一種耐高溫植酸酶基因工程菌的發酵方法
2023-04-30 00:35:06 2
專利名稱：一種耐高溫植酸酶基因工程菌的發酵方法
技術領域：
本發明涉及發酵領域，具體涉及一種耐高溫植酸酶基因工程菌的發酵方法。
背景技術：
單胃動物缺乏從植酸分子水解釋放無機磷的消化酶，佔動物日糧總磷5(Γ70%的 植物磷無法被充分利用，排放到自然界造成土地和水資源的磷生態負擔日益嚴重；植酸鹽 通過螯合作用可降低動物對鋅、錳、鐵、鈣、鉀等主要微量元素的利用率；通過與蛋白質結合 成植酸複合物而降低動物對蛋白質的消化吸收率，從而降低飼料利用率。植酸酶(Phytase) 是催化植酸和植酸鹽水解成肌醇和磷酸(或鹽)的一類酶的總稱，研究表明，在豬、禽日糧中 添加植酸酶，可使飼料中磷的利用率提高60%，糞便中磷的排出量減少40%，從而減少飼料 中磷的添加量，同時可降解植酸鹽的抗營養作用。作為一種新型飼料添加劑，無論在動物生 產還是環境保護中，植酸酶都有重要的應用價值。植酸酶在動物、植物及微生物中均有發 現，然而真正具有開發價值的僅限於利用微生物發酵生產的植酸酶。國內對植酸酶的研究 起步較晚，目前市場上應用的優質植酸酶製劑多屬進口產品，且價格昂貴。飼用植酸酶應 具備熱穩定性好、抗蛋白酶特性強、廣泛的底物特異性及在動物胃腸PH條件下的高酶活性 等，這也正是植酸酶研究的熱點，特別是植酸酶的熱穩定性是國內外研究者一致要攻克的 瓶頸。篩選耐熱性更好的植酸酶以及利用基因工程來改善植酸酶的性質，探索更好的提高 植酸酶的熱穩定性的方法仍是研究的重點。
發明內容
本發明的目的在於根據現有的植酸酶熱穩定性的不足，提供一種耐高溫的植酸酶 基因工程菌的發酵方法，以實現耐高溫植酸酶的市場化。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現 一種植酸酶基因工程菌的發酵方法，包括如下步驟
(1)植酸酶基因工程菌高密度培養階段將植酸酶基因工程菌種子接種於發酵罐中培 養，待初始葡萄糖耗盡後，DO值迅速回升時，補充碳源直至高密度培養階段結束；
(2)誘導表達用甲醇誘導表達植酸酶後結束髮酵；
(3)分離純化。作為一種優選方案，步驟(1)中所述碳源為葡萄糖；補料方式為分批補料、恆溶氧 流加。作為一種優選方案，步驟(1)中溶氧維持在2(Γ50% ；步驟(2)中的誘導表達溶氧維 持在10%。作為一種優選方案，步驟(1)中所述補充碳源的時間是在發酵16h後。作為一種優選方案，步驟(2)中所述甲醇的流速為8mL/L/h。作為一種優選方案，步驟(1)中所述培養時間為48h。作為一種優選方案，步驟(1)中的培養中，PH值調節在5. 5。
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作為一種優選方案，步驟(2)中所述誘導表達的時間為72h。作為一種優選方案，步驟(3)中所述分離純化是離心得粗酶液，用丙酮沉澱和離 子交換層析對粗酶液進行純化，丙酮濃度為65%，離子交換層析柱pH為5. 5。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
1、本發明適用於5000L發酵罐進行中試發酵，實現了生產水平上的發酵放大，且工藝 穩定，產物表達量是非高密度發酵的近20倍；
2、通過本發明獲得的耐高溫植酸酶，90°C下保溫20min後殘留酶活在69%以上，可以滿 足飼料高溫制粒的要求，且優於市場產品；
3、本發明建立的植酸酶分離純化方法，步驟簡單，且回收率高，達50%以上。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。
實施例(1)耐高溫植酸酶基因工程菌高密度培養階段
以10%的接種量將植酸酶基因工程菌種子接種於5000L全自動發酵罐中，培養溫度 30°C，用14%氨水調pH至5. 5，調節轉速、通風量來控制溶氧大於20% ；發酵培養16h後，溶 氧迅速回升，此時開始以恆溶氧方式補加碳源葡萄糖，培養32h補料結束。(2)甲醇誘導表達耐高溫植酸酶
植酸酶基因工程菌高密度培養結束，碳源葡萄糖耗盡，溶氧上升，開始以8mL/L/h流加 甲醇進行誘導表達植酸酶，同時PH用濃氨水調至pH6. 0，通過調節轉速、通風量等使溶氧維 持在10%左右，誘導表達72h，植酸酶酶活達到6000IU/mL以上。(3)耐高溫植酸酶的分離純化
發酵結束後，發酵液經離心得粗酶液，採用丙酮沉澱和S印harose離子交換層析對粗 酶液進行純化，丙酮濃度為65%，離子交換層析上柱pH為5. 5，植酸酶酶活回收率達50%以 上；經濃縮即可獲得目的表達產物植酸酶。通過本發明獲得的耐高溫植酸酶，90°C下保溫20min後殘留酶活在69%以上。
權利要求
一種植酸酶基因工程菌的發酵方法，其特徵在於所述方法包括如下步驟(1)植酸酶基因工程菌高密度培養階段將植酸酶基因工程菌種子接種於發酵罐中培養，待初始葡萄糖耗盡後，DO值迅速回升時，補充碳源直至高密度培養階段結束；(2)誘導表達用甲醇誘導表達植酸酶後結束髮酵；(3)分離純化。
2.根據權利要求1所述的植酸酶基因工程菌的發酵方法，其特徵在於步驟(1)中所述 碳源為葡萄糖。
3.根據權利要求1所述的植酸酶基因工程菌的發酵方法，其特徵在於步驟(1)中的補 料方式為分批補料、恆溶氧流加。
4.根據權利要求1所述的植酸酶基因工程菌的發酵方法，其特徵在於步驟(1)中溶氧 維持在2(Γ50% ；步驟(2)中的誘導表達溶氧維持在10%。
5.根據權利要求1所述的植酸酶基因工程菌的發酵方法，其特徵在於步驟(1)中所述 補充碳源的時間是在發酵16h後。
6.根據權利要求1所述的植酸酶基因工程菌的發酵方法，其特徵在於步驟(2)中所述 甲醇的流速為8mL/L/h。
7.根據權利要求1所述的植酸酶基因工程菌的發酵方法，其特徵在於步驟(1)中所述 培養時間為48h。
8.根據權利要求1所述的植酸酶基因工程菌的發酵方法，其特徵在於步驟(1)中的培 養中，PH值調節在5.5。
9.根據權利要求1所述的植酸酶基因工程菌的發酵方法，其特徵在於步驟(2)中所述 誘導表達的時間為72h。
10.根據權利要求1所述的植酸酶基因工程菌的發酵方法，其特徵在於步驟(3)中所 述分離純化是離心得粗酶液，用丙酮沉澱和離子交換層析對粗酶液進行純化，丙酮濃度為 65%,離子交換層析柱pH為5. 5。
全文摘要
本發明公開了一種耐高溫植酸酶基因工程菌的發酵方法。本發明採用全自動發酵罐系統、低廉的培養基組分和恆溶氧分批補料技術進行耐高溫植酸酶基因工程菌的高密度培養，從而實現耐高溫植酸酶的高密度表達。與現有技術相比，本發明方法能大規模、高效表達耐高溫植酸酶，獲得的植酸酶產品耐高溫性良好，其耐熱性實現了90℃保溫20min後殘留酶活性在69%以上的效果，優於現有市售的商品酶製劑，可以滿足飼料高溫制粒的要求。
文檔編號C12N9/16GK101985615SQ20101056356
公開日2011年3月16日 申請日期2010年11月29日 優先權日2010年11月29日
發明者夏楓耿, 彭中健, 明飛平, 梁淑娃, 繆承杜, 藍碧鋒, 趙培靜, 黃樂天, 黃魁英 申請人:廣州市微生物研究所