基於aav-itr的基因表達微載體及其構建方法和應用的製作方法
2023-04-26 22:44:06 2
基於aav-itr的基因表達微載體及其構建方法和應用的製作方法
【專利摘要】一種基於AAV-ITR的基因表達微載體及其構建方法和應用。該微載體包括用於表達外源基因的基因表達框，所述基因表達框兩端分別連接有AAV基因組的ITR序列。其中，所述基因表達框優選採用線性表達框，包含在兩段ITR序列之間依次分布的CMV增強子、Chickenβ-actin啟動子、多克隆位點和SV40-Ploy(A)。尤為優選的，所述AAV基因組的ITR序列中不包含D序列。該微載體的構建方法包括：依次構建含有基因表達微載體序列的質粒pUC57-minivector、微載體擴增質粒pUC57-minivector-EGFP等，經酶切、熱變性和冷卻處理，獲得目標產物。本發明的微載體可以在宿主細胞中高效、穩定持久的表達外源基因，且無副作用，安全性高，同時，其構建方法簡單，成本低廉，易於規模化實施，有望在基因治療或基因工程等領域廣泛應用。
【專利說明】基於AAV-ITR的基因表達微載體及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種基因表達微載體，特別涉及一種新型的、基於腺相關病毒（AAV)倒 置末端重複序列（ITR)的基因表達微載體（AAV-ITR Mini Vector)以及該基因表達微載體 的構建方法和應用。
【背景技術】
[0002] 基因治療（gene therapy)是指通過基因工程技術將外源正常基因導入靶細胞，替 代異常基因、封閉或祛除致病基因、修復受損基因或重建調控系統等，以糾正或補償由於基 因缺陷和異常所引起的疾病，從而到達治療疾病的目的。基因治療已被廣泛用於治療遺傳 病、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病等，到2013年2月底為止，世界上已有1902種基因 治療藥物進入臨床試驗中。基因治療的關鍵技術是選用合適的載體將外源基因有效導入受 體靶細胞，並有效地進行外源基因表達。而基因治療的難點是載體的轉染、表達效率低以及 存在安全隱患，因此研發能夠穩定轉染並且安全有效的基因治療載體是現今基因治療研究 領域的重點。傳統的基因治療表達載體有病毒表達載體及質粒表達載體。儘管病毒載體具 有轉染效率高、靶向性強的優點，但其潛在的致癌性、致毒風險、自身免疫原性和造成細胞 病理改變等缺點在一定程度上限制了其在基因治療中的廣泛應用。質粒載體中含有細菌復 制序列、抗性基因、未甲基化的CpG序列和一些可能隱藏的表達信號，這些序列在質粒複製 時是必需的，但在基因治療過程中可能引發嚴重的安全性問題。所以研究開發具有穩定性、 安全性和靶向性的非病毒載體日益受到重視。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的之一在於提供一種基於AAV-ITR的基因表達微載體，其在應用時能 夠實現外源基因在宿主細胞內的高效、穩定、安全的表達，從而克服了現有技術中的不足。
[0004] 本發明的目的之二在於提供一種構建前述基於AAV-ITR的基因表達微載體的方 法。
[0005] 本發明的目的之三在於提供前述基於AAV-ITR的基因表達微載體在表達外源基 因中的應用。
[0006] 為實現上述發明目的，本發明採用了如下技術方案： 一種基於AAV-ITR的基因表達微載體，包括用於表達外源基因的基因表達框，所述基 因表達框兩端分別連接有AAV基因組的ITR序列。
[0007] 進一步的，所述基因表達框包括線性表達框。
[0008] 作為較為優選的實施方案之一，所述基因表達框包含在兩段AAV基因組的ITR序 列之間依次分布的CMV增強子、Chicken β-actin啟動子、多克隆位點和SV40-Ploy(A)。
[0009] 作為較為優選的實施方案之一，所述AAV基因組的ITR序列中不包含D序列。
[0010] -種基因表達載體質粒，其特徵在於，包括如上任一項所述的基因表達微載體。
[0011] 如上任一項所述基因表達微載體和所述基因表達載體質粒在宿主細胞內穩定表 達外源基因的用途。
[0012] 一種基於AAV-ITR的基因表達微載體的構建方法，包括： (1) 提供AAV-ITR表達框，並克隆在pUC57質粒的多克隆位點，獲得含有所述基因表達 微載體序列的質粒pUC57-mini vector，其中，所述基因表達微載體包括兩組AAV基因組的 ITR序列，該兩組ITR序列之間分布有用於表達外源基因的基因表達框； (2) 將EGFP序列克隆至載體質粒pUC57-minivector，獲得微載體擴增質粒 pUC57-minivector-EGFP ； (3) Notl酶切微載體擴增質粒pUC57-minivector-EGFP，並回收目的片段 ds-minivector-EGFP，而後依次進行熱變性和冷卻處理，獲得所述基因表達微載體。
[0013] 作為較為優選的實施方案之一，該方法還可包括： (2X)以pUC57-minivector-EGFP為模板，PCR擴增該兩組ITR序列中的兩組D序列之 間的DNA片段，獲得微載體擴增質粒pUC57-minivector- Λ D - EGFP ;以及， (3Χ)參照步驟（3)的操作處理微載體擴增質粒pUC57-minivector-AD - EGFP，獲得 不含D序列的所述基因表達微載體。
[0014] 具體的，該方法包括： (1) 提供AAV-ITR表達框，並克隆在PUC57質粒的多克隆位點，獲得含有所述基因表達 微載體序列的質粒pUC57_minivector ; (2) 以含有EGFP的質粒pds-AAV-CB-EGFP為模板，通過PCR擴增得到EGFP 序列，再將EGFP序列克隆至載體質粒pUC57-minivector,獲得微載體擴增質粒 pUC57-minivector-EGFP ； (3) Notl酶切微載體擴增質粒pUC57-minivector_EGFP，並以凝膠回收試劑盒回收目 的片段ds-minivector-EGFP，回收的雙鏈DNA進行沸水浴處理至完全變性，然後將熱變性 的DNA迅速置於冰上冷卻，獲得所述基因表達微載體。
[0015] 所述基因表達框包含在兩段AAV基因組的ITR序列之間依次分布的CMV增強子、 Chicken β-actin 啟動子、多克隆位點和 SV40_Ploy(A)。
[0016] 與現有技術相比，本發明至少具有如下優點：該基於AAV-ITR的基因表達微載體 可以在宿主細胞中高效、穩定持久的表達外源基因，而且，該基因表達載體只包含外源基因 表達必需兀件，而不含有質粒的細菌複製子序列、抗性基因序列等非宿主細胞DNA序列，特 別是細菌的CpG序列，從而可以降低免疫反應、細胞炎症反應以及細胞毒性等不良副作用， 安全性更高，同時，該基因表達載體的構建方法簡單，成本低廉，易於規模化實施。本發明有 望在基因治療或基因工程等領域廣泛應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017] 圖1是AAV-ITR的二級結構圖； 圖2是AAV的ITR中D序列的結構示意圖； 圖3是本發明的一種基因表達微載體的結構示意圖； 圖4是質粒pUC57-minivector的結構示意圖； 圖5是質粒pUC57-minivector_EGFP r的結構不意圖； 圖 6 是 pUC57_minivector-Δ D - EGFP 的構建流程圖； 圖7是本發明的一種基因表達微載體的製備工藝流程圖； 圖8是本發明一較佳實施例中S1核酸酶處理AAV-ITR微載體的電泳圖，其中，1-3分 別為未經S1核酸酶處理的質粒、ds- DNA和AAV-ITR微載體；4-6分別為經S1核酸酶處理 的質粒、ds- DNA和AAV-ITR微載體。從圖中可以看出質粒和雙鏈DNA不能被S1核酸酶降 解，而AAV-ITR微載體能被S1核酸酶完全降解； 圖9是本發明一較佳實施例中相同濃度的ds-DNA熱變性後復性的電泳圖，其中，1、3、 5 道是 1600bp、2700bp、1900bp 的雙鏈 DNA ;2、4、6 道是 1600bp、2700bp、1900bp 的單鏈 DNA。 電泳結果顯示含有ITR序列的雙鏈DNA能完全變性，且沒有復性；而不含ITR序列的雙鏈 DNA有一部分DNA發生了復性。
[0018] 圖10是本發明一較佳實施例中不同濃度的ds-DNA熱變性後復性的電泳圖，其 中1-6道為不包含ITR雙鏈，1，未經處理，2-6道分別為濃度100ng/15uL、150ng/15uL、 200ng/15uL、250ng/15uL、300ng/15uL的雙鏈熱變性處理；7-12道為包含ITR的雙鏈，7,未 處理，8-12 道分別為濃度 150ng/15uL、200ng/15uL、250ng/15uL、300ng/15uL、350ng/15uL 的雙鏈熱變性處理。從圖中可以看出不含ITR序列的雙鏈DNA在濃度為100ng/15uL時 已經發生復性，在300ng/15ul時，復性程度很高，而含有ITR序列的雙鏈DNA在濃度達到 300ng/15ul時，仍能完全變性，在濃度為350ng/15ul時，有少部分復性； 圖11是以流式細胞儀所測等摩爾的質粒、雙鏈DNA、AAV-ITR微載體、AAV-ITR-AD微 載體在293T細胞的表達效率圖譜。
【具體實施方式】
[0019] 鑑於現有技術中的不足，本發明旨在提供一種基因表達微載體（AAV-ITR Mini Vector，或稱AAV-ITR微載體)，更具體的講，本發明提供了一種新型的、基於腺相關病毒 (AAV)倒置末端重複序列（ITR)的基因表達微載體（AAV-ITR Mini Vector)，同時還提供了 該表達微載體的構建方法和應用。
[0020] 該基因表達微載體的分子結構類似於AAV基因組，S卩：含有一個單鏈基因表達框， 單鏈DNA兩端為AAV基因組的ITR序列。
[0021] 其中，ITR序列在細胞中能行成一個自我互補的T型髮夾結構，使得微載體在細胞 中能形成穩定的環狀多聚體和類染色質結構，從而能在細胞中長期穩定存在，外源基因也 就能持續穩定表達。
[0022] 而線性基因表達框則僅含有啟動子、增強子、目的基因和poly (A)加尾序列，較小 的分子量有利於其轉染細胞和基因表達，此外幾乎不含細菌或病毒的DNA序列，還能使得 免疫反應、細胞炎症、細胞毒性、基因表達沉默化降到最低。
[0023] 作為其中的一個較為優選的實施方案，該基因表達微載體的基因表達框（AAV-ITR Expression cassette)可以採用如下設計：兩端為AAV的ITR序列，左右ITR序列之間為 一個可表達外源基因的線性表達框，依次為CMV增強子、Chicken β-actin啟動子、多克 隆位點（MCS)及 SV40-Ploy(A)，共 1239bp。
[0024] 對於前述的ITR，其結構可參閱圖1。具體而言，ITR係為AAV(Aden〇-associated virus,腺相關病毒）基因組兩端的倒置末端重複序列（inverted terminal repeats),其分 別由145個鹼基構成，其中前125nts (1?125nt)序列依次可分為A、B、B'、C、C'、A'等 不同的區段，形成3段迴文結構，B與B'、C與C'反向互補可形成T形髮夾結構的頂端，A 與A'構成T的長臂，另外，ITR上還有一個末端解鏈位點（Terminal resolution site， Trs)和一個D序列，該D序列特指ITR序列的後20個鹼基，左、右兩端的分別稱為D (-)序 列（CTCCATCACTAGGGGTTCC)和 D(+)序列（AGGAACCCCT AGTGATGGAG)(參閱圖 2)。D 序列是 ITR序列中唯一的非迴文序列，包含了末端解鏈位點（trs)和包裝信號。
[0025] 在本發明中，對於前述基因表達微載體，當去除ITR序列的D序列後，還可使基因 表達效率1?於質粒。
[0026] 以下結合一較佳實施例對本發明的技術方案作進一步的說明。
[0027] 一、AAV-ITR微載體序列的設計 根據AAV的基因結構特徵設計AAV-ITR Expression cassette:兩端為AAV的ITR 序列，左右ITR序列之間為個可表達外源基因的線性表達框，表達兀件依次為CMV enhancer>Chicken β-actin promoter、Multiple cloning site、SV40_Ploy(A),共1239bp (參閱圖3)。
[0028] 二、AAV-ITR微載體擴增質粒的構建 AAV-ITR Expression cassette序列由蘇州金維智公司合成，將其置於pUC57質 粒的多克隆位點，兩端為Notl酶切位點，便於微載體的擴增和製備，該重組質粒即為 pUC57_minivector (參閱圖 4)，AAV-ITR Expression cassette 可通過 Notl 酶切鑑定。
[0029] 利用 primer premier 5. 0軟體設計引物，上遊引物UP1 :5'- CCCATCGATGCCGCCATG GTGAGCAAGGGC ;下遊引物 LP2 :5' -CCCATCGATTTACTTGTACAGCTCGTCC-3'，兩條引物設計含有 Clal酶切位點。PCR反應體系為50 μ L，包含50ng模板質粒pds-AAV-CB-EGFP、上、下遊引物 各 0· 3 μ M、dNTP 0· 2mM、MgS04 1. 5mM、1 XPCR 緩衝液和 1U KOD-Plus-Neo (東洋紡生物科技 有限公司，上海XPCR擴增過程採用三步法：95° C預變性5min，95° C變性50sec，57° C 退火50 sec，72° C延伸 90 sec，共 30個循環，72° C終延伸 7 min。載體pUC57_minivector 質粒用Clal酶切，同時去磷酸化處理防止載體片段的自連，反應體系為20 μ L，包含16 μ L pUC57-minivector 質粒、2yL 10XBuffer、lyL Cla I 和 lyL Fast ΑΡ，反應條件為 37? 水浴作用30min ;PCR產物EGFP序列用Clal酶切，反應體系為50 μ L，包含23 μ L PCR目的 片段、5yL 10XBuffer、lyL Cla I，37°C 水浴作用 30min。然後用 Cycle pure kit 試劑盒 (Omega公司）快速回收酶切產物。（文中提到的所有限制性內切酶均為Fermentas公司產 品）。載體酶切片段和目的基因酶切片段在T4連接酶（NEB公司）的作用下，22°C下連接反 應30min。反應體系為20 μ L，包含2 μ L pUC57-minivector質粒酶切產物、5. 5 μ L目的片 段酶切產物、2yL 10XBuffer、lyL Τ4連接酶。連接產物轉化感受態細胞（sure cell)， 37°C過夜培養，12 h後氨苄抗性平板上有單菌落出現，挑取實驗組平板上單菌落，在含氨苄 的LB中培養16h，提取重組質粒質粒pUC57-minivector-EGFP，通過酶切和轉染體外細胞來 鑑定該重組質粒。
[0030] 設計引物上遊 UP3 :5' -GCG TCTAGAGGTACCCTAGTTATTATTAGTAATC ;下遊引 物 LP4 :5' -GCG TCT AGA TAA AAAACCTCCCACACCTCCC，均帶有 Xbal 酶切位點。以 pUC57-minivect〇r-EGFP質粒為模板擴增左、右D序列之間的DNA片段，以此替代包含D序 列的微載體序列，得到另外一個微載體擴增質粒pUC57-minivector- Δ D - EGFP，具體操作 方法同上。
[0031] 三、AAV-ITR微載體的製備 用Notl酶切擴增質粒pUC57-minivector-EGFP，凝膠回收試劑盒回收目的片段 ds-minivector-EGFP (約2000bp)。回收的雙鏈DNA沸水浴5min，使其完全變性，而後迅速 置於冰上冷卻2min，即得到AAV-ITR微載體(參閱圖7)。
[0032] 四、微載體的結構鑑定 (1)單鏈的鑑定 S1核酸酶是一種高度單鏈特異的核酸內切酶，在最適的反應條件下，能夠降解單鏈 DNA或RNA。用S1核酸酶分別處理AAV-ITR微載體、質粒和雙鏈DNA，反應體系為30 μ L，包 含4. 4yL DNA樣本、5. 5yL目的片段酶切產物、6yL 5XBuffer、0. lyL S1核酸酶。反應 條件為：25°C，30min。電泳結果顯示質粒和雙鏈DNA不能被S1核酸酶降解，而AAV-ITR微 載體能被S1核酸酶完全降解，證明確實形成單鏈(參閱圖8)。
[0033] (2)ITR結構的鑑定 分別用Xbal、Notl酶切處理質粒pUC57-minivector-EGFP，分別膠回收得到長度為 1600bp和2700bp的不含ITR序列的雙鏈片段、同時與ds-minivector-EGFP片段(含有ITR 序列，1900bp)進行熱變性處理(沸水浴5min後迅速冰浴2min)，然後進行Goldview染色電 泳，實驗結果顯示含有ITR序列的雙鏈DNA能完全變性，且沒有復性；而不含ITR序列的雙 鏈DNA在電泳過程中有一部分DNA發生了復性(參閱圖9)。
[0034] 此外，將不同濃度的不含ITR序列的雙鏈片段（1600bp)與不同濃度的 ds-minivector-EGFP片段進行熱變性處理，處理方法同上，電泳檢測，比較二者的差異。電 泳結果顯示，含有ITR序列的雙鏈DNA在濃度達到300ng/15ul時，仍能完全變性，在濃度為 350ng/15ul時，有少部分復性；而不含ITR序列的雙鏈DNA在濃度為300ng/15ul時，復性 程度很高，在濃度為l〇〇ng/15ul時，仍有DNA復性(參閱圖10)。通過上述結果證明得到的 微載體包含ITR結構。
[0035] 五、AAV-ITR微載體在體外細胞中的表達 取對數生長期人胚胎腎細胞系293T細胞接種於24孔板，每孔500ul，密度為2X 105/ mL，培養在含10%小牛血清，青黴素，鏈黴素各100U/L的DMEM培養基中，置於37°C，5% C02 的飽和溼度培養箱中培養。待細胞密度約為60% (-般為18-24h)，即可進行DNA的轉染。 將熱變性處理得到的微載體AAV-ITR-ΛD- EGFP、原始微載體AAV-ITR- EGFP、擴增質粒和 未變性雙鏈DNA分別進行細胞轉染，1 μ g加 HBS至50 μ L，混勻後靜置10min ;PEI (50mM， 0. 9 μ L)加 HBS至50 μ L，混勻後靜置10min ;二者混合（100 μ L)、混勻後靜置10min，將該 PEI-DNA混合液加入至用PBS溶液清洗過的293T細胞表面，再加入適量培養基，置於37°C， 5% C02的飽和溼度培養箱中培養，分別於轉染後24h、48h、60h、72h，利用螢光顯微鏡觀察 GFP的表達情況。第72h時，用0. 25%胰酶進行消化，1000r/min，5min離心收集細胞，再 用lmL PBS溶液重懸細胞，通過流式細胞儀檢測GFP的表達情況。結果發現，原始微載體 AAV-ITR- EGFP的螢光表達效率低於擴增質粒和未變性雙鏈DNA ;而去掉D序列後的微載體 AAV-ITR-Λ D- EGFP的螢光表達效率顯著提高，甚至超過擴增質粒和未變性雙鏈DNA (參閱 圖 11)。
[〇〇36] 需要指出的是，以上所述僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護範圍 並不局限於此，任何熟悉該技術的人在本發明所揭露的技術範圍內，可輕易想到的變化或 替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應該以權利要求的保護 範圍為準。
【權利要求】
1. 一種基於AAV-ITR的基因表達微載體，包括用於表達外源基因的基因表達框，其特 徵在於，所述基因表達框兩端分別連接有AAV基因組的ITR序列。
2. 根據權利要求1所述的基於AAV-ITR的基因表達微載體，其特徵在於，所述基因表達 框包括線性表達框。
3. 根據權利要求2所述的基於AAV-ITR的基因表達微載體，其特徵在於，所述基因表 達框包含在兩段AAV基因組的ITR序列之間依次分布的CMV增強子、Chicken β-actin啟 動子、多克隆位點和SV40-Ploy(A)。
4. 根據權利要求1-3中任一項所述的基於AAV-ITR的基因表達微載體，其特徵在於，所 述AAV基因組的ITR序列中不包含D序列。
5. -種基因表達載體質粒，其特徵在於，包括權利要求1-4中任一項所述的基因表達 微載體。
6. 如權利要求1-4中任一項所述基因表達微載體和權利要求5所述基因表達載體質粒 在宿主細胞內穩定表達外源基因的用途。
7. -種基於AAV-ITR的基因表達微載體的構建方法，其特徵在於，包括： (1) 提供AAV-ITR表達框，並克隆在pUC57質粒的多克隆位點，獲得含有所述基因表達 微載體序列的質粒pUC57-mini vector，其中，所述基因表達微載體包括兩組AAV基因組的 ITR序列，該兩組ITR序列之間分布有用於表達外源基因的基因表達框； (2) 將EGFP序列克隆至載體質粒pUC57-minivector，獲得微載體擴增質粒 pUC57-minivector-EGFP ； (3) Notl酶切微載體擴增質粒pUC57-minivector-EGFP，並回收目的片段 ds-minivector-EGFP，而後依次進行熱變性和冷卻處理，獲得所述基因表達微載體。
8. 根據權利要求7所述基於AAV-ITR的基因表達微載體的構建方法，其特徵在於，該方 法還包括： (2X)以pUC57-minivector-EGFP為模板，PCR擴增該兩組ITR序列中的兩組D序列之 間的DNA片段，獲得微載體擴增質粒pUC57-minivector- Λ D - EGFP ;以及， (3Χ)參照步驟（3)的操作處理微載體擴增質粒pUC57-minivector-AD - EGFP，獲得 不含D序列的所述基因表達微載體。
9. 根據權利要求7所述基於AAV-ITR的基因表達微載體的構建方法，其特徵在於，該方 法包括： (1) 提供AAV-ITR表達框，並克隆在pUC57質粒的多克隆位點，獲得含有所述基因表達 微載體序列的質粒pUC57-minivector ; (2) 以含有EGFP的質粒pds-AAV-CB-EGFP為模板，通過PCR擴增得到EGFP 序列，再將EGFP序列克隆至載體質粒pUC57-minivector，獲得微載體擴增質粒 pUC57-minivector-EGFP ； (3) Notl酶切微載體擴增質粒pUC57-minivector_EGFP，並以凝膠回收試劑盒回收目 的片段ds-minivector-EGFP，回收的雙鏈DNA進行沸水浴處理至完全變性，然後將熱變性 的DNA迅速置於冰上冷卻，獲得所述基因表達微載體。
10. 根據權利要求7或9所述基於AAV-ITR的基因表達微載體的構建方法，其特徵 在於，所述基因表達框包含在兩段AAV基因組的ITR序列之間依次分布的CMV增強子、
【文檔編號】C12N15/66GK104087613SQ201410307720
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月30日 優先權日:2014年6月30日
【發明者】張春, 平菡, 劉曉玫 申請人:中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所