東北野生大豆編碼dreb轉錄因子基因及其克隆方法

2023-04-26 15:40:06 3

專利名稱：東北野生大豆編碼dreb轉錄因子基因及其克隆方法
技術領域：
本發明涉及的是一種基因材料，本發明還涉及這種基因的克隆方法。
背景技術：
低溫、乾旱和鹽鹼等逆境條件嚴重影響作物的產量和質量，是制約我國東北地區乃至全國農業生產的重大問題。提高作物的耐低溫、乾旱和鹽鹼能力以及充分利用鹽鹼地資源開拓耕地面積是解決糧食安全的重要途徑。近年來隨著分子生物學和基因工程技術的迅猛發展，為進行抗逆分子育種研究提供了重要手段。進行抗逆分子育種要求有豐富的基因資源。近幾年來，國內外在克隆植物滲透脅迫相關基因方面取得了一些進展，為分子育種提供了豐富的抗逆基因資源。
DREB(Dehydration Responsive Element Binding protein)轉錄因子是目前滲透脅迫分子生物學研究較為熱點的蛋白因子。以模式植物擬南芥和水稻為材料，在基因分離、結構分析、功能鑑定等方面都做了很多研究，大量的研究表明，DREB轉錄因子在植物對滲透脅迫反應中起到非常重要的調控作用。而在抗逆性強的東北野生大豆方面尚未見報導。從野生資源中可望獲得在滲透脅迫過程中起關鍵作用的基因，將為植物抗滲透脅迫基因工程提供了具有自主智慧財產權的基因資源。

發明內容本發明的目的在於提供一種在植物抗滲透脅迫過程中起關鍵作用的基因。
本發明基因的基本特徵該基因包括1179bp的開放讀碼框，編碼392個胺基酸，有ATG起始密碼子和TAG終止密碼子；在GsDREB內部具有轉錄因子特有的與DNA結合的結構域DREBP/AP2，其保守的胺基酸殘基為RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三個平行的β-摺疊和一個α-螺旋結構，可以與DNA的GCC-BOX結合，N端具有6個胺基酸的核定位序列(SRKRKS)。
它的序列及推測的胺基酸序列為1 TTTCATTGAGTACTGTGTGGCGAAGTTTGTGTCTTGGATTTTGTGGAC GGTGCTTAT1 M G A Y61 GATCAAGTTTCTCTTAAGCCATTGGATTCTTCTAGAAAGAGGAAAAGTAGGAGCAGAGGG5 D Q V S L K P L D S R S R G121GATGGGTCCAAATCTGTGGCTGAGACTATTGCAAAGTGGAAGGAATACAATGAGCATCTT25 D G S K S V A E T I A K W K E Y N E H L181TATTCTGGCAAAGATGATAGTAGAACAACTCGTAAGGCGCCGGCTAAAGGTTCGAAGAAA45 Y S G K D D S R T T R K A P A K G S K K
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345 P S G V D Y G L D F L K T V E P G D Y N1141 GGTGGAGGGGAAGAACCACCATTTCTTAATTTGGATGATGATCTAAACCATGATTCAAAT365 G G G E E P P F L N L D D D L N H D S N1201 GGCATGCAAGCAAGGAAGGGTGGC AGAAGGCTACGTGTATCTGCTTCATTTTCAACT385 G M Q A R K G G *1261 GGTTCTAGCGTCTGCTGGTAATCTGTCTCTTGGGCTGTTGTCCCCTTTTTAGCTATATAA1321 TAGGCGCATAAGAGGAATACCCCTATACAACTAATACAAG本發明的基因是採用這樣的方法來克隆的根據擬南芥DREB2A、DREB2B(AB007790、AB007791)、番茄DREB2(AF500012)、玉米DREB2(AF450481)的多序列比對結果，在DREBP/AP2的β-摺疊區和α-螺旋區設計一套簡併引物。以反轉錄產物為模板，採用降落PCR的方法，獲得到191bp的片段，命名為GsAP2。引物序列為GsAP2 UPgg(A/T/C)AAA Tgg gT(T/A/g)(g/T)(C/g)(A/T/C)gAGsAP2 DOWN gg(g/A)AA(g/A)TT(g/A)Ag(A/T/g)(A/C)(g/T)A gC以獲得的GsAP2序列為靶序列，採用3』RACE和5』RACE方法分別對其3』和5』末端未知的序列進行擴增。引物序列如下Primers Sequences(5『→3』)PCRAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACA A(17) 3』RACEAUAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT AC 3』/5』RACEAAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACg ggI Igg gII ggg IIg5』RACEGsDREB 3GSP1 gAg gAg TTA ggC AgA ggA CAC g 3』RACEGsDREB 3GSP2 gCA ggC TTT ggT Tgg gTA C 3』RACEGsDREB 3GSP3 gCT gCT CTT gCC TAT gAT gAA G 3』RACEGsDREB 5GSP1 AAg gAT AgC ACA Agg ACC ATA C 5』RACEGsDREB 5GSP2 TgC TTC CTC TAT Tgg gCT CC 5』RACEGsDREB 5GSP3 CgT gTC CTC TgC CTA ACT CCT C 5』RACE經過PCR擴增獲得1162bp 3』端序列和482bp 5』端序列它們與191bp的保守區分別具有106bp和45bp的重疊區域；將5』RACE序列、3』RACE序列和GsAP2序列拼接，獲得1622bp的拼接序列；在拼接的兩端序列設計引物，採用RT-PCR方法進行全長基因擴增，結果獲得了1360bp全長cDNA序列，該基因被命名為GsDREB。全長基因PCR擴增的引物序列如下GsDREB UP CACggA TCCAgT TTg ATT gAg TAC TgT gTgGsDREB DOWNggCgAg CTCCTT gTA TTA gTT gTA TAg ggg利用DNA、胺基酸序列分析軟體分析基因序列，在序列水平上推測基因的功能。該基因包括1179bp的開放讀碼框，編碼392個胺基酸，有ATG起始密碼子和TAG終止密碼子，說明基因的完整性；分析其胺基酸序列，在GsDREB內部具有轉錄因子特有的與DNA結合的結構域DREBP/AP2，其保守的胺基酸殘基為RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三個平行的β-摺疊和一個α-螺旋結構，可以與DNA的GCC-BOX結合，N端具有6個胺基酸的核定位序列(SRKRKS)。這些分析結果暗示著該基因編碼一類轉錄因子，並且具有轉錄因子所具有的結構特徵。
本發明從東北野生大豆中克隆的GsDREB基因，其胺基酸序列中含有轉錄因子所特有的核定位序列、DNA結合結構域以及C-端酸性活性區等。序列決定功能，因此該基因具有轉錄因子的活性，在植物抗滲透脅迫過程中起調控作用。並且該基因來源於野生大豆，與大豆親緣關係很近，外源基因遺傳轉化大豆可以穩定遺傳和表達，因此該研究為大豆抗滲透脅迫基因工程提供新的基因資源；同時對於理解滲透脅迫分子生物學機理奠定理論基礎。


圖1是DREBP/AP2結構域PCR擴增的電泳結果；圖2是GsDREB全長基因的擴增結果；圖3是克隆片段GsDREB胺基酸序列在基因資料庫中的同源性檢索結果具體實施方式
下面舉例對本發明作更詳細的描述DREB屬於DREBP亞家族，在序列上具有保守的AP2結構域，而與EREBP家族的其它亞家族的胺基酸序列有差別。根據擬南芥DREB2A、DREB2B(AB007790、AB007791)、番茄DREB2(AF500012)、玉米DREB2(AF450481)的多序列比對結果，在DREBP/AP2的β-摺疊區和α-螺旋區設計一套簡併引物。採用RT-PCR的方法，獲得到191bp的片段。圖1是其結構域PCR擴增的電泳結果，其中M2000Mark；1，3，5，7第一輪PCR的結果，退火溫度分別為44.8℃，49.1℃，53.3℃，56.6℃；2，4，6，8為第二輪PCR的結果，退火溫度為44℃。PCR擴增的簡併引物序列為GsAP2 UPgg(A/T/C)AAATgggT(T/A/g)(g/T)(C/g)(A/T/C)gAGsAP2 DOWN gg(g/A)AA(g/A)TT(g/A)Ag(A/T/g)(A/C)(g/T)AgC克隆，測序，序列分析。其胺基酸序列，具有DREBP/AP2區域保守的胺基酸序列，命名為GsAP2。與GsAP2相似性最高的是擬南芥DREB2A和水稻的DREB-likeproteine，均達到82％。證明所獲得的片段即為野生大豆DREB的保守區-DREBP/AP2。GsAP2的序列及推測的胺基酸序列為(灰框的胺基酸為保守的胺基酸殘基為DREBP/AP2結構域保守胺基酸，單線的胺基酸序列構成β-摺疊結構，雙線的區域為α-螺旋結構)1 ACTCAAAATTCTCAGTGTAACTACAGAGGAGTTAGGCAGAGGACACGGGGGAAATGGGTT1 T Q N S Q C N Y 61GGTGAGATTAGGGAGCCCAATAGAGGAAGCAGGCTTTGGTTGGGTACCTTCTCTTCTCAG21 121 CCGGAAGCTGCTCTTGCCTATGATGAAGCTGCTAGAGCTATGTATGGTCCTTGTGCTATC41 C A I181 CTTAACTTTCC61 L N F為了獲得DREB基因的全長的序列，我們以獲得的GsAP2序列為靶序列，採用3』RACE和5』RACE方法分別對其3』和5』末端未知的序列進行擴增。RACE-PCR擴增的引物序列如下Primers Sequences(5『→3』) PCRAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACA A(17) 3』RACEAUAPggC CAC gCg TCg ACT AgT AC3』/5』RACEAAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACg ggI Igg gII ggg IIg 5』RACEGsDREB 3GSP1gAg gAg TTA ggC AgA ggA CAC g 3』RACEGsDREB 3GSP2gCA ggC TTT ggT Tgg gTA C 3』RACEGsDREB 3GSP3gCT gCT CTT gCC TAT gAT gAA G 3』RACEGsDREB 5GSP1AAg gAT AgC ACA Agg ACC ATA C 5』RACEGsDREB 5GSP2TgC TTC CTC TAT Tgg gCT CC5』RACEGsDREB 5GSP3CgT gTC CTC TgC CTA ACT CCT C 5』RACE經過PCR擴增獲得1162bp 3』端序列和482bp 5』端序列；它們與191bp的保守區分別具有106bp和45bp的重疊區域；將5』RACE序列、3』RACE序列和GsAP2序列拼接，獲得1622bp的拼接序列；在拼接的兩端序列設計引物，採用RT-PCR方法進行全長基因擴增，結果獲得了1360bp全長cDNA序列，該基因被命名為GsDREB。圖2是全長基因PCR擴增的電泳結果，其中M2000Mark；1，2，3，4不同退火溫度下擴增的結果，退火溫度分別為52℃、54℃、56℃、58℃，目的片段的長度為1.3kb。全長基因PCR擴增的引物序列如下GsDREB UP CACggA TCCAgT TTg ATT gAg TAC TgT gTgGsDREB DOWNggCgAg CTCCTT gTA TTA gTT gTA TAg ggg利用DNA、胺基酸序列分析軟體分析基因序列，在序列水平上推測基因的功能。該基因包括1179bp的開放讀碼框，編碼392個胺基酸，有ATG起始密碼子和TAG終止密碼子，說明基因的完整性；分析其胺基酸序列，在GsDREB內部具有轉錄因子特有的與DNA結合的結構域DREBP/AP2，其保守的胺基酸殘基為RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三個平行的β-摺疊和一個α-螺旋結構，可以與DNA的GCC-BOX結合，N端具有6個胺基酸的核定位序列(SRKRKS)。這些分析結果暗示著該基因編碼一類轉錄因子，並且具有轉錄因子所具有的結構特徵。圖3是克隆片段GsDREB胺基酸序列在基因資料庫中的同源性檢索結果。
基因的全長DNA序列及推測的胺基酸序列為1 TTTCATTGAGTACTGTGTGGCGAAGTTTGTGTCTTGGATTTTGTGGAC GGTGCTTAT1 M G A Y61GATCAAGTTTCTCTTAAGCCATTGGATTCTTCTAGAAAGAGGAAAAGTAGGAGCAGAGGG5 D Q V S L K P L D S R S R G121 GATGGGTCCAAATCTGTGGCTGAGACTATTGCAAAGTGGAAGGAATACAATGAGCATCTT25 D G S K S V A E T I A K W K E Y N E H L181 TATTCTGGCAAAGATGATAGTAGAACAACTCGTAAGGCGCCGGCTAAAGGTTCGAAGAAA45 Y S G K D D S R T T R K A P A K G S K K241 GGGTGCATGAAAGGGAAGGGAGGACCTCAAAATTCTCAGTGTAACTACAGAGGAGTTAGG65 G C M K G K G G P Q N S Q C 301 CAGAGGACATGGGGGAAATGGGTTGGTGAGATTAGGGAACCCAATAGAGGAAGCAGGCTT85 361 TGGTTGGGTACCTTCTCTTCTGCCCAGGAAGCTGCTCTTGCCTATGATGAAGCTGCTAGA105 421 GCTATGTATGGTCCTTGTGCACGCCTCAATTTTCCCGAAATCACAGATTATCCTTCTGTT125 E I T D Y P S V
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權利要求
1.東北野生大豆編碼DREB轉錄因子基因，其特徵是該基因包括1179bp的開放讀碼框，編碼392個胺基酸，有ATG起始密碼子和TAG終止密碼子；在GsDREB內部具有轉錄因子特有的與DNA結合的結構域DREBP/AP2，其保守的胺基酸殘基為RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三個平行的β-摺疊和一個α-螺旋結構，可以與DNA的GCC-BOX結合，N端具有6個胺基酸的核定位序列(SRKRKS)。
2.根據權利要求1所述的東北野生大豆編碼DREB轉錄因子基因，其特徵是其序列及推測的胺基酸序列為1 TTTCATTGAGTACTGTGTGGCGAAGTTTGTGTCTTGGATTTTGTGGAC GGTGCTTAT1 MG A Y61GATCAAGTTTCTCTTAAGCCATTGGATTCTTCTAGAAAGAGGAAAAGTAGGAGCAGAGGG5 D Q V S L K P L D S R S R G121 GATGGGTCCAAATCTGTGGCTGAGACTATTGCAAAGTGGAAGGAATACAATGAGCATCTT25 D G S K S V A E T I A K W K E Y N E H L181 TATTCTGGCAAAGATGATAGTAGAACAACTCGTAAGGCGCCGGCTAAAGGTTCGAAGAAA45 Y S G K D D S R T T R K A P A K G S K K241 GGGTGCATGAAAGGGAAGGGAGGACCTCAAAATTCTCAGTGTAACTACAGAGGAGTTAGG65 G C M K G K G G P Q N S Q C 301 CAGAGGACATGGGGGAAATGGGTTGGTGAGATTAGGGAACCCAATAGAGGAAGCAGGCTT85 361 TGGTTGGGTACCTTCTCTTCTGCCCAGGAAGCTGCTCTTGCCTATGATGAAGCTGCTAGA105 421 GCTATGTATGGTCCTTGTGCACGCCTCAATTTTCCCGAAATCACAGATTATCCTTCTGTT125 E I T D Y P S V481 AAGGAATCGTTGAAGGACTCTTCGATGGCTGCATCGTCGTCTTGTTCTTCGGCAGCAACT145K E S L K D S S M A A S S S C S S A A T541 GCAGCATCTGACACTACTACTACAACATCGAACCAATCGGAGGTTTGTGCTGTTGAGGAT165A A S D T T T T T S N Q S E V C A V E D601 GTTATCGAGAAACCTGCGAATGTGAATGATAAGTTTAATGATTGTCATAAGGCTTACGTA185V I E K P A N V N D K F N D C H K A Y V661 TCTGCCTCACCAACTAGTAGAATGAAGCAAGAGCCTAGGGATGAGGCTGTGGACCACATG205S A S P T S R M K Q E P R D E A V D H M721 GACACAGGGGCTGGGGAAATTCAAGATGTCGGACTAGAAGGAACACATGATACTGGGCAG225D T G A G E I Q D V G L E G T H D T G Q781 GTTGCAGAGAATGTAAATAAAGATCAGATGGATTTGTCATGGATTGATGGCCTTGACTTT245 V A E N V N K D Q M D L S W I D G L D F841 ATTGACGATTACTTGAAGAGCCTTTCCGCGGATGAGTTATTTCAGGTGGACGAACTTTTG265I D D Y L K S L S A D E L F Q V D E L L901 GGGCTTATAGATAATAACCCAATCGATAACTCTGTGTTGATGCAAGGTTTGGATTTTGGA285G L I D N N P I D N S V L M Q G L D F G961 CAAATGGGTTTTCCTGGAGATGGTAATCCTCAGGTTGACGATACTCCTTCAAGCTTTATT305Q M G F P G D G N P Q V D D T P S S F I1021 TATCAGTTGCAAAATCCAGATGCCAAGTTGTTAGGAAGTTTGCCCCATATGGAGCAGACA325Y Q L Q N P D A K L L G S L P H M E Q T1081 CCATCAGGTGTTGATTATGGATTAGATTTCTTGAAAACAGTGGAGCCAGGGGACTATAAT345P S G V D Y G L D F L K T V E P G D Y N1141 GGTGGAGGGGAAGAACCACCATTTCTTAATTTGGATGATGATCTAAACCATGATTCAAAT365G G G E E P P F L N L D D D L N H D S N1201 GGCATGCAAGCAAGGAAGGGTGGC AGAAGGCTACGTGTATCTGCTTCATTTTCAACT385G M Q A R K G G *1261 GGTTCTAGCGTCTGCTGGTAATCTGTCTCTTGGGCTGTTGTCCCCTTTTTAGCTATATAA1321 TAGGCGCATAAGAGGAATACCCCTATACAACTAATACAAG
3.一種東北野生大豆編碼DREB轉錄因子基因的克隆方法根據擬南芥DREB2A、DREB2B(AB007790、AB007791)、番茄DREB2(AF500012)、玉米DREB2(AF450481)的多序列比對結果，在DREBP/AP2的β-摺疊區和α-螺旋區設計一套簡併引物，引物序列為GsAP2 UP gg(A/T/C)AAA Tgg gT(T/A/g)(g/T)(C/g)(A/T/C)gAGsAP2 DOWNgg(g/A)AA(g/A)TT(g/A)Ag(A/T/g)(A/C)(g/T)A gC以反轉錄產物為模板，採用降落PCR的方法，獲得到191bp的片段，命名為GsAP2；以獲得的GsAP2序列為靶序列，採用3』RACE和5』RACE方法分別對其3』和5』末端未知的序列進行擴增，引物序列如下PrimersSequences(5『→3』) PCRAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACA A(17)3』RACEAUAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT AC 3』/5』RACEAAPggC CAC gCg TCg ACT AgT ACg ggI Igg gII ggg IIg 5』RACEGsDREB 3GSP1 gAg gAg TTA ggC AgA ggA CAC g3』RACEGsDREB 3GSP2 gCA ggC TTT ggT Tgg gTA C3』RACEGsDREB 3GSP3 gCT gCT CTT gCC TAT gAT gAA G3』RACEGsDREB 5GSP1 AAg gAT AgC ACA Agg ACC ATA C5』RACEGsDREB 5GSP2 TgC TTC CTC TAT Tgg gCT CC 5』RACEGsDREB 5GSP3 CgT gTC CTC TgC CTA ACT CCT C5』RACE經過PCR擴增獲得1162bp 3』端序列和482bp 5』端序列；它們與191bp的保守區分別具有106bp和45bp的重疊區域；將5』RACE序列、3』RACE序列和GsAP2序列拼接，獲得1622bp的拼接序列；在拼接的兩端序列設計引物，採用RT-PCR方法進行全長基因擴增，結果獲得了1360bp全長cDNA序列，該基因被命名為GsDREB，全長基因PCR擴增的引物序列如下GsDREB UP CACggA TCCAgT TTg ATT gAg TAC TgT gTgGsDREB DOWNggCgAg CTCCTT gTA TTA gTT gTA TAg ggg利用DNA、胺基酸序列分析軟體分析基因序列，在序列水平上推測基因的功能；該基因包括1179bp的開放讀碼框，編碼392個胺基酸，有ATG起始密碼子和TAG終止密碼子，說明基因的完整性；分析其胺基酸序列，在GsDREB內部具有轉錄因子特有的與DNA結合的結構域DREBP/AP2，其保守的胺基酸殘基為RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三個平行的β-摺疊和一個α-螺旋結構，可以與DNA的GCC-BOX結合，N端具有6個胺基酸的核定位序列(SRKRKS)；這些分析結果暗示著該基因編碼一類轉錄因子，並且具有轉錄因子所具有的結構特徵，必將行使轉錄因子的功能，在信號傳導過程中對功能基因的表達起調控作用。
全文摘要
本發明提供的是一種東北野生大豆編碼DREB轉錄因子基因及其克隆方法。該基因包括1179bp完整的開放讀碼框，編碼392個胺基酸，有ATG起始密碼子和TAG終止密碼子；通過Protein Conserve Domain程序分析，在GsDREB內部具有轉錄因子特有的與DNA結合的結構域DREBP/AP2，其保守的胺基酸殘基為RgxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三個平行的β－摺疊和一個α－螺旋結構，可以與DNA的GCC－BOX結合，N端具有6個胺基酸的核定位序列。這些分析結果暗示著該基因編碼一類轉錄因子，並且具有轉錄因子所具有的結構特徵，必將行使轉錄因子的功能，在信號傳導過程中對功能基因的表達起調控作用。
文檔編號C07K14/415GK1850975SQ20061001002
公開日2006年10月25日 申請日期2006年5月10日 優先權日2006年5月10日
發明者朱延明, 才華, 柏錫, 李 傑 申請人:東北農業大學