通過元素分析實施的基因表達檢測的製作方法

2023-04-26 22:51:16

專利名稱：通過元素分析實施的基因表達檢測的製作方法
技術領域：
每文的4全測，其4吏用了標記有元素標籤或連接至元素吸入載體的互補
寡核苷酸。
背景技術：
生物"樣品"是指需要分析的生物種類的任何樣品。例如，樣
品可以包糹舌生物分子、糹且織、；jfu體、以及動物、糹直物、真菌、或細
菌的細胞。它們還可以包括病毒源分子。典型的樣品包括1"旦不限於
唾-液、血、血細月包(例3o白細月包)、糹且織或細4十活糹且織切片、尿、
腹水、以及胸膜液、或者來自那裡的細力包。生物樣品還可以包括組
織的切片(section)諸如用於組織學目的所取下的冷凍切片。另一 種生物樣品的典型來源是病毒和動物、 一直物、細菌、真菌的細胞培 養物，其中可以操縱基因的表達狀態以探究基因之間的關係。其它 的才羊品對本領iiU支術人員來i兌是已知的。
"RNA樣品"是生物樣品的核糖核酸(RNA)製品。它不僅 包4舌成熟的mRNA，而且包4舌RNA力口工中間體以及新生的 pre-mRNA轉錄物。例如，用多聚(T )柱純化的總mRNA含有具 有多聚(A)尾巴的RNA分子。這些多聚A+RNA分子可以是成熟 的mRNA、 RNA的力o工中間體、新生4爭錄本或降解中間體。
本文所使用的"核酸"是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合 物，為單鏈或雙鏈形式，諸如任何DNA或RNA或DNA/RNA雜交 分子。該術語是指任何DNA，包括^旦不限於，基因組DNA、線粒 體DNA、質粒DNA、葉綠體DNA、 cDNA、擴增的DNA或RNA 片段、總RNA、信使RNA、小核RNA。
"寡核苷酸"是長度範圍在2至約1000個核苷酸，更典型地 長度為2至約500個核苷酸的單鏈核酸。它也可以包括"鎖核酸" 分子(LNA)。
"LNA，，是指雙環高親和性RNA類似物，其中通過引入 02'，C4'-亞甲基橋^f吏核4唐的呋喃外唐環化學i也鎖定在RNA才莫擬結構 (RNA-mimicking conformation )中，導致對互補DNA和固A分 子的空前雜交親和性。短LNA ^f奮飾的寡核苷酸的熱穩、定性和改善 的錯配辨別力使得它們對於單核苷酸多態性(SNP)基因分型、基 於反義的基因沉默以及基因表達譜非常有用。
"靶核酸"是指互補寡核酸苷探針特異性雜交到其上的核酸 (經常源自生物樣品，因而也稱為樣品核酸)。把核酸可以源自4壬 何核酸源(例如，包括但不限於化學合成、擴增反應、法醫樣品， 等)。它或者存在或者不存在一種或多種待檢測的靶核酸，或者待 定量的 一種或多種耙核酸的量。^皮;險測的 一種或多種把核酸優選具 有這樣的核苷酸序列，其互補於它們特異性結合(雜交)的一種或 多種對應寡核苦酸探針的核苷酸序列。術語靶核酸可以指探針特異 性雜交至其上的較大核苷酸的特定子序列，或指其豐度(濃度)和
/或表達水平需4企測的整個序列(例如，基因或mRNA)。上述定義
的其它變型對本領域技術人員來說是已知的。
"探針，，是指通過互補鹼基配對(通常是氫鍵形式)結合至互 補序列的靶核酸上的核酸。如本文所使用的，寡核苷酸探針可包括
天然(即A、 G、 C或T)或如本領域4支術人員已知的修飾的鹼基 (例如， <旦不限於，7-脫氮鳥普(7-deazaguanosine)，月幾苷，等)。 另外，在寡核芬酸探針中的鹼基可以通過除磷酸二酯鍵之外的鍵合 (linkage)連接，只要它不幹擾雜交。因而，寡核苷酸探針可以是 肽核酸，其中構成》成基通過肽4建而不是磷酸二酯4建進行連接。特定 轉錄物的表達可以通過多個4笨4十，通常，5、 10、 15、 20、 30或40 個才笨針進行4企測。各個糹笨針可以靶向轉錄物的不同子區域。然而， 才罙4十可以重疊在輩巴區i或上。可以4吏用選才奪禾呈序例如Massachusetts Institute of Technology (MIT)的Primer 3來選擇或設計探針。根據本 發明，探針可以在3，或5，端，或者在寡核苷酸的中部用元素標籤進 行標記。在一種實施方案中，4笨針通過一個末端^皮固定在載體上。 探針的其它實例對本領域技術人員來說是熟知的。
"載體，，是已經通過例如吡咯-2,5-二酮(馬來醯亞胺)、碌酸 陰離子、或對(氯曱基)苯乙烯(但不限於這些)功能化的表面。 載體可以是，例如合成膜、珠粒(聚苯乙烯、瓊脂糖、矽石，等)、
在塑料微孔中的平的表面、載玻片、反應管等(不限於這些)。載 體的功能是作為連接探針或靶分子的固相而發揮作用。而在該定義 的另一種變型中，對本領域技術人員來說是已知的，載體是指在兩 個不同物質^犬態(液體和固體，固體和固體，'液體和'液體，液體和 氣體，氣體和固體等)之間的任意表面。
"連接至(到)栽體"是指直接連接或間接連接其上，包括通 過共價結合、氫鍵、離子相互作用、疏水相互作用、或使用連接至 寡核苷酸探針末端的特異性配體(用於與連接至栽體例如珠粒上的 配體結合分子進行特異性反應)的連接。例如，這樣的系統可以包
4舌生物素-鏈黴親和素(biotin-str印tavidin )，其中才笨4十攜帶生物素部 分而載體塗覆有鏈黴親和素。寡核苦酸探針至載體的共價化學連接 可以通過核酸上的5'-^粦酸至塗覆載體通過^粦酸醯胺4建 (phosphamidate bond )來完成。連接至栽體可以^昔助間隔分子實5見 以提供在探針與靶的雙鏈部分之間的間隔'。用於將寡核苷酸固定 至載體上的這樣的方法在本領域已經^艮好地建立2—4。而在這個定義
的另一種變型中，其對本領域」忮術人員來說是已知的，連接至栽體 是指與兩個不同物質狀態(液體和固體，固體和固體，液體和液體，
液體和氣體，氣體和固體等)之間的界面上的功能連4妻。
"元素標記的J朱粒"是功能地結合或吸收有(imbibed)具有一 種或多種同位素的一種元素或多種元素的載體5朱並立類型(例如，但: 不限於，聚苯乙烯、瓊脂糖、石圭石，等)。對於本領域4支術人員已 知的是，元素可以是化學結構部分(chemical moiety)的原子部分 (atomic part )。
"惟一標記的珠粒"是指在珠粒中吸收有一種或多種元素的一 種或多種同位素的大量原子的物理實體， -使得通過元素分析^使標記 有一種類型的所述元素的所述^朱粒的一種類型與所述元素的<壬{可
其它類型相區別。各個惟一標記的載體具有能夠與特定靶核酸特異 性地雜交的大量類似或不同的寡核苷酸。
"元素標籤(element tag)"是一種化學結構部分(chemical moiety ),其包括連接至負載分子結構的具有 一種或多種同位素的一 種元素原子或大量元素原子。元素標籤還包括將標籤連接至底物的 方式，其可以包括(但不限於)吡咯-2,5-二酮(馬來醯亞胺)、磺 酸陰離子、或對(氯甲基)苯乙烯(分別用於石克醇、N-末端，或 C-末端)。 一種元素標籤可以與在相同樣品中的大量其它元素標籤 相區分，因為它的元素或同位素組成與其它標籤的不同。
"過渡元素"是指具有以下原子序數的任何元素，21-29， 39-47, 57-79以及89。過渡元素包括稀土元素、鑭系元素以及貴金屬(Cotton and Wilkinson, 1972 )。
"親和性產品"或"親和性試劑"是指已知的與相應的靶分子 (肽、抗原、小分子等)形成高特異性非共價鍵的生物分子(抗體、 適體(aptamer)、凝集素、序列淨爭異'f生結合月太(sequence-specific binding peptide )等)。標記有惟一元素標籤的親和性試劑是標i己有 惟一的並且與相同樣品中大量其它元素標籤相區別的元素標籤的 親和性產 品Q
"特異性雜交至"，是指當該序列存在於複合混合物(例如， 總細月包的)DNA或RNA中時，在嚴格的條件(stringent condition ) 下核酸分子優先地結合、雙聯(duplex)或雜交至特定的核苷酸序 列。雜交條件的最優化對本領域4支術人員是已熟知的，在WO 95/219445中進行了總結。術語"嚴格的條件"是指在這樣的條件下 探針將優先地雜交至它的靶序列，較低程度上或者根本不與其它序 列雜交。嚴4各的條件取決於序列並且在不同環境下而不同。較長的 序列在較高的溫度特異性雜交。通常，對於短探針(例如，10至50個核苦酸)，嚴格的條件是其中鹽濃度至少約0.01至1.0M Na+ (或其它鹽)在pH7.0至8.0並且溫度為至少約30。C的條件。正如 本領域技術人員已知的，嚴格的條件也可以用加入破穩劑如曱醯胺 來達到。
"原位雜交"是指這樣的雜交技術其中互補單鏈核酸探針與 內源耙分子之間的雜交反應在特別製備的細胞或組織切片中進行 而不對把核酸進行純化。
"背景信號強度"是指由靶核酸與標記的寡核苷酸(例如，寡 核苷酸探針，對照探針，等)之間的非特異性結合、或其它相互作 用產生的雜交信號。
"錯配探針"提供與樣品中不是探針所指向的靶的核酸的非特 異性結合或交叉雜交的對照。
"寡(dT) n-元素標籤(oligo(dT)n匿el置ntal tag)"是金屬標 記的寡核苷酸，如在寡(dT)-LNA複合物中，其由悽t(n)個脫氧胸 普三磷酸核香和其它核苦構成，用作mRNA的多聚腺苷化區域的雜 交探針。脫氧胸苦三磷酸核苦的數量可以在約6至約50的範圍。
"元素分析"是這樣的過程，其中對樣品的元素組成以及有時 同位素組成進行分析。元素分析可以通過許多方法實現，包括光 學原子"^普，例如火焰原子吸收、石墨爐原子吸收，以及電感耦合等 離子體原子發射法，其探測原子的外部電子結構；質譜原子光譜， 例如電感耦合質譜，其探測原子的質量；X射線螢光，粒子誘發X 射線發射，X射線光電子"i普，以及^我歇電子i普，其糹果測原子的內部 電子結構。
"元素分析儀，，是採用 一種元素分析方法對樣品的原子組成進 行定量的儀器。
"顆粒元素"分析是其中所分析的樣品(由分散在液體中的顆 粒(例如在緩沖液中的珠粒)組成)以這樣的方式進行查詢
(interrogate)的過程針對單個顆粒(例如，逐個珠粒)對原子組 成進行記錄。分析儀器的實例是基於質譜計的流式細胞儀。
"溶液元素分析，，是其中所分析的樣品以這樣的方式進行查詢 的過程元素組成被平均分布在樣品的整個體積中。
"內標"被限定為已知量的化合物，與加入到未知物中的分析 物不同。來自分析物的信號與來自內標的信號進行比較以確定存在 多少分才斤物。當進4亍質{普定量時可以<吏用內標。內才示也可以通過只t 本領域技術人員來說已知的其它方式使用。
"固定和滲透"是指通過試劑例如戊二醛、曱醛、福爾馬片木、 乙醇、甲醇等的細月包成分的化學交聯，以及用清潔劑在細月包膜中產 生孔。合適的清潔劑可以容易地選自非離子清潔劑。期望這些清潔 劑以約0.001%至約0.1%之間的濃度使用。 一種可以使用的清潔劑 是Triton X-100 ( Sigma T9284 )。其它合適清潔劑的實例包括Ig印al 和Nonidet P-40。其它合適清潔劑可以由本領域技術人員容易地選 擇。
人類基因組計劃已經打開了大量基因序列信息的通道，這將有 助於診斷和治療多種人類疾病。然而，醫藥中的基因語(gene profiling)要求調整現存的方法並引入新的靈4文並可靠的4支術。用 於同時監測悽1千基因的基因組篩選方法包括這樣的4支術，如DNA 微陣列、差異顯示、以及基因表達系列分析(SAGE)。所有陣列的 基本原理是焚光或生物素標記的由樣品RNA產生的cRNA或cDNA
物質與連4妄至固體載體的寡核苷酸或互補DNA分子雜交。目前， 基因晶片陣列是所使用的主要平臺，其中載玻片表面是底物和螢光
-檢測方法6-1G。平面微陣列的替代是正由Luminex, BD
Biosciences, Illumina開發的珠粒陣列以及許多其它(4支術)。樣U求 陣列可通過將珠粒用不同比率的焚光染料浸漬或結合量子點 (quantum dot)或者通過在J朱粒表面上物理蝕刻條形碼來產生"。 孩爻陣列主要表現來自許多單獨細胞的累積信號並且涉及有關單個 細胞的信息的損失。樣品製品和通用參考標準是關鍵的，因為從細 胞的異質性群體獲得的基因組信息會干擾特定癌細胞的基因譜。
DNA診斷方法通常涉及通過聚合酶鏈式反應(PCR )或其它類 似的擴增技術進行靶序列的擴增以提高檢驗的靈敏度和特異性。在 PCR方法12中，製備對靶序列的相對互補鏈上的區域是互補的兩條 引物序列。過量的脫氧胸苷三磷酸連同熱穩定的DNA聚合酶(例 如Taq聚合酶)加入到反應混合物中。如果耙序列存在於樣品中， 通過加入核苦酸，引物會結合到靶上並且聚合酶將使得引物沿著耙 序列延伸。通過升高和降低反應混合物的溫度，延伸的引物反應產 物將乂人把上分離變成新耙。過量的引物會結合到輩巴上以及反應產物 上，重複該過程。
存在幾種用於多重檢測單個細胞中的核酸的方法，但它們目前 還沒有將定量與大量的多重4企測(multiplexing)結合。半定量的原 位雜交組織4匕學(ISH)是一種用於4企測單個細月包中特異性RNA序 列的存在並估計其相對豐度的技術13;14。信號的可視化通常通過發 色底物或螢光染料來實現，對於多重才企測並不容易小務改。細胞遺傳 學家還研發了一種稱為螢光原位雜交(FISH)的獨特染色體表徵方
二者中雜交使互補序列可視化。RNA FISH目的是在細胞分區中定 位mRNA的轉錄〗立點。Levsky和合作者採用先進的計算才幾化焚光
顯孩i鏡和多重寡聚DNA探針的工作18已經證明對原位培養的細胞 的細月包核中的十一種基因同時產生FISH i普的可4亍性。另外，通過 使用時移視頻顯微鏡，可以將活細胞中的轉錄位點、mRNA合成和 蛋白產物的可誘導陣列可一見化19。基於傅立葉光譜的光譜成像
(Sim)已經表明對RNA物質的定量分析2、通過與六個惟一標記 的、對於不同的酪氨酸激酶基因具有特異性的cDNA4罙針雜交來鬥企 測RNA的相對量，而光謙圖形使用預先記錄的基準光語和去巻積 軟體進行分析。定量螢光原位雜交(Q-FISH)與流式細胞糹支術結合
(稱為流式FISH)已經應用到白細胞系中的端粒長度的研究，其 採用優化的用於常》見和快速分析的條件21 。
因此，用於對單個細胞中基因和蛋白表達分析的高靈敏、定量 和多重系統的發展對於分子研究和診斷來說仍然是困難的目標。元 素分析，與特定目的的試劑相結合，具有實現這一目標的潛能。
微球或珠粒對於免疫檢測的負載表面化學是一種具有吸引力 的選4奪。可以以類似於96孑W反的方式，構成或加入各種組合、塗 料或軛合基團以提供所需的表面化學。微球的 一 個優點是能夠提高 單位體積的反應混合物的反應表面積，這提供了提高免疫檢測的能 力和動力學範圍潛力的可靠方式。在下面的實例中，免疫;^測可以 與ICP-MS檢測相結合22。最初用於多參數細胞分析而研發的流式 細胞技術也廣泛用於檢測軛合到微球表面的抗原和寡核苷酸23。
傳統的微球技術(基於螢光染料發射檢測)被認為作為一種探 測基因組和蛋白質組功能的工具，具有4艮大的希望。惟一標記的珠 粒的顆粒元素分析隨時準備徹底變革基因表達研究、臨床診斷以及 癌症研究。具有嵌入金屬的聚苯乙烯J朱粒用薄的聚矽烷層塗覆，以 防止通常在粘結對目色i普(bonded-phase chromatography )中1"吏用的元 素浸析。聚苯乙烯珠粒根據傳統的乳液聚合進行製備，苯乙烯作為 單體而過硫酸鉀或過氧化笨曱醯作為聚合劑。等位基因特異性寡核 普酸(互補糹笨針)共《介固定在表面上。對於相同的基因，顆粒可以 攜帶1種或多種8不同的互補寡核苷酸探針。與從生物樣品中分離
的mRNA或PCR產物(靶基因)進行雜交，其中加入元素標籤用 於革巴鑑別。顆4立逐個i也進4亍流式元素分衝斤(flow-elemental analysis ), 例如流式ICP-MS以鑑別顆粒種類並且定量基因表達水平。吸收有 一種元素(Eu)並用羧基殘基衍生的微球可以從Seradyn Inc.獲得 並且在本申請人的教導中作為主要實驗的證據進行試驗。對元素標 籤的要求與螢光標籤的那些相比是寬鬆的，因為元素的化學特性對 於通過ICP-MS對其4企測來i兌並不重要。該方法的基本原理要求， 元素標籤含有一種可重複數量的並且優選大量的給定同位素的原 子。所結合的鑑定原子的數量的可重複性對於定量分析來說是基 礎，那些原子的數量的增加線性地提高了靈敏性。
新型流式類ICP-MS 4義器可以用於通過顆4立元素分析對個別白 血病細胞的基因表達譜。為了這一目的，大量mRNA種類可以通過 原位雜交進4亍4企測。多重才企測可以通過用不同稀有金屬元素標籤標 記寡核苷酸糹笨針來實現，其中稀有金屬元素標籤可以用ICP-MS儀 器特異鑑別。RNA檢測的靈敏性可以通過每個轉錄物使用三個至八 個寡核苦酸探針並且每個探針標記有給定元素的多個標籤來改善。 在用多個基因進行多重實驗前，各個轉錄物被分別雜交以確保表達 水平獨立於多重4企測。估計單個細月包表達約10,000個mRNA，總 RNA量約l-10pg。在白血病患者樣品中，中等豐度的轉錄物每個
細胞20至100個拷貝，而高豐度-超過1000個拷貝的融合轉錄
物。通過流式ICP-MS的單細胞RNA譜與在前進行的微陣列分析 的直4妾比4交，可以用來-驗i正該新型方法。所感興趣的基因的選4奪可 以 共可獲4尋的才居庫進4亍，如 NCBI (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ )、基因組及其表達的集成分 子分析 (Integrated Molecular Analysis of Genomic and their Expression) (IMAGE)耳關盟以及基因糹且研究院(The Institute for
Genomic Rearch ) ( http:〃www.tigr.org )。另夕卜，4吏用具有元素才示籤的 互補寡核苷酸並用均質細胞樣品(培養的細胞系、來自原始細胞危 象的患者的白血病樣品)進行的原位雜交，可以通過溶液ICP-MS 進行分析，以確定均布整個樣品的平均基因表達譜(示意圖在圖2A 示出)。
針對一些白血病相關基因(G-CSF受體，Bax， Bcl-2， c-Fos 等)的、用生物素標i己的即用cDNA雜交4果4十可以由商業來源 (Maxim Biotech Inc., GeneDetect Inc.)和研究實'驗室獲得。寡核芬 酸探針可以用軟體算法(商業和公共獲得)進行設計，用本領域技 術人員已知的最優化雜交參悽史(例如熔化溫度(Tm )、 50%G+C含 量、所期望的探針長度)選擇序列。在選擇過程中努力使髮夾結構 和探針之間的二聚體的形成最小化，並減少與其它靶序列的同源雜 交(cross-homology )。寡核苦酸可以通過在本領域已知的標準方法 合成，例^口通過4吏用自動DNA合成4義(侈'H口可商購自Biosearch， Applied Biosystem等)合成。作為實例，石充代磷酸寡核苦酸可以通 過Stein等的方法合成24。在申請人的教導中，通過功能化學，羧 基-或氨基烯丙基-修飾的寡核苷酸可以連接至元素標籤或惟一標記 的載體，例如珠粒。將功能團置於DNA鏈的5'端並採用合適的試 劑以將修飾的DNA連4妾到惟一標記的載體(例如5朱粒)的表面上， 將使核酸能夠共價連接到載體上。例如，可以使用碳二亞胺(EDC) 化學，以將具有胺標記的DNA連接到羧基修飾的顆粒上。
本發明4是供了在快速分析成千上百個mRNA分子中的更好的 靈敏性和精確性。通過排除mRNA耙的螢光標記進一步提供了檢測 基因表達水平的改善的功歲丈和4青確性，同時確〗呆在生物才羊品中RNA 水平的定量和高通量4企測。本發明還可用於一企測其它4亥酸，例如， 基因組DNA。例如，單個DNA《連在一端連4妄至元素標籤，而整個 分子雜交至與惟一標記的載體(例如珠粒)相連的互補寡核普酸上。

發明內容
本申請人的教導的這些和其它特點敘述如下。
本申請人的教導的 一個方面是提供一種用於細胞分析的方法，
包4舌(a)才是供糹田月包或糹田月包茅貞#立；(b)固定糹田月包或糹田月包茅貞衝立；(c)
該探針標記有唯一的元素標籤，使得標記有一種類型的所述標籤的 所述探針的 一種類型通過元素分析與標記有不同類型的所述標籤 的所述一罙針的任何其它類型是可區分的；(d)通過嚴格的洗滌條件 將未雜交的探針與雜交至耙核酸的探針分離；以及(e)通過元素 分析對細胞或細胞顆粒進行分析，以鑑別糹罙針並定量結合至靶核酸 的探針。標記有不同元素標籤的兩種或多種不同的探針可以雜交到 兩種或多種草巴核g交上。革巴核酸可以選自以下物質《且成的組細月包內 核酸分子、基質RN A (matrix RNA)、小RNA ( microRNA )、基因 轉錄前體RNA、信使RNA、轉運RNA、核糖體RNA、染色體DNA、 線粒體DNA、葉綠體DNA、病毒DNA、病毒固A、細菌DNA、 細菌RNA、以及質粒DNA。該方法可以進一步包4舌同時分析表面 和/或細胞內蛋白分子、表面和/或細胞內脂質分子、表面和/或細胞 內多糖分子、和/或表面和/或細胞內小分子。小分子可以選自由維 生素、激素、半抗原以及核苷(例如，ATP、 ADP、環狀AMP和 NADH)組成的組。
上述方面的進一步，細胞或細胞顆粒可以與對表面或/和細月包內 分子為特異性的親和性試劑反應，親和性試劑標記有元素標籤，該 元素標籤包含連接至負載分子結構的、具有一種或多種元素的一種 或多種同位素的多個原子的化學結構，使得標記有一種類型的所述 標籤的所述親和性試劑的一種類型通過元素分析與所述標籤的任 何其它類型是可區分的，接著將未結合的親和性試劑與結合的親和 性試劑分離。表面或/和細胞內分子可以是蛋白質、脂質、多糖和/
或小分子。親和性試劑可以選自由抗體、適體、凝集素和小分子組 成的組。細胞可以是動物、植物、細菌或真菌的全細胞。細力包顆粒 可以選自由分離的染色體、分離的細胞核、分離的線粒體、分離的 葉綠體、分離的病毒、分離的細菌組成的組。探針可以選自由寡核
苦酸糹罙針、鎖核酸(LNA )分子、肽核酸(PNA )分子、質粒DNA、 擴增的DNA、擴增的RNA、 RNA片段、基因組DNA片段組成的 組。
本申請人教導的另一方面是提供一種用於生物分子均質分析 的方法，包括(a)在使親和性試劑能夠與生物分子結合的條件下， 用標記有元素標籤的親和性試劑以及惟一標記的顆粒(使得標記有 一種類型的所述標籤的所述顆粒的一種類型通過元素分析與標記
育生物分子；(b)將結合有生物分子的顆粒與未結合的顆粒分離； (c)通過顆粒元素分析測定所結合的顆粒，其中顆粒分散在液體 中以定量測定單獨顆粒的原子組成和同位素組成，從而才企測連接到 所述顆粒上的生物分子的類型和悽t量。顆粒可以是J朱粒。生物分子 可以來自糹且織或細力包才羊品。才羊品可以選自由動物才羊品、 一直物4羊品、 細菌4羊品、以及真菌才羊品組成的組。生物分子可以選自由mRNA、 蛋白質、脂質、多糖以及小分子組成的組。生物分子與親和性試劑 的結合可以包括mRNA分子與連接到惟一標記的樣t球上的寡核苷 酸的雜交。寡核苷酸可以包括多種脫氧胸苷三石粦酸核苷 (deoxythimidine triphosphate nucleoside )以及連4妻到'準一才示"i己的孩i 球上的互補核酸探針。互補核酸探針可以選自由寡核苷酸、LNA、 PNA以及質粒DNA組成的組。生物分子可以選自由蛋白質、月旨質、 多糖以及小分子組成的組，它們與連接到惟一標記的微球的元素標 記的親和性試劑相結合。親和性試劑可以選自由抗體、適體、以及 凝集素、核酸、結合肽、蛋白質受體以及磷脂組成的組。
本申i青人的教導的另 一 方面是用於4全測和測定才羊品中元素的 試劑盒，其中所測定的元素的是連4妄到與所感興趣的核酸互補的特
異性探針上的元素標籤，該試劑盒包括(a)用於直接標記互補探 針的元素標籤；以及(b)互補探針。試劑盒可以進一步包括關於 以下的說明書i)用元素標籤直接標記^^笨針；ii)固定和滲透細胞 或細胞顆粒；iii)在雜交溶液中用元素標記的探針培育細胞或細胞 顆粒；iv)將結合的探針與未結合的探針分離；v)溶解具有雜交材 4+的細月包或細月包顆並立；以及vi) 4企測和測定元素標記的撰:4十。；險測 和測定可以通過體積元素分析或顆粒元素分析進4亍。
本申請人的教導的另一方面是糹是供一種用於#r測和測定樣品 中元素的試劑盒，其中所測定的元素是連4妻到與所感興趣的核酸互 補的特異性糹笨針上的元素標籤，該試劑盒包括(a)標記有元素標 籤的互補探針。試劑盒可以進一步包括關於以下的說明書i)固定 和滲透細胞或細胞顆粒；ii)在雜交溶液中用元素標記的探針培育 細胞或細胞顆粒；iii)將結合的探針與未結合的探針分離；iv)溶 解具有雜交材料的細胞或細胞顆粒；以及v)測定和測定元素標記 的探針。
上述試劑盒可以進一步包括與多種核酸互補的多種特異性才冢 針以及用於惟一標記各個類型的探針的多種惟一元素標籤。上述試 劑盒可以進一步包括(a)用於選自由蛋白質、脂質、多糖和小分 子組成的組的細力包內或細^>外生物分子的親和性試劑；以及(b) 對生物分子的親和性試劑進^f於標記的元素標籤。試劑盒可以包^fe關 於以下的說明書(i)對生物分子的親和性試劑進行標記；(ii)用 生物分子的親和性試劑培育細胞或細胞顆粒；(iii )將結合的生物分 子的親和性試劑與未結合的生物分子的親和性試劑進行分離；(iv ) 衝企測和測定結合的生物分子的親和性試劑。最後，試劑盒可以包括
用於多種生物分子的多種特異性試劑以及對用於各個類型的生物 分子的各個類型的親和性試劑進行惟一標記的多種元素標籤。
本申請人的教導的另 一 方面是提供用於檢測和測定元素的試
劑盒，其中所測定的元素的是連接到寡(dT) n (其連接到可區分 的元素標記的顆粒上)上的元素標籤，該試劑盒包括(a)用於直 ，接標記寡(dT) n的元素標籤；(b )寡(dT ) n; (c)多種可區分 的元素標記的顆粒；以及(d)多種互補糹笨針。該試劑盒可以進一 步包括關於以下的說明書i)將多種互#卜探針直接連接到可區分元 素標記的顆粒上；ii )進4亍核酸純化；(iii )將元素標籤連4妾至寡(dT ) n; iv)使互補探針與元素標記的寡(dT) n反應；v)在溶液中用 耙核酸與連接至元素標記的寡(dT) n的互補糹果針(其連接到可區 分元素標記的顆粒上)雜交；vi)將結合的顆粒與未結合的顆粒分 離；vii)通過顆粒元素分析來檢測和測定結合的顆粒。該顆粒可以 是珠粒。多種互補探針可以用可區分元素標籤直接標記。
本申請人的教導的另 一方面是糹是供用於4企測和測定元素的試 劑盒，其中所測定的元素的是連接到寡(dT) n上的元素標籤(其 連4妄到可區分元素標記的顆粒上)，該試劑盒包括(a)用於直4妄 標記寡(dT) n的元素標籤；(b )寡(dT ) n; (c)連接到多種可 區分元素標記的顆粒上的多種互補4罙4十。試劑盒可以進一步包4舌關 於以下的說明書i)進行核酸純化；(ii)將元素標籤連接至寡(dT) n; (iii) 4吏互外卜4笨4十與元素標i己的寡(dT ) n反應；iv )在溶液中 用靶核酸與連接到元素標記的寡(dT) n的互補探針(其連接到可 區分元素標記的顆粒上)雜交；v)將結合的顆粒與未結合的顆粒 分離；vi)通過顆粒元素分析來4企測和測定所結合的顆粒。
本申請人的教導的另 一方面是用於檢測和測定元素的試劑盒， 其中所測定的元素的是連接到寡(dT) n上的元素標籤以及連接到 互補探針的惟一標記的顆粒的元素，該試劑盒包括(a)元素標籤標記的寡(dT) n;以及(b)連接到多種惟一標記的顆粒上的多種 互補探針。試劑盒進一步包括關於以下的說明書i)進行核酸純化；
ii) 用純化的核酸與連4妄到惟一標記的顆粒上的互補#14十進行雜交；
iii) 將惟一標記的顆粒與金屬標記的寡(dT) n反應；iv)將結合 的顆4立與未結合的顆並立分離；v)通過顆衝立元素分析來才企測和測定 結合的顆粒的元素。
在另一方面，顆粒可以-波固體載體耳又代。例如，載體可以是平 (例如玻璃或塑料)板、孔板、探針(嵌入到樣品中)或其它固體 材料。在這種情況下，固體表面不必必須為元素標記的，因為(在 板上或孔板上)位置能指示連接其上的互補探針的識別。說明書類 似於上述(i)至(v)，但是在這種情況下僅測定連接到寡(dT) n 上的元素。
上述的試劑盒可以進一步包括選自以下物質組成的組的試劑 和裝置解離溶液(dissociation solution),具有核酸結合膜的旋轉 柱(spin column )、用於從生物樣品中分離和純化核酸的純化柱、 用於擴增所純化的核酸的試劑和溶液、標準品、稀釋緩沖液、解離 1￡沖液、洗滌《爰沖液、雜交多爰沖液和測定^爰沖液。內源核酸可以在 形態上完整的細月包中原4立擴增。元素可以〗吏用質i普計來測定。元素 可以是同位素或離子。元素可以選自以下元素組成的組過渡元素、 貴金屬、鑭系元素、稀土元素、金、4艮、鉑、銠、銥和4巴。該元素 可以包4舌多於一種元素和/或多於一種同4立素和/或一種同4立素的多 於一個原子。親和性產品可以選自由抗體、Fab'、適體、抗原、激 素、生長因子、受體、蛋白質和核酸組成的組。試劑盒還可以包括 用於顆並立元素分衝斤的i兌明書。


本領域^支術人員應理解，下述的附圖4又是用於"i兌明目的。這些 附圖並不是為了以任何方式限制本申請人的教導的範圍。在附圖中 解釋說明本發明，這些附圖是為了例示而不是限制。
圖1. (A)在三種不同的情況下使用生物素標記的反義寡核苷 酸("寡(oligo )，，)對28S rRNA的原位雜交和流式細胞^r測。(1 ) -對應用無義生物素標記的寡核苷酸("寡")雜交的陰性對照細胞，
(2) -在室溫下用4%的多聚甲醛固定細月包15分鐘，接著用蛋白 酶K( Proteinase K)(5U/ml) 15分鐘，用28S rRNA寡核苷酸雜交；
(3) -在37°C用4%的多聚甲醛處理細胞15分鐘，蛋白酶K (Proteinase K )( 5U/ml )15分鐘，用28S rRNA寡核苷酸雜交；(4 ) -在37。C用4%的多聚曱醛固定細胞15分鐘，接著0.3% Triton-X100，接著蛋白酶K (Proteinase K) ( 5U/ml) 15分鐘，用 28SrRNA寡核香酸雜交。由(4)所表明的條件被選擇用於進一步 的實驗。(B )通過流式細胞術(左圖)和ICP-MS(右圖)的28S rRNA 原位雜交分析的比較。
圖2.通過ICP-MS對白血病細胞中的BCR/Abl (斷裂點簇區/ 阿貝爾+>白血病(Abelson leukemia ))基因表達分析。(A)用生物 素標記的寡核苦酸糹笨針對固定/滲透的細胞進行的用於形成 BCR/Abl融合基因的示例性原位雜交。生物素通過標記有4戈(Tb) 的鏈黴親和素(StrAv)來鑑別。將細胞顆粒溶解在HC1中，通過 溶液元素ICP-MS分析對細胞顆粒進行分析。用BCR/Abl反義寡探 針、28SrRNA (陽性對照)和無義寡糹笨針(B/A )以及無探針(對 照)雜交KG-la細胞(左圖)和K562細胞(右圖)的實驗結果； 背景和無義糹果針對應所減去的值。對樣品進行三次重複操作。悽t據
表示為鋱(Tb)對銥(Ir)內標信號的歸一化比率。
圖3.通過ICP-MS對粘附癌細胞的表皮生長因子受體(EGFR) 基因的表達分析。用EGFR、 D-細胞周期蛋白基因的基因特異性探 針、28S rRNA (陽性對照)以及無義陰性對照，B/A (B/A是用作 陰性對照的具有隨才幾名稱的隨才幾寡核苷酸)與A431細月包雜交。對 樣品進行三次重複操作。數據表示為鋱(Tb)對銥(Ir)內標信號 的歸一化比率。
圖4.通過ICP-MS在K562白血病細胞中同時進行的蛋白質和 基因的表達分析。(A)用28S rRNA和無義寡核普S吏探針(B/A ) 的原位雜交；(B)在雜交期間對BCR/Abl蛋白質和陰性對照IgG 的免疫標記值。對樣品進行三次重複操作。數據表示為銪(Eu)或 鋱(Tb)對銥(Ir)內標信號的歸一化比率。
圖5.原位雜交和ICP-MS基因表達分析的工作流程圖。
圖6.通過顆粒元素分析對元素標記的J朱粒進行基因表達分析 的工作流程圖。
圖7.通過ICP-MS同時進行基因和蛋白質表達分析的工作流 程圖。
具體實施例方式
本發明包括元素標籤的使用。在本申請人的教導的方法中所採 用的元素的選4奪是優選地基於其在所研究的樣品中的豐度以及該 元素對所研究的樣品是否有毒來進行選^奪的。
在本申請人的教導中，期望應用過渡金屬和稀土金屬族的多數 金屬。明智的是，選擇具有低毒性或無毒性並在生長介質和生物樣 品中具有低豐度的元素。例如，釩和汞可能對於某些細胞是有毒的，
而Fe、 Cu和Zn可以在一些細胞培養介質中以高濃度存在。另一方 面，Pr、 Ho、 Tb、 La，例如通常^皮哺乳動物細月包^艮好;也耐受並且在 環境中豐度不高。
可以<吏用標籤元素的不常見的同4立素組成以<更區分衝羊品中天 然存在的元素和標籤物質。如果標籤元素的相對豐度與所分析的給 定樣品中的元素的相對豐度充分不同，則是有利的。"充分不同" 是指在本發明的方法中可以在所研究的樣品中含有的背景元素基 礎上4企測輩巴元素標籤。實際上，正是標記的元素與樣品本體的內部 元素(inter-element)比率的不同，可有利地用於分析樣品。選4奪在 分析期間不產生幹擾信號(即不因具有相同質量而具有重疊的信 號)的元素標籤是可行的。因此，在一種樣品中可以同時進行兩次 或更多分析測定。另外，因為元素標籤可包含相同原子的多個拷貝 而製成，因此測定的〗言號可以大大力文大。
本申請人的教導的這些方面可以通過以下實施例而進一步理 解，這些實施例不應解釋為以任何方式限制本發明教導的範圍。
實驗1
在一種實施方案中，其中工作流程圖示於圖5中，通過以下步 -驟進4亍了用於ICP-MS 4全測的原4立雜交首先以這才羊一種方式處理 糹且織或細月包才羊品，以l吏草巴染色體衝亥@吏和染色體夕卜(extrachomasomal) 核酸能夠用於與互補探針雜交(固定/滲透)；然後將樣品暴露給標 記有不同元素標籤並與所感興趣的基因互補的一種糹笨針或多種探 針；第三，洗滌樣品以去除過量的未結合和非特異性相互作用的探 針；最後，對樣品進行顆粒或溶液元素分析。
實驗2
對於通過ICP-MS對元素標記的珠粒進行基因分析(工作流程 圖示於圖6)，總RNA從生物樣品分離，用軛合至寡核苷酸探針上 的唯一標記的珠粒與其雜交；將元素標記的寡(dT) 20探針；加入 混合物中；最後，^M立進行單顆粒ICP-MS分析。
^f吏用本領i或已知的方法乂人參會定才羊品中分離總RNA。例如，可 以-使用酸性胍鹽-苯酚-氯仿4是耳又法，或者可以〗吏用商業試劑如 TRIzol試劑(GIBCOL Life Technologies )用於乂人哺乳動物組織分離 RNA。另外，可通過寡dT柱色i普或通過4吏用(dT)n》茲i朱(見， 例如，Sambrook et a1.25, F. Ausubel et al.26 )分離信使RNA。方便;也， 使用RNeasy總RNA分離試劑盒，例如(QIAGEN )可以將總RNA 從哺乳動物細胞中分離。TRIzol提取中在乙醇沉澱步驟後用Rneasy 總RNA提取試劑盒進行第二次清除可能是有利的。可以需要一輪 的RNA擴增(Ambion試劑盒)。本領域技術人員將明了，這提供 了反義(aRNA)池。反義RNA用作把核酸時，選擇與反義核酸的 子序列互補的寡核芬酸探針。相反，當耙核酸池是正義核酸池時， 選衝奪與正義核酸的子序列互補的寡核苷酸糹果針。最後，當核酸池是
雙鏈時， 一笨4十可以是正義的或反義的，因為靭^核酸包4舌正義和反義 鏈二者。
表達水平對照是與生物樣品中組成型表達的基因特異性雜交 的探針，並用於進行歸一化。實際上任何組成型表達的基因提供用 作表達水平對照的合適靶。通常，表達水平對照探針具有與組成型 表達的"管家基因(houseke印ing gene )"(包括但不限於p-肌動蛋 白基因、壽爭4失蛋白受體基因、GAPDH基因、HPRT、 CPB、 G6PD、 28S rRNA以及類似、物的)子序列互^卜的序列。
本發明的方法可以用於核酸4企測，以及蛋白質4全測(用於鑑別 細菌、法醫科學)以及同時進行基因和蛋白質表達分析。
該方法還可以使用本4頁技術人員已知的載體，例如載皮片、 板或孔，代替珠粒或顆粒。
在這種方法的變型中，生物分子(例如但不限於蛋白質、脂質、 多糖)，結合標記有元素標籤並與塗覆有生物分子的"親和性試劑" 的唯一標記的載體結合的特異小分子(例如但不限於藥物、激素、
信息素、糖)。然後通過元素分析對載體進行分析，以鑑別所述生 物分子與小分子的反應(例如，作為受體結合生長因子)。在這種 情況下，小分子直接被標記，小分子分析物的識別是依靠於它們經 由親和性試劑與元素標記的5朱粒的結合，而J朱粒元素識別標誌與小 分子的標籤識別標誌共同確認並量化小分子。
實驗3
在另一種實施方案中，實施例的第一系列採用傳統的ICP-MS
儀器作為檢測器和含有親和性試劑的商購金屬(鑭系元素)進行。 應當理解，可以使用其他金屬並可以使用其他儀器用於元素分析。 使用了採用生物素標記的反義寡核苷酸探針(其設計成與人類白血 病細月包中特異的、疾病相關基因原位雜交)。通過與鑭系元素標記
的鏈黴親和素聯合來鑑別探針(見圖2A)。
對才莫型人類白血病細胞系試驗了用ICP-MS檢測進行原位雜交 的可行性，結果與流式細胞術進行比較(如圖1所示)。進行實驗 以確定最優的固定和滲透條件以及用於懸浮細胞(其隨後用於 ICP-MS基因表達分析)的原位雜交參數。如圖1所示將KG-1A細 月包固定(圖注)，然後在雜交;容液中用500ng/ml的生物素標i己的28S rRNA探針(5'-生物素-ATCCAACGCTTGGTGAATTC-3，，人類28S 核糖體RNA GI:337381 )或無義生物素標記的4笨針(B/A;陰性對 照)進行培育。接著洗滌和封閉反應(blocking),力o入鏈黴親和素 -PerCP (標記有苦葉鄉錄素(peridin chlorophyll)的《連黴親和素-一種
蛋白質)。圖1A示出了由FACSCalibur ( BD Biosciences )流式細月包 儀獲得的螢光強度圖。圖IB示出了 ICP-MS體積塊分析(volume bulk analysis ):雜交的細胞與鏈黴親和素-Tb ( DELFIA )反應，洗 滌並溶解在具有lppb Ir (銥內標)的濃鹽酸中。通過流式細胞儀 (FCM)和ICP-MS檢測均有清楚的人類28S rRNA的雜交信號。 因此，建立了使用標記有金屬的第二親和性試劑(鏈黴親和素-Tb) 實驗條件用於通過ICP-MS成功鑑別在白血病細胞中的高豐度組成 型轉錄本。
實驗4
下面的實施例表明用ICP-MS 4企測的原位雜交是靈敏的，足以 檢測中等豐度的白血病特異性基因種類。為了這一目的，使用了人 慢性髓系白血病細胞系(K562 )(已知其表達由b3a2編碼的 BCR/Abl致癌激酶)和反義寡核苷酸。實馬全的示意圖示於圖2A中。 我們比4交了〗吏用5'-生物素標記的BCR/Ab特異性反義探針 (BCR/ABL)、 5，-生物素標記的28S rRNA探針(陽性對照)以及 生物素標記的無義探針(B/A )在K562細胞和KG-1A細胞(急性 髓系白血病模型細胞系；不表達BCR/Abl轉錄本)中b3a2融合基 因的表達。如圖1所述將細胞固定和滲透，然後在或者含有生物素 標記的BCR/Abl、 28SrRNA、無義探針或者不含探針的雜交溶液中 J咅育分離的細月包4羊品。*接著洗滌和去於閉(blocking),加入《連黴親和 素Tb。通過溶液元素分析進行分析，其中所標記的細胞溶解在 HCl/Ir中，而全部才羊品(每個樣品0.3e6個KGla細胞和3e6個K562 細月包)用常》見的ICP-MS 4義器進行元素分析。結果示於圖2B中。 左邊的圖表明當在KG-la細胞中的28SrRNA水平非常高時，來自 BCR/Abl探針的信號在無義(B/A)和陰性對照(ctrl)的反應水平 上。另一方面，K562細胞(圖2B中的右圖)與BCR/Abl 4罙針強
烈雜交，比與28S rRNA的雜交低約14倍。這樣，ICP-MS可靠地 4企測了在K562細胞中的BCR/Abl基因水平。
實驗5
而在另一種實施方案中，使用粘附A431人類表皮癌細胞進行 了原位雜交實驗。已知這些細胞過度表達表皮生長因子受體 (EGFR )。將細胞4妄種到組織培養級96多孑L板(tissue culture grade 96-multiwell plate)中，並1吏其連4妾(attachment)和增殖兩天(每 孔約75e3個細月包)。才艮據圖1的圖注的方法(4)將細胞固定和滲 透；洗滌並在^L中用5'-標i己有生物素的反義寡核苷酸4罙4十28S rRNA、 EGFR、 D-細胞周期蛋白基因以及B/A雜交。每個探針重複 孔。探針與鏈黴親和素-Tb反應。在洗滌後，將細胞溶解在HCl/Ir 中並通過溶液ICP-MS進4亍分析。如來自圖3的證據，A431細胞表 達了較高量的EGFR、 mRNA，實質上較低水平的D-細胞周期蛋白 基因(並不是所有的細胞都增殖)並且示出了對陽性探針，28S rRNA 的強響應。
實驗6
下面的實驗說明了本申請人的教導在相同細胞中同時檢測蛋 白質和基因表達的獨特能力(見圖7)。為了這一目的，我們使用 K562才莫型細月包系，其表達高水平的p210 BCR/Abl蛋白質。將識別 BCR/Abl蛋白質(Cell Singalling Techno., Inc )的第一4元體或同型
(isotype ) 乂於照IgG用於在PermFlow 〉容'液(InVirion， Inc.)中固定 和;參透的細力包上。然後用PBS洗滌細力包，與第二抗兔-Eu偶耳關物
(DELFIA，Perkin Elmer )反應(見圖4B )。 4妾著將免疫標記的細胞 在DAKO原位雜交溶液(DAKO, Inc.)中預雜交，並用5，-生物素 標記的-28S核糖體RNA反義才果針或者用5'-生物素標記的-B/A無 義才笨4十作為陰性對照在室溫下雜交2小時。用4xSSC、 2x SSC、
0.2xSSC和PBS進4亍嚴格的洗滌(stringent wash )以將非特異性雜 交最小化。最後，細胞用鏈黴親和素-Tb偶聯物(DELFIA)培育， 並溶解在HCl/Ir中(圖4A)。如來自對比圖4A和圖4B的證據， 對於BCR/Abl蛋白質表達(Eu)染色和對核糖體基因表達(Tb) 探針標記的糹田月包，給出了比IgG對照染色和B/A探針標記的細胞顯 著更高的信號。
試劑盒:
本發明還提供了包括實現本發明方法的成分的試劑盒。
例如，提供了用於檢測和測定樣品中的元素的試劑盒，其中所
標籤，試劑盒包4舌(a)用於直4妄標記互補糹笨針的元素標籤；以及 (b)互補#罙針。試劑盒可以進一步包4舌關於以下的i兌明書i)用 元素標籤對探針直接標記；ii)固定和滲透細胞或細胞顆粒；iii)在
探針與未結合的探針分離；v)將具有雜交的材料的細胞或細胞顆 粒;容解；以及vi)測定和測定元素標記的〗笨針。4企測和測定可以通 過溶液元素分析或顆粒元素分析進行。
還提供了用於檢測和測定樣品中元素的試劑盒，其中所測定的 元素的是連接到與所感興趣核酸互補的特異性探針上的元素標籤， 該試劑盒包括(a)標記有元素標籤的互補4冢針。試劑盒可以進一 步包括關於以下的i兌明書i)固定和滲透細胞或細胞顆粒；ii)在 雜交溶液中用元素標記的探針培育細胞或細胞顆粒；iii)將結合的 4冢針與未結合的一罙針分離；iv)將具有雜交材料的細胞或細胞顆粒 〉容解；以及v)測定和測定元素標^己的4笨4十。
上述試劑盒可以進一步包括與多種核酸互補的多種特異性揮: 針以及用於惟一標記各個類型探針的多種惟一元素標籤。上述試劑
盒可以進一步包括(a)用於選自由蛋白質、脂質、多糖和小分子
於對生物分子的親和性試劑進行標記的元素標籤。試劑盒可以包括 關於以下的i兌明書(i)對生物分子的親和性試劑進行標記；(ii) 用生物分子的親和性試劑對細胞或細胞顆粒進行培育；(iii )將結合 的生物分子的親和性試劑與未結合的生物分子的親和性試劑進行 分離；(iv) 4企測和測定結合的生物分子的親和性試劑。最後，試劑 盒可以包括用於多種生物分子的多種特異性試劑以及用於對各個 種類的生物分子的各個種類的親和性試劑進行惟一標記的多種元 素標籤。
提供了用於檢測和測定元素的另 一種試劑盒，其中所測定的元 素的是連接到寡(dT ) n以及唯一標記的顆粒的元素上的元素標籤， 該試劑盒包括(a)用於直接標記寡(dT) n的元素標籤；(b)寡 (dT)n; (c)多種唯一標記的顆粒；以及(d)多種互補^笨4十。試 劑盒可以進一步包括關於以下的說明書i)將多種互補糹罙針直接連 接到唯一標記的顆粒上；ii)進行核酸純化；(iii)將元素標籤連接 到寡(dT ) n; iv )使連接到唯一標記的顆粒上的互補探針與純化的 核酸雜交；v)將結合的唯一標記的顆粒與金屬標記的寡(dT) n 反應；vi)將結合的顆粒與未結合的顆粒分離；vii)通過顆粒元素 分析來檢測和測定結合的顆粒的元素。顆粒可以是珠粒。在另一方 面，顆粒可以被固體載體取代。例如，載體可以是平(例如玻璃或 塑料)板、孔板、探針(嵌入到樣品中)或其他固體材料。在這種 情況下，固體表面並不必必須為元素標記的，因為位置(在板上或 孔板上)能指示連接其上的互補探針的識別。說明書類似於上述(i) 至(v)，但是在這種情況下僅測定連接到寡(dT) n上的元素。
提供了另 一種用於檢測和測定元素的試劑盒，其中所測定的元
素的是連接到寡(dT) n (寡(dT) n連接到可區分元素標記的顆 粒上)上的元素標籤，試劑盒包括(a)用於直接標記寡(dT) n 的元素標籤；(b)寡(dT) n; (c)連4矣到多種可區分元素標記的 顆粒上的多種互補糹冢針。試劑盒可以進一步包括關於以下的說明 書i)進行核酸純化；(ii)將元素標籤連接到寡(dT) n; iii)使 互補糹笨針與元素標記的寡(dT) n反應；iv )在溶液中使連接到元 素標記的寡(dT) n的互補探針(其連接到可區分元素標記的顆粒 上)與耙核酸雜交；v)將結合的顆粒與未結合的顆粒分離；vi)通 過顆粒元素分析來檢測和須'J定結合的顆粒。
在另一方面，顆4立可以淨皮固體載體取^。例力口，栽體可以是平 (例如玻璃或塑料)板、孔板、探針(嵌入到樣品中)或其他固體
材料。在這種情況下，固體表面不必必須是元素標記的，因為位置 (在板上或孔板上)能指示連接其上的互補探針的標識。說明書類
似於上述(i)至(v)，但是在這種情況下僅測定連接到寡(dT) n
上的元素。
上述的試劑盒可以進一步包括選自由以下組成的組的試劑和 裝置解離溶液(dissociation solution )、具有核酸結合膜的旋轉柱 (spin column )、用於從生物樣品中分離和純化核酸的純化柱、用 於擴增純化的核酸的試劑和溶液、標樣、稀釋糹爰沖液，解離緩沖液、 洗滌緩沖液、雜交緩沖液和測定緩沖液。內源核酸可以在形態上完 整的細月包中原4立擴增。元素可以4吏用質i普計來測定。元素可以是同 位素或離子。元素可以選自以下元素組成的組貴金屬、鑭系元素、 稀土元素、金、銀、4白、銠、銥和釔。元素可以包括多於一種元素 和/或多於一種同位素和/或多於一種同位素的原子。親和性產品可 以選自由抗體、Fab'、適體、抗原、激素、生長因子、受體、蛋白
質和核酸組成的組。試劑盒還可以包括用於顆粒元素分析的說明 書。
試劑盒可以包i舌以下成分
(a) 原位擴增試劑；
(b) 核酸純化試劑和裝置；
(c) 原位雜交緩沖液；
(d) 固定和'滲透;容液；
(e) 洗滌溶液；
(f) 溶解試劑。 本申請人的教導提供了上述披露的方法。這些方法允許
(a) 多重進4亍(multiplexing);
(b) 蛋白質和基因表達的同時分析；
(c) 具有或不具有擴增步驟的方法；
(d) 沒有昂貴聚合酶的低成本分析；
(e) 在單細胞中的基因分析；
(f) 基因表達的絕對定量。 在本糹皮露
儘管結合各種實施方式描述了本申請人的教導，這並不是為了 將本申請人的教導限於這些實施方式。相反，本申請人的教導包括 作為本領域技術人員所意識到的各種替換、改變以及等價物。
參考文獻列表
1. Lockhart， D. J.， Chee， M.， Gunderson, K.， Lai， C, Wodicka, L.， Cronin, M. T., Lee， D., Tran, H. M.， Matsuzaki, H.， Gall, G. H.， Barone, A. D.， Mcgall, G. H.， Chaoqiang, L., and Lee， D. H. Identifying differences in nucleic acid levels between samples -using arrays comprising probe oligo: nucleotide(s) which can form hybrid duplexes with nucleic acids in the samples. AFFYMETRIX INC, Lockhart, D. J.， Chee， M.， Gunderson, K.， Lai， C， Wodicka， L.， Cronin， M. T,， Lee， D. H.， Tran， H. M., Matsuzaki， H.， Mcgall, G. H" and Barone， A. D. [EP880598-A; W09727317-A; W09727317-A1; AU9722533-A; EP880598-A1; US6344316-B1; JP2002515738-W; US2003064364畫A1; US6858711 -B2; US2005158772-A1; US2005191646-A1 ].
2. Pease, A. C; Solas, D.; Sulli環，E. J.; Cronin, M. 丁.； Holmes, C. P.; Fodor, S. P. A. Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid Dna-Sequence Analysis屍raceetZ/wg51 o/ f/ e 7W "owa/ ^cowfewy Sc/ewces q/"f/ze t/m' ^/ 5Wes 1994， 91， 5022-26.
3. Guo, Z.; Guilfoyle, R. A.; Thiel, A. J.; Wang, R.; Smith, L. M. Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports 7Vwc/e/c ^c油Aes. 1994, 22, 5456-65.
4. Gravitt， P. E.; Peyton, C. L.; Apple, R. J.; Wheeler, C. M. Genotyping of 27 human papillomavirus types by using IJ consensus PCR products by a single- hybridization, reverse line blot detection method q/"C7/w/ca/緒cra6/o/ogy 1998, 36, 3020-27.
5. Rosenberg, M., Debouck, C， and Bergsma, D. Methods and compsns. for identifying genes which are differentially expressed -in a normal healthy animal and an animal having a selected disease
or infection. SMITHKUNE BEECHAM CORP. [W09521944-A; EP743989畫A; EP743989-A4; W09521944畫A1; EP743989-A1; JP9508800-W].
6. Lipshutz， R. J.; Fodor， S. P.; Gingeras, T. R.; Lockhart, D. J. High density synthetic oligonucleotide arrays yVafA Gew". 1999， 21， 20-24.
7. Churchill, G A. Fundamentals of experimental design for cDNA microarrays腺.2002， 32 Suppl， 490-95.
8. Churchill, G A. Fundamentals of experimental design for cDNA microarrays TV",. 2002, 32 Suppl, 490-95.
9. Weeraratna， A. T.; Nagel， J. E.; Mello-Coelho， V.; Taub, D. D. Gene expression profiling: from microarrays to medicine / C7/w. /讓腳/, 2004， 24， 213-24.
10. Wang, D.， Li， G" Ma， X.， Liu, C, Zhou， Y" and Cheng, J. Detecting a target nucleic acid molecule, for use in clinical diagnosis, comprises incubating the cell lysate， without nucleic acid purification, with a nucleic acid probe, allowing hybridization. UNIV QINGHUA and CAPITAL BIOCHIP CO LTD. [WO2005017193-A1; AU2003257371-A1; CN1580283-A].
11. Venkatasubbarao, S.Microarrays — status and prospects 7>ewcis 腸&c/mo/. 2004， 22, 630-37.
12. Mullis, K. B.， Amheim, N., Saiki, R. K., Erlich, H. A., Horn, G. T., Scharf， S. J., Banks, Mullis K.， and Keichi， Saiki R. Process for amplifying detecting or cloning nucleic acid sequences - useful in disease diagnosis and in prepn. of transforming vectors. CETUS CORP, HOFFMANN LA ROCHE & CO AG and HOFFMANN LA， R. O. C. H. [EP200362-A2; EP200362-A3; JP92067957-B2; JP92067960-B2; EP200362-A1; EP200362-B; EP200362-A; AU8655322-A; AU8655323-A; JP61274697-A; JP62000281-A;
DK8601448-A; DK8601449畫A; US4683195-A; US4683202畫A;
ES8706822-A; ES8706823-A; ZA8602334畫A; ZA8602335-A;
ES8800356-A; ES8800357國A; CA1237685-A; US4800159-A;
US4683202-B^ IL78281-A; CA1291429-C; IL78284-A;
JP92067957-B; JP92067960-B; EP200362- BI; DE3687537-G;
JP6007166畫A; DK171160-B; DK171161-B; JP2546576-B2; IE83456-B; IE83464畫B; US4683195畫B; CA1340121畫E].
13. Kadkol， S. S.; Gage， W. R.; Pastemack， G. R. In situ hybridization -Theory and practice Mo/ecwAar Z)/Qg7ms/51 1999， 4， 169-83.
14. Jonker， A.; deBoer, P. A. J.; vandenHoff, M. J. B.; Lamers， W. H.; Moorman, A. F. M. Towards quantitative in situ hybridization J(Owr/7fl:/ q/"/7/5^oc/2em/s^y cfe: Q^ oc/7ew/欲少1997， 45， 413-23.
15. Raap， A. K. Advances in fluorescence in situ hybridization M 1998,400,287-98.
16. Tanke， H. J.; Dirks， R. W.; Raap, T. FISH and immunocytochemistry: towards visualising single target molecules in living cells S/o/^c/wo/. 2005， 16， 49-54.
17. Levsky， J. M,; Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future J Ce〃 2003, 116, 2833-38.
18. Levsky, J. M.; Shenoy， S. M.; Pezo, R. C; Singer, R. H. Single-cell gene expression profiling Sc/ewce 2002， 297, 836-40.
19. Janicki, S. M.; Tsukamoto， T.; Salghetti, S. E.; Tansey, W. P.; Sachidanandam, R.; Prasanth, K. V.; Ried， T.; Shav-Tal, Y.; Bertrand, E.; Singer, R. H.; Spector, D. L. From silencing to gene expression: Real-time analysis in single cells Ce〃 2004， 116， 683-98.20. Weier, H. U.; Chu, L. W.; Murnane, J. P.; Weier， J. F. Applications and technical challenges of fluorescence in situ hybridization in stem cell research膝od Ceto Mo/. D/s. 2004， 32, 68-76.
21. Derradji， H.; Bekaert, S.; Van Oostveldt, P.; Baatout， S. Comparison of different protocols for telomere length estimation by combination of quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH) and flow cytometry in human cancer cell lines 顛/謂cw/^. 2005， 25, 1039-50.
22. Baranov， V. L; Quinn, Z.; Bandura, D. R.; Tanner, S. D. A sensitive and quantita- tive element-tagged immunoassay with ICPMS detection爿wa/,'ca/ C7 e脂、"，2002, 74, 1629-36.
23. Zhang, Q. Y.; Garner, K.; Viswanatha, D. S. Rapid detection of leukemia- associated translocation fusion genes using a novel combined RT-PCR and flow cytometric method Z^wAew/o 2002， 16, 144-49.
24. Stein, C. A.; Subasinghe, C; Shinozuka, K.; Cohen, J. S. Physicochemical Properties of Phosphorothioate Oligodeoxynucleotides iVwc/e/c爿c油Aesearc/z 1988, 16, 3209-21.
25. Sambrook et al" in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
26. Ausubel et al" in Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987).
權利要求
1. 一種用於細胞分析的方法，包括:(a)提供細胞或細胞顆粒；(b)固定並滲透所述細胞或所述細胞顆粒；(c)在雜交溶液中用對靶核酸特異的探針培育所述細胞或所述細胞顆粒，所述探針標記有惟一的元素標籤使得標記有一種類型的所述標籤的所述探針的一種類型通過元素分析與標記有不同類型的所述標籤的所述探針的任何其它類型是可區分的；(d)通過嚴格的洗滌條件將未雜交的探針與雜交至所述靶核酸的探針分離；以及(e)通過元素分析對所述細胞或細胞顆粒進行分析，以鑑別所述探針並對結合至所述靶核酸的探針進行定量。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中標記有不同元素標籤的兩種 或更多種不同的對笨針^皮雜交到兩個或更多個輩巴核酸上。
3. 根據權利要求1所述的方法，其中所述耙核酸選自以下組成的 組細胞內核酸分子、基質RNA、小RNA、基因轉錄前體 脂A、信使RNA、轉運RNA、核糖體RNA、染色體DNA、 線粒體DNA、葉綠體DNA、病毒DNA、病毒RNA、細菌 DNA、細菌RNA、以及質衝立DNA。
4. 根據權利要求1所述的方法，進一步包括同時分析表面和/或 細胞內蛋白分子。
5. 根據權利要求1所述的方法，進一步包括同時分析表面和/或 細胞內脂質分子。
6. 根據權利要求1所述的方法，進一步包括同時分析表面和/或細月包內多4唐分子。
7. 根據權利要求1所述的方法，進一步包括同時分析表面和/或 細胞內小分子，所述小分子選自由維生素、激素、半抗原以及 核香組成的組。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中所述核苦選自由ATP、ADP、 環狀AMP和NADH組成的組。
9. 根據權利要求1所述的方法，其中在步驟(b)之後，所述細 胞或細胞顆粒與對表面或/和細胞內蛋白質特異的親和性試劑 反應，所述親和性試劑標記有包含連接至負載分子結構的一種 或多種元素的一種或多種同位素的多種原子的化學結構的元 素標籤，使得標記有一種類型的所述標籤的所述親和性試劑的的，接著將結合的親和性試劑與未結合的親和性試劑分離。
10. 根據權利要求9所述的方法,其中所述親和性試劑選自由抗 體、適體、凝集素和小分子組成的組。
11.根據權利要求1所述的方法，其中在步驟(b)之後，所述細應，所述親和性試劑標記有元素標籤，1"吏得標記有一種類型的 所述標籤的所述親和性試劑的一種類型通過元素分析與所述 標籤的任何其它類型是可區分的，接著將未結合的親和性試劑 與結合的親和性試劑分離。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中所述表面或/和細胞內分子 是脂質。
13. 根據權利要求11所述的方法，其中所述表面或/和細胞內分子 是多糖。
14. 根據權利要求11所述的方法，其中所述表面或/和細胞內分子是小分子。
15. 根據權利要求11所迷的方法，其中所述親和性試劑選自由抗 體、適體、凝集素和小分子組成的組。
16. 根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞是動物、植物、細 菌或真菌的全細胞。
17. 根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞顆粒選自由分離的 染色體、分離的細胞核、分離的線粒體、分離的葉綠體、分離的病毒、分離的細菌ia成的糹且。
18. 根據權利要求1所述的方法，其中所述探針選自由寡核苷酸探 針、鎖核酸(LNA)分子、肽核酸(PNA)分子、質粒DNA、 擴增的DNA或其片段、擴增的RNA或其片段、RNA的片段 以及基因組DNA片段組成的組。
19.一種用於在溶液中生物分子的均質分一斤的方法，包4舌(a)在使親和性試劑能夠與生物分子結合的條件下，用 標記有元素標籤的所述親和性試劑以及惟 一 標記的載體對所 述生物分子進行培育，使得標記有一種類型的所述標籤的所述 栽體的一種類型通過元素分析與標記有不同類型的所述標籤 的所述載體的任何其它類型是可區分的； (b) 將所述結合有生物分子的載體與未結合的載體分離；(c) 通過顆粒元素分析測定所述結合的載體，其中所述 載體分散在'液體中以定量測定單獨載體的原子和同位素組成， 乂人而4企測連4妄到所述載體上的生物分子的類型和數量。
20. 根據權利要求19所述的方法，其中所述載體選自由顆粒、微 J求以及5朱並立糹且成的糹且。
21. 根據權利要求19所述的方法，其中所述生物分子來自組織或 細月包々羊品。
22. 根據權利要求21所述的方法，其中所述樣品選自由動物樣品、 才直物々羊品、細菌一羊品、以及真菌一羊品糹且成的糹且。
23. 才艮據權利要求19所述的方法，其中所述生物分子選自由 mRNA、蛋白質、脂質、多糖以及小分子組成的組。
24. 4艮據權利要求19所述的方法，其中所述生物分子與所述親和 性試劑的結合包括mRNA分子與連接到惟一標記的微球上的 寡核苷酸的雜交。
25. 才艮據^L利要求24所述的方法，其中所述寡核苷酸包^^多個脫 氧胸苦三^粦酸核芬以及連接到惟 一 標記的樣i5求上的互補核酸探針。
26. 才艮據4又利要求25所述的方法，其中所述互補核酸^笨針選自由 寡核苷酸、LNA 、 PNA以及質粒DNA組成的組。
27. 根據權利要求19所述的方法，進一步包括將所述生物分子結 合到特異性小分子上，其中所述小分子標記有元素標籤，所述 元素標籤結合了覆蓋有對所述生物分子的親和性試劑的唯一 標記的載體，4妄著通過元素分析以鑑別所述生物分子與所述小 分子的反應。
28. 根據權利要求27所述的方法，其中所述親和性試劑選自由抗 體、適體、以及凝集素、核酸、結合肽、蛋白質受體以及磷脂 組成的組。
29. —種用於#r測和測定樣品中元素的試劑盒，其中所測定的元素 是連接到與所感興趣的核酸互補的特異性探針上的元素標籤， 所述試劑盒包括(a) 用於直4妄標記互補4笨針的元素標籤；以及(b) 互補探針。
30. 才艮據4又利要求29所述的試劑盒，進一步包括關於以下的i兌明 書i)用所述元素標籤對所述探針直接標記；ii)固定和滲透 細胞或細胞顆粒；iii)在雜交溶液中用所述元素標記的探針培 育所述細胞或細胞顆粒；iv)將結合的探針與未結合的探針分 離；v)將具有雜交材料的所述細胞或細胞顆粒溶解；以及vi) 衝全測和測定所述元素標"i己的4笨針。
31. —種用於一企測和測定樣品中元素的試劑盒，其中所測定的元素 是連接到與所感興趣核酸互補的特異性探針上的元素標籤，所 述試劑盒包括(a)標記有元素標籤的互補探針。
32. 根據權利要求31所述的試劑盒，進一步包括關於以下的說明 書i)固定和滲透所述細胞或細胞顆粒；ii)在雜交溶液中用 所述元素標記的糹笨針培育所述細胞或細胞顆粒；iii)將結合的 探針與未結合的探針分離；iv)將具有雜交材料的所述細胞或 細胞顆粒溶解；以及v) 4全測和測定所述元素標記的探針。
33. 根據權利要求30所述的試劑盒，其中所述檢測和測定通過溶 液元素分析進行。
34. 4艮據4又利要求30所述的試劑盒，其中所述4企測和測定通過顆 粒元素分析進4亍。
35. 4艮據權利要求29至34任一項所述的試劑盒，進一步包4舌與多 種核酸互補的多種特異性探針以及用於惟一標記各個類型的 探針的多種的惟一元素標籤。
36. 根據權利要求29至35任一項所述的試劑盒，進一步包括(i) 用於選自由蛋白質、脂質、多糖和小分子組成的組 中的細月包內或細月包外生物分子的親和性i式劑；以及(ii) 用於對所述生物分子的所述親和性試劑進行標記的 元素標籤。
37. 根據權利要求36所述的試劑盒，進一步包括關於以下的說明 書(i)對所述生物分子的所述親和性試劑進4亍標記；(ii)用 所述生物分子的所述親和性試劑對所述細胞或細胞顆粒進行 培育；(iii)將結合的所述生物分子的親和性試劑與未結合的 所述生物分子的親和性試劑進行分離；以及(iv )檢測和測定 結合的所述生物分子的親和性試劑。
38. 根據權利要求37所述的試劑盒，包括用於多種生物分子的多親和性試劑進行惟一標記的多種元素標籤。
39. —種用於檢測和測定元素的試劑盒，其中所測定的元素是連4妾 到寡(dT ) n以及連接到互補探針上的唯一標記的載體的元素 上的元素標籤，所述試劑盒包括(a)用於直4妾標記寡(dT) n的元素標籤；(b )寡(dT ) n;(c) 至少一種p參一標i己的栽體；以及(d) 多種互補探針。
40. 根據權利要求39所述的試劑盒，進一步包括關於以下的說明 書i)將所述多種互補探針直接連接到唯一標記的載體上； ii)進行核酸純化；(iii)將所述元素標籤連接到所述寡(dT) n; iv)使連接到唯一標記的載體上的所述互補探針與純化的 核酸雜交；iii)將結合的唯一標記的載體與所述金屬標記的寡(dT)n反應；iv )將未結合的核酸與結合的核酸分離；v) 通過元素分衝斤來4全測和測定所結合的載體的元素。
41. 根據權利要求39或40所述的試劑盒，其中存在多種載體並且 所述載體是顆粒或^朱粒。
42. 根據權利要求39所述的試劑盒，其中所述多種互補探針直接 用可區分的元素標籤標記。
43. —種用於檢測和測定元素的試劑盒，其中所測定的元素是連接 到寡(dT) n上以及連接到互補^t笨針上的唯一標記的載體的元 素上的元素標籤，所述試劑盒包括 (a) 用於直4妻標"i己寡(dT) n的元素標籤；(b) 寡(dT) n;以及(c )連4妄到至少一種唯一標記的載體上的多種互補4罙針。
44. 根據權利要求43所述的試劑盒，進一步包括關於以下的說明 書i)進行核酸純化；(ii)將所述元素標籤連接到寡(dT)n; iii)使所述互補探針與所述元素標記的寡(dT) n反應；iv ) 用連4妾至唯一標記的載體上的所述互補4笨針與純化的核酸雜 交；iii)將結合的唯一標記的載體與所述金屬標記的寡(dT) n反應；iv)將未結合的核酸與結合的核酸分離；v )通過元素 分析來4企測和測定結合的載體的元素。
45. 用於4企測和測定元素的試劑盒，其中所測定的元素是連4妄到寡(dT )n上並連4妄到互補糹果針上的唯一標記的栽體的元素上的 元素標籤，所述試劑盒包括(a)元素才示籤才示i己的寡(dT) n;以及(b )連4妾到至少一種惟一標i己的載體上的多種互^卜才笨針。
46. 4艮據糹又利要求45所述的試劑盒，進一步包括關於以下的it明 書i)進行核酸純化；ii)將連接到惟一標記的載體上的所述 互補探針與純化的核酸進行雜交；iii)將結合的惟一標記的載 體與所述金屬標記的寡(dT) n反應；iv)將未結合的核酸與 結合的核酸分離；v)通過元素分析來4全測和測定結合的載體 的元素。
47. 4艮據權利要求39所述的試劑盒，其中所述載體是J朱粒。
48. 根據權利要求29或39所述的試劑盒，進一步包括選自以下組 成的組中的試劑和裝置解離溶液、具有核酸結合膜的旋轉柱、 用於從生物樣品中分離和純化核酸的純化柱、用於擴增純化的 核酸的試劑和溶液、標樣、稀釋緩衝液，解離緩衝液、洗滌緩 沖液、雜交糹差衝液和測定《爰沖液。
49. 根據權利要求29所述的試劑盒，其中內源核酸在形態上完整 的細胞中原位擴增。
50. 根據權利要求29至50任一項所述的試劑盒，其中所述元素使 用質讀-儀來測定。
51. 根據權利要求29至50任一項所述的試劑盒，其中所述元素是 同位素。
52. 根據權利要求29至50任一項所述的試劑盒，其中所述元素選 自以下元素組成的組貴金屬、過渡金屬、稀土元素、金、名艮、 4白、姥、銀和4巴。
53. 4艮據4又利要求29至50任一項所述的試劑盒，其中所述元素包 :括多於一種元素。
54. 根據權利要求29至50任一項所述的試劑盒，其中所述元素包 括多於一種同位素。
55. 根據權利要求29至50任一項所述的試劑盒，其中所述元素包 括一種同位素的多於一個原子。
56. 根據權利要求36至39任一項所述的試劑盒，其中親和性產品 選自由抗體、Fab'、適體、抗原、激素、生長因子、受體、蛋 白質和核酸組成的組
57.根據權利要求29至50任一項所述的試劑盒，其中包括用於顆粒元素分析的說明書。
全文摘要
本發明披露了用於基因表達分析的方法和試劑盒。該方法採用元素標記的寡核苷酸作為探針，隨後通過元素分析對其進行分析。還披露了用於分析生物分子的方法和試劑盒，其採用元素標記的載體如珠粒，接著進行元素分析。元素分析可以採用電感耦合等離子質譜(ICP-MS)進行。
文檔編號G01N33/483GK101384733SQ200780005269
公開日2009年3月11日 申請日期2007年2月13日 優先權日2006年2月13日
發明者奧爾加·奧爾納茨基 申請人:奧爾加·奧爾納茨基