選自由碳水化合物、無機鹽、抗微生物劑、抗氧化劑、緩衝劑、酸、鹼及其組合組成的組的那些。碳水化合物(如糖)、衍生化的糖(如糖醇、糖醛酸、酯化的糖)和/或糖聚合物可作為賦形劑存在。具體的碳水化合物賦形劑包括，例如單糖，如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、右旋糖酐、澱粉等；以及糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇等。所述賦形劑還可包括無機鹽或緩沖劑，如檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，及其組合。用於本發明的抗;生物菌的非限:性實二包括苯扎氯銨:節索氯銨、苯甲醇、西吡氯銨、三氯叔丁醇、酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞(thimersol),及其組合。抗氧化劑也可存在於製劑中。抗氧化劑用來預防氧化，從而防止所述製劑中的軛合物或其他組分降解。適合用於本發明的抗氧化劑包括，例如抗壞血酸棕櫚酸鹽、丁羥茴香醚、丁羥曱苯、次磷酸、硫代甘油、沒食子酸丙酯、亞硫酸氬鈉、曱醛次硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉，及其組合。表面活性劑可作為賦形劑存在。示例性的表面活性劑包括聚山梨醇酯，如"吐溫20"和"吐溫80"，和普盧蘭類，如F68和F88(兩者均可從BASF，MountOlive,NewJersey獲得)；山梨糖酯；脂質，如磷脂(比如卵磷脂)和其他的磷脂醯膽鹼、砩脂醯乙醇胺(雖然優選為非脂質形式)、脂肪酸和脂肪酯；甾族化合物，如膽固醇；螯合劑，如EDTA、鋅和其他此類合適的陽離子。酸或鹼可作為賦形劑存在於所述製劑中。可使用的酸的非限制性實例包括那些選自由以下組成的組的酸:鹽酸、乙酸、磷酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富馬酸，及其組合。合適的鹼的實例包括，但不限於選自由以下組成的組的鹼氫氧化鈉、乙酸鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、乙酸銨、乙酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉、甲酸鈉、硫酸鈉、硫酸鉀、富馬酸鉀(potassiumfumerate)及其組合。藥物製劑包括所有類型的劑型，特別是適用於注射的那些，如可重新溶解的粉末，以及懸浮液和溶液。組合物中軛合物(即，在本文所描述的活性劑與聚合物之間形成的軛合物)的量將根據多種因素而改變，但當該組合物在單位劑量容器(如，管形瓶)中貯存時最佳的是治療有效劑量。此外，所述藥物製劑可封裝在注射器中。治療有效劑量在實驗上可通過重複施用遞增量的軛合物以測定哪一量產生臨床上所希望的終點而確定。組合物中任何一種賦形劑的量將根據所述賦形劑的活性和該組合物的特定需求而改變。通常，任何一種賦形劑的最佳量通過常規的實驗確定，即，通過製備含有不同量賦形劑(範圍從低到高)的組合物，考察該組合物的穩定性和其他參數，然後確定獲得最佳性能而無顯著副作用的範圍。然而，一般而言，所述賦形劑在組合物中存在的量為約1%至約99%重量，優選約5%-98%重量，更優選約15-95%重量，其中最優選小於30%重量的濃度。這些前述的藥物賦形劑連同其他賦形劑一起在"Remington:TheScience&PracticeofPharmacy",19thed.，Williams&Williams,(1995)，the"Physician'sDeskReference",52nded.,MedicalEconomics,Montvale，NJ(1998)，和Kibbe，A.H.，HandbookofPharmaceuticalExcipients，3rdEdition,AmericanPharmaceuticalAssociation,Washington,D.C.，2000.中描述。雖然不是必須的，但是本發明的藥物製劑通常經由注射施用，因而一般在施用之前即刻配製為液體溶液或懸浮液。所述藥物製劑還可採用其他的形式，如糖漿、乳骨、軟骨劑、片劑、散劑，等等。其他的施用方式還可包括，如肺部、直腸、經皮、經黏膜、口服、膜內、皮下、動脈內等。如前所述，所述軛合物可通過靜脈內注射，或者次優地通過肌內注射或通過皮下注射來進行胃腸外施用。除了別的以外，適合用於胃腸外施用的劑型包括容易用於注射的溶液、在使用前與溶劑結合的乾燥粉末、容易用於注射的懸浮液、在使用前與載體結合的不溶性乾燥組合物、在施用前進行稀釋的乳劑和液體濃縮物。本發明還提供了用於將本文所提供的軛合物施用於患有響應於輒合物治療的病徵(condition)的患者的方法。所述方法包括施用(一般經由注射)治療有效量的軛合物(優選作為藥物製劑的一部分提供)。該施用方法可用來治療通過施用特定的軛合物可減輕或預防的任何病徵。本領域的普通技術人員應了解具體的軛合物可有效治療哪一種病徵。有待施用的實際劑量將根據患者的年齡、體重、大體狀況，以及所治療的病徵的嚴重性、健康護理專業人員的判斷和所施用的軛合物而改變。治療有效量為本領域技術人員已知和/或在相關的參考教科書和參考文獻中描述。通常，治療有效量的範圍為約0.001mg至100mg，優選劑量為0.01mg/天至75mg/天，更優選的劑量為0.10mg/天至50mg/天。任何給定輒合物的單位劑量(再次聲明，優選作為藥物製劑的一部分提供)可根據臨床醫生的判斷、患者的需求等，以多種給藥時間表進行施用。具體的給藥時間表應為本領域普通技術人員已知，或可使用常規的方法通過實驗確定。示例性的給藥時間表包括，但不限於每天施用5次、每天施用4次、每天施用3次、每天施用2次、每天施用1次、每周3次、每周2次、每周1次、每月2次、每月l次，及其任何組合。一旦到達臨床終點，停止組合物的給藥。應理解的是，儘管本發明已連同其優選的具體實施方案一起進行描述，但是前述的描述和隨後的實施例只預期進行說明而不限制本發明的範圍。本發明範圍內的其他方面、優勢和改進對於本發明所屬領域的技術人員是顯而易見的。儘管本文採用了具體的術語，但是它們只屬於通用和描述性的並且不用於限制的目的。實驗除非另有說明，本發明的實施將採用有機合成、生物化學、蛋白質純化等常規技術，其均為所屬領域的技術。這樣的技術在文獻中均有充分的解釋。參見，例如先前的J.March,AdvancedOrganicChemistry:ReactionsMechanismsandStructure,第4版.(NewYork:Wiley-Interscience，1992)。在以下的實施例中，努力確保所使用數字(如，量、溫度等)的準確度，但應考慮某些實驗誤差和偏差。除非另有說明，溫度為攝氏度，壓力為海平面的大氣壓或接近海平面的大氣壓。認為以下每一實施例對本領域普通技術人員實施本文所描述的一個或多個實施方案具有啟示。所有^NMR數據均由Bruker製造的300或400MHzNMR波譜儀產生。在實施例5至12中，所使用的商品級mPEG(20kDa)-胺具有以下特徵胺的取代百分數為94.6%至100%;羥基mPEG雜質的百分數為0%至4.2%;二聚物(由兩個官能化的PEG物質相互反應形成的物質)的百分數為0.6%至2.1%;三聚物(由三個官能化的PEG物質相互反應形成的物質)的百分數為0%至0.3%。實施例1取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的製備formulaseeoriginaldocumentpage38將N-甲氧羰基馬來醯亞胺(0.80g，0.0051mol)添加到raPEG(20kDa)_胺(NektarTherapeutics,50.0g，0.0025mol)的無水二氯甲烷(350ml)溶液中，並將該溶液在氬氛下室溫攪拌1小時。添加N，N-二異丙基乙胺(1.0ml)並將該混合物在氬氛下室溫攪拌過夜。其次通過餾出200ml的二氯曱烷而濃縮該反應混合物，並使用乙醚對產物進行沉澱。乾燥後產量為46.3g。NMR(d廣DMSO):3.24ppm(s，PEG-OCH3)，3.51ppm(s，PEG骨架)，3.86ppm(s，CH30-NH-)，6.20ppm(m，-CH-CH-)，8.46ppm(-NH).實施例2mPEG(20kDa)馬來醯亞胺的製備formulaseeoriginaldocumentpage39將N，N-二異丙基乙胺(10ml)添加到實施例1製備的取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物(10.0g)的無水乙腈(100ml)溶液中，並將該反應混合物在氬氛下室溫攪拌44小時。接下來，通過餾出~80ml的乙腈而濃縮所述混合物，並使用乙醚對產物進行沉澱得到8.5g的mPEG(2。KDa)馬來醯亞胺。NMR(d6-DMSO):3.24ppm(s，PEG-0CH3)，3.51ppm(s，PEG骨架)，7.01ppm(s，-CH-CH-，馬來醯亞胺)；93.5%取代.實施例3用於製備取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的實驗方案formulaseeoriginaldocumentpage39formulaseeoriginaldocumentpage40和(式I)其中(就式II而論)POLY是水溶性聚合物(優選直鏈或支鏈的，且優選為CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-，其中當POLY為直鏈時，(n)是2至4000);(c)是0或1(優選0);和其中存在的X2是間隔部分，其中(就式III而論)丫1是0或S;y2是o或s;(a)是從1至20的整數；在各種情況下，R'獨立地為H在各種情況下，f獨立地為H在各種情況下，R'獨立地為H在各種情況下，R'獨立地為H其中(就式I而論)POLY是水溶性聚合物；(b)是0或1;其中存在的Xi是間隔部分；Yl0或S;f是O或S;(a)是從1至20的整數；在各種情況下，R'獨立地為H在各種情況下，W獨立地為H在各種情況下，f獨立地為H在各種情況下，114獨立地為H將胺封端的水溶性聚合物(式或有機基；或有機基；或有機基；或有機基，或有機基；或有機基；或有機基；或有機基。II)溶解於二氯曱垸中(20%wt/v和溶液)，並在4(TC減壓蒸餾直到除去所有的二氯甲烷為止。這將形成與水的共沸混合物，並有效地從剩餘的聚合物中除去水。將該步驟重複一次。如果需要，將其在真空下放置直至完全乾燥為固體(並非必須)。在惰性氣氛下，將聚合物重新溶解於無水二氯曱烷中(20%wt/v溶液)。加入1.5當量的馬來醯亞胺試劑(式III)。一旦溶解，即逐滴加入0.5當量的二異丙基乙胺。使其在惰性氣氛下室溫攪拌至少1小時(過夜最佳，但可能形成閉環的馬來醯亞胺)。在25-3(TC減壓餾出溶劑，直至得到濃稠的油狀溶液為止(根據分子量，大約0.5-1.5mL溶液/g水溶性聚合物)。向攪拌的溶液中緩慢地添加異丙醇(大約25mL/g水溶性聚合物)。使其在室溫攪拌至少30分鐘。濾掉液體。重新添加足量的異丙醇以便得到水溶性聚合物的漿，然後再次濾掉液體。在真空下乾燥固體直到除去所有的異丙醇為止。實施例4用於製備馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的實驗方案POLY—(X1)b—NH—C—C=C—C—NH—C—Y2—-C(式I)+(式v)其中(就式I而論)POLY是水溶性聚合物;(b)是0或1;其中存在的X工是間隔部分；Y)是0或S;丫2是0或S;(a)是從1至20的整數；在各種情況下，W獨立地為H或有機基；在各種情況下，R'獨立地為H或有機基；在各種情況下，f獨立地為H或有機基；和在各種情況下，R"獨立地為H或有機基，其中(就式V而論)P0LY、X2和(c)各自如式II所給的定義，f和W各自如式III所給的定義。將來自實施例3的取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物溶解於無水二氯曱烷中，以製備10°/。wt/v的溶液。加入無水硫酸鈉(0.5g/gPEG)。加入無水碳酸鈉(0.5g/g水溶性聚合物)。在惰性氣氛(約40°C)下加熱回流。回流攪拌5小時。除熱並使其冷卻至低於35。C。濾出固體。在25-40。C減壓餾出溶劑，直至得到濃稠的油狀溶液為止。與實施例3—樣，使用異丙醇進行沉澱。實施例5馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的非水製備將共沸的mPEG(20kDa)-胺、0.01wt%丁幾甲苯(BHT)和二氯甲烷在40。C混合。採用旋轉蒸發儀蒸發更多的揮發性成分。檢測含水量，發現為56ppm(需要低於100ppm)。向每g這樣的混合物中分別加入0.5g磨碎的碳酸鈉和粒狀的石充酸鈉。添加磨碎的碳酸鈉和粒狀的硫酸鈉之後，攪拌該混合物並冷卻至5'C以形成冷的PEG溶液。單獨地將3當量(0.56g)的N-甲氧羰基馬來醯亞胺溶解於二氯曱烷中以製備3%(w/v)的溶液。將所得的混合物渦旋30秒。渦旋的混合物具有混濁的外觀。將渦旋的混合物加入所述冷的PEG溶液，並在5。C或約5。C攪拌21小時。繼攪拌之後，將該混合物逐漸地加熱到大約40°C，並回流超過45分鐘。此後，取出樣品通過HNMR來確定反應完全。回流8.5小時後，〗吏混合物冷卻至室溫，通過celite床過濾，隨後採用旋轉蒸發儀在30。C的水浴中除去二氯甲坑溶劑，從而生成油。產物通過使用異丙醇(IPA)進行沉澱而回收(攪拌30分鐘)。與本實施例相關的分析示於表1和表2，並在實施例13中進行討論。實施例6馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的非水製備重複實施例5的過程，除了以下的例外事項/注釋。繼添加磨碎的碳酸鈉和粒狀的硫酸鈉之後，冷卻該混合物至5'C，持續IO小時。進行7小時回流(在第6小時顯示有6%的前體)。與本實施例相關的分析示於表1和表2,並在實施例13中進行討論。實施例7馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的非水製備重複實施例5的過程，除了以下的例外事項/注釋。繼添加磨碎的碳酸鈉和粒狀的硫酸鈉之後，攪拌並冷卻該混合物至5.7°C，持續9.5小時。在回流之前將該混合物在室溫攪拌45分鐘，而不是先加熱再回流。進行6.5小時回流(在第5小時顯示有6%的前體)。與本實施例相關的分析示於表1和表2，並在實施例13中進行討論o實施例8馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物的非水製備重複實施例5的過程，除了以下的例外事項/注釋。繼添加磨碎的碳酸鈉和粒狀的硫酸鈉之後，起初攪拌並冷卻該混合物至5.75。C，然後在2小時內逐漸冷卻至5°C,總共攪拌15小時。在回流之前將該混合物在室溫攪拌1小時，而不是先加熱再回流。進行8小時回流(在第6小時顯示有12%的前體)。與本實施例相關的分析示於表1和表2，並在實施例13中進行討論。實施例9(對比實施例)"含水的N-烷氧羰基馬來醯亞胺途徑"將mPEG胺(20kDa)在7.6%(w/v)碳酸氬鈉溶液中的17.5%(w/v)溶液冷卻至6。C。添加10°/。(w/v)N-甲氧羰基馬來醯亞胺(3當量，5.3%)的乙腈溶液，並將混合物攪拌15分鐘。向該溶液中加入足量的蒸餾水，使得體積增倍。首先將溶液冷卻，然後允許其在45分鐘內升溫至13。C。使用磷酸將溶液的pH調節至3.0，然後加入足量的氯化鈉以提供15%(w/v)的氯化鈉鹽溶液。攪拌所述鹽溶液15分鐘，然後用等體積的二氯曱烷萃取，從而得到二氯甲烷溶液。使用硫酸鈉(3.5g/100mL)乾燥所述二氯曱烷溶液，並蒸發得到油。用異丙醇(17.5mL/g)沉澱，過濾並乾燥得到白色固體。與本實施例相關的分析示於表1和表2，並在實施例13中進行討論。實施例10(對比實施例)"含水的N-烷氧羰基馬來醯亞胺途徑"將mPEG胺(20kDa)在7.6%(w/v)碳酸氬鈉溶液中的17.5%(w/v)溶液冷卻到3.8°C至5.9°C。由於冷凝器的問題而使得溫度向室溫偏離過夜。添加10%(w/v)N-甲氧羰基馬來醯亞胺(3當量，4.4%)的乙腈溶液，並將混合物攪拌15分鐘。向該溶液中加入足量的蒸餾水，使得體積增倍。首先將溶液冷卻，然後允許其在45分鐘內升溫至13。C。使用磷酸將溶液的pH調節至3.0，然後加入足量的氯化鈉以提供15%(w/v)的氯化鈉鹽溶液。攪拌所述鹽溶液15分鐘，然後用等體積的二氯甲烷萃取，從而得到二氯甲烷溶液。使用硫酸鈉(3.5g/100mL)乾燥所述二氯甲烷溶液，並蒸發得到油。用異丙醇(17.5mL/g)沉澱，過濾並乾燥得到白色固體。與本實施例相關的分析示於表1和表2，並在實施例13中進行討論。實施例11(對比實施例)"含水的N-烷氧羰基馬來醯亞胺途徑"將mPEG胺(20kDa)在7.6%(w/v)碳酸氫鈉溶液中的17.5%(w/v)溶液冷卻到4°C。添加10%(w/v)N-甲氧羰基馬來醯亞胺(3當量，5.4%)的乙腈溶液，並將混合物攪拌15分鐘。向該溶液中加入足量的蒸餾水，使得體積增倍。首先將溶液冷卻，然後允許其在45分鐘內升溫到8。C至9。C。使用磷酸將溶液的pH調節至3.0，然後加入足量的氯化鈉以提供15%(w/v)的氯化鈉鹽溶液。攪拌所述鹽溶液15分鐘，然後用等體積的二氯甲烷萃取，從而得到二氯曱烷溶液。使用硫酸鈉(3.5g/100mL)乾燥所述二氯甲烷溶液，並蒸發得到油。用異丙醇(17.5mL/g)沉澱，過濾並乾燥得到白色固體。與本實施例相關的分析示於表1和表2,並在實施例13中進行討論。實施例12(對比實施例)"含水的N-烷氧羰基馬來醯亞胺途徑"將mPEG胺(20kDa)在7.6%(w/v)碳酸氫鈉溶液中的17.5%(w/v)溶液冷卻到6°C。添加10%(w/v)N-甲氧羰基馬來醯亞胺(3當量，5.3%)的乙腈溶液，並將混合物攪拌15分鐘。向該溶液中加入足量的蒸餾水，使得體積增倍。首先將溶液冷卻，然後允許其在45分鐘內升溫至13°C。使用磷酸將溶液的pH調節至3.0，然後加入足量的氯化鈉以提供15%(w/v)的氯化鈉鹽溶液。攪拌所述鹽溶液15分鐘，然後用等體積的二氯甲烷萃取，從而得到二氯甲垸溶液。使用硫酸鈉(3.5g/100mL)乾燥所述二氯甲烷溶液，並蒸發得到油。用異丙醇(17.5mL/g)沉澱，過濾並乾燥得到白色固體。與本實施例相關的分析示於表1和表2，並在實施例13中進行討論。實施例13採用HPLC、GFC和^NMR對實施例5至12獲得的產物進行分析。高效液相色鐠(HPLC)使用Agilent1100HPLC系統(Agilent)進行，該系統使用Shodex蛋白質KW-803GFC柱和使用RI檢測器，其中流動相為10mMHEPES，流速為1.0mL/min，溫度為25°C(產物經羧酸官能化的巰基物質衍生物，並通過比較衍生化和未衍生化的波譜而確定取代)。GFC使用Shodex蛋白質KW-803GFC柱和使用RI檢測器進行，其中流動相為lx磷酸緩沖鹽水，流速為1.0mL/min，溫度為25°C。結果示於表1和表2。就表1而言，"％二馬來醯亞胺基物質"是指分子量與所希望的馬來醯亞胺產物大約相同的聚合物，但其具有兩個馬來醯亞胺基末端；就表2而言，"％MAL二聚物"是指由兩個官能化的PEG物質相互反應形成的物質，％MAL三聚物是指由三個官能化的PEG物質相互反應形成的物質，以及MW高於三聚物(Timer)"是指由四個或多個官能化的PEG物質相互反應形成的物質。實施例5至12的產物的HPLC分析tableseeoriginaldocumentpage47*包括mPEG-馬來醯胺酸峰，但不包括未反應的物質***經歷溫度偏移的實施例表2實施例5至12的產物的GFC和4NMR分析以及實施例5至8的產物的收率和批量大小tableseeoriginaldocumentpage47**不能定量，而且所提供的值為預期值***經歷溫度偏移的實施例從表1清楚地看到，實施例5至8中所採用的一般方法得到的組合物與依據對比實施例9至12所採用的基於含水的方法得到的組合物相比，具有更高的馬來醯亞胺取代。通常，實施例5至8所採用的一般方法提供的馬來醯亞胺取代大於86%。此外，表l證實了實施例5至8所釆用的一般方法得到的組合物具有的含有馬來醯胺酸("mPEG-馬來醯胺酸")的聚合物百分數小於4%，甚至小於2%，其比對比實施例9至12所採用的基於含水的方法得到的更佳。從表2看，似乎除了通過氣相過濾色譜分析的分子量較高的物質(%馬來醯亞胺二聚物；％馬來醯亞胺三聚物和其他高分子量的物質)之外，諸如M-MAL2Qk前體百分數和開環的酯雜質百分數等參數在所測試的實施例中相當一致。最後，從表1和表2可清楚地看到，當與對比實施例所釆用的一般方法進行比較時，實施例5至8所釆用的一般方法提供了一致和良好的收率。權利要求1.一種合成方法，其包括a)在大體上非水的條件下，將胺封端的水溶性聚合物與馬來醯亞胺試劑結合，以形成取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物；和b)將所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物暴露於消除條件，從而得到馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物。2.根據權利要求1所述的方法，所述方法還包括在所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物暴露於消除條件之前，分離所述取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物。3.根據權利要求2所述的方法，其中分離所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的步驟經沉澱作用，以製備千燥的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物。4.根據權利要求3所述的方法，其中所述沉澱作用通過添加過量試劑來實現，所述試劑選自由異丙醇、二乙醚、MTBE、庚烷、THF、己烷及其混合物組成的組。5.根據權利要求3所述的方法，所述方法還包括溶解所述乾燥的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物以再生所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的步驟。6.根據權利要求1所述的方法，其在有機溶劑中進行。7.根據權利要求6所述的方法，其中所述有機溶劑選自由卣代的脂肪族烴、醇、芳香烴、囟代的脂肪族烴、醇、芳香烴、囟代的芳香經、醯胺、腈、酮、乙酸酯、醚、環醚及其組合組成的組。8.根據權利要求6所述的方法，其中所述有機溶劑選自由二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯、曱基叔丁基醚、四氫呋喃、辛醇、乙酸乙酯、碳酸二乙酯、丙酮、環己烷及其組合組成的組。9.根據權利要求8所述的方法，其中所述有機溶劑是二氯甲烷或乙腈。10.根據權利要求1所述的方法，其中在大體上非水的條件下，將胺封端的水溶性聚合物與馬來醯亞胺試劑結合以形成馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物的所述步驟是在鹼性催化劑存在下進行的。11.根據權利要求1所述的方法，其中將所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物暴露於消除條件的所述步驟是在鹼存在下於有機溶劑中進行的。12.根據權利要求11所述的方法，其中所述鹼選自由碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鈉或碳酸鉀組成的組。13.根據權利要求11所述的方法，其中將所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物暴露於消除條件的所述步驟是在10°C至60°C的溫度下進行的。14.根據權利要求1所述的方法，其中將所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物暴露於消除條件的所述步驟是在非親核的胺催化劑存在下進行的。15.根據權利要求14所述的方法，其中所述非親核的胺催化劑選自由二異丙基乙胺、三乙胺、正甲基嗎啉、吡啶、N,N-二曱基-4-氨基吡啶、1，8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯和1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷組成的組。16.根據權利要求1所述的方法，其中將所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物暴露於消除條件的所述步驟包括在乾燥劑存在下進行。17.根據權利要求16所述的方法，其中所述乾燥劑選自由NaHC03、Na2C03、CaCl2、CaS04、MgS04、KOH、Na2S04、K2C03、KHC03、分子篩及其組合組成的組。18.根據權利要求2所述的方法，其中所述胺封端的水溶性聚合物是含有末端胺基的水溶性聚合物，其中所述水溶性聚合物選自由聚(烷撐二醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羥烷基曱基丙烯醯胺)、聚(羥烷基曱基丙烯酸酯)、聚(糖類)、聚(a-羥基乙酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯醯嗎啉)及其二元共聚物或三元共聚物組成的組。19.根據權利要求18所述的方法，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。20.根據權利要求19所述的方法，其中所述聚(乙二醇)的分子量為約IOO道爾頓至約100，000道爾頓。21.根據權利要求1所述的方法，其中所述馬來醯亞胺試劑具有下式formulaseeoriginaldocumentpage4其中.-Y'是0或S;f是0或S;(a)是從1至20的整數；!^在各種情況下獨立地為H或有機基；f在各種情況下獨立地為H或有機基；f在各種情況下獨立地為H或有機基；和R"在各種情況下獨立地為H或有機基。22.根據權利要求1所述的方法，其中所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物具有下式formulaseeoriginaldocumentpage4其中POLY是水溶性聚合物；(b)是0或1;其中存在的X'是間隔部分;f是0或S;Y2是0或s;(a)是從1至20的整數；W在各種情況下獨立地為H或有機基；W在各種情況下獨立地為H或有機基；f在各種情況下獨立地為H或有機基；和R'在各種情況下獨立地為H或有機基。23.根據權利要求22所述的方法，其中POLY是直鏈的水溶性聚合物。24.根據權利要求22所述的方法，其中POLY是CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2且(a)是1，並且進一步地，其中(n)是2至4000。25.根據權利要求22所述的方法，其中POLY是支鏈的。26.根據權利要求1所述的方法，其中所述馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物具有下式formulaseeoriginaldocumentpage5其中POLY是水溶性聚合物；(b)是0或1;其中存在的Xi是間隔部分；f在各種情況下獨立地為H或有機基；和IT在各種情況下獨立地為H或有機基。27.根據權利要求26所述的方法，其中POLY是直鏈的水溶性聚合物。28.根據權利要求26所述的方法，其中P0LY是CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-，其中(n)是2至4000。29.根據權利要求26所述的方法，其中POLY是支鏈的。30.根據權利要求1所述的方法，其中所述大體上非水的條件代表具有少於百萬分之iooo份的水的反應介質。31.根據權利要求30所述的方法，其中所述大體上非水的條件代表具有少於百萬分之IOO份的水的反應介質。32.根據權利要求31所述的方法，其中所述大體上非水的條件代表具有少於百萬分之60份的水的反應介質。33.根據權利要求1所述的方法，其中形成了組合物，所述組合物中大於70%的水溶性聚合物物質為馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物。34.根據權利要求1所述的方法，其中形成了組合物，所述組合物中大於80°/。的水溶性聚合物物質為馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物。35.根據權利要求1所述的方法，其中形成了組合物，所述組合物中大於90%的水溶性聚合物物質為馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物。36.根據權利要求1所述的方法，其中形成了組合物，所述組合物中大於93%的水溶性聚合物物質為馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物。37.根據權利要求1所述的方法，其中形成了組合物，所述組合物中大於86%的水溶性聚合物物質為mPEG-馬來醯亞胺。38.根據權利要求1所述的方法，其中形成了組合物，所述組合物中大於93°/。的水溶性聚合物物質為mPEG-馬來醯亞胺。39.—種組合物，其通過實施權利要求1所述的方法得到。40.—種用於製備軛合物的方法，其包括在共軛作用條件下，將含有巰基的生物活性劑與馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物結合，所述馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物如下製備(i)在大體上非水的條件下，將胺封端的水溶性聚合物與馬來醯亞胺試劑結合，以形成取代的馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物；和Ui)將所述馬來醯胺酸封端的水溶性聚合物暴露於消除條件，從而得到馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物。41.一種軛合物，其根據權利要求40的方法製備。42.—種組合物，其包括聚合物物質，其中所述組合物中至少70%的聚合物物質為馬來醯亞胺封端的水溶性聚合物，並且進一步地，其中所述組合物包括開環的酯聚合物物質。全文摘要提供了用於製備含有馬來醯亞胺的聚合物試劑的方法。還提供了包括所述聚合物試劑和由所述方法獲得的聚合物試劑製備的軛合物的組合物。文檔編號A61K47/48GK101268118SQ200680034312公開日2008年9月17日申請日期2006年7月19日優先權日2005年7月19日發明者A·G·沙伊菲爾,A·科茲洛夫斯基,B·布雷,J·漢德裡,R·奧德姆,T·L·桑德申請人:尼克塔治療阿拉巴馬公司