檢測細胞dach1基因啟動子區dna甲基化狀態的引物對及試劑盒的製作方法
2023-04-26 08:37:11 1
專利名稱：檢測細胞dach1基因啟動子區dna甲基化狀態的引物對及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢測細胞DACHl基因啟動子區甲基化狀態的引物對及試劑盒。
背景技術：
胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，發病率很高，由於胃癌的致死率較高，並且死亡率是可能收集到的最精確的統計數字，所以許多國家都採用死亡率來表示其發病率，在我國，胃癌死亡率佔所有惡性腫瘤的23. 02%，居各類癌症死亡的首位，在消化系統惡性腫瘤的死亡病例中，約有半數死於胃癌。大腸癌是中國常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率明顯上升，由惡性腫瘤的第4位上升為第3位。其中以結腸癌增加為著，並且右側結腸癌亦呈明顯增長趨勢。右側結腸癌由於該部位解剖特點及腫瘤的生物學特性，確診時患者病期多為晚 期。原發性肝癌是指由肝細胞或膽管細胞發生的癌腫。臨床上以肝細胞性肝癌(HCC)最多見，是我國常見的惡性腫瘤之一。死亡率在消化系統腫瘤中列第3位，僅次於胃癌和食管癌。食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，目前尚無特異性和敏感性均滿足臨床需求的腫瘤標誌物應用於臨床。當前，針對於上述消化系統惡性腫瘤的檢測手段，尤其是早期診斷的檢測方法仍然十分有限，是目前迫切需要解決的問題。現今用於診斷消化系統腫瘤的方法主要包括消化內鏡，影像學檢查，細胞學觀測，生化與免疫學檢查等。消化內鏡檢查內鏡檢查是診斷胃癌，腸癌最直接、準確有效的診斷方法。自1826年食管鏡，1968年直式胃鏡出現之後，消化內鏡不斷改進發展，為胃腸道疾病的診斷提供了直觀確切的證據，先後經歷了纖維胃鏡，電子內鏡裡程碑式的發展，現今利用胃鏡，結腸鏡，小腸鏡，超聲內鏡等檢查，不但可完成全消化道的檢查，還可以進行ESD，EMR，ERCP等治療，利用超聲內鏡，更可對腫瘤的侵潤深度作出判斷，活檢病理和活體染色等方法可提高早癌的確診率。影像學檢查影像學檢查包括超聲顯像、放射性核素顯像、計算機斷層掃描(CT)與磁共振成像(MRI)等技術，為消化系統疾病的診療方面日益發揮作用。尤其是肝臟，胰腺，膽囊，脾臟這些器官，影像學檢查往往提供最為直觀的證據。B超檢查對於原發性肝癌(HCC)這一局灶性病變具有很大的診斷價值。一般可列為首選，對HCC的確診率達90%以上。高分辨實時超聲可發現2cm以下的小肝癌，能檢出HCC結節的形態、大小和部位，門脈主幹或其分支內有無癌栓等。CT掃描與超聲同為無創性檢查方法，圖像清晰、解析度高，可顯示器官全貌和鄰近組織的侵犯情況。生化與免疫學檢查1)癌胚抗原(CEA):首先從結腸癌提取物中發現，並存在於2 6個月齡的胚胎組織中。其後的研究發現CEA也存在於其他部位的上皮腫瘤中，是目前研究最為廣泛的大腸癌腫瘤標誌物。在早期大腸癌患者血中，CEA陽性率可達30 40%，在進展期大腸癌中可達90%左右。在50%早期胃癌和進展期胃癌中也可發現CEA明顯增高。2)糖鏈抗原19-9(CA19-9) :CA19_9是1979年Koprowski等用人結腸癌細胞系SWl 116免疫小鼠獲得單克隆抗體，並用該抗體檢測出相應的腫瘤抗原CA19-9，雖然其在大腸癌中的陽性率較CEA低，但其特異性相對較CEA高。胃腺癌常伴CA19-9升高，其陽性率約為45%，此夕卜，胰腺癌患者血中CA19-9含量亦顯著增高，陽性率甚至超過大腸癌，因此，CA19-9亦非理想的大腸癌標誌物。3)CA72-4 CA72-4對胃癌的診斷價值較高其敏感性約為68%，特異性約為91%。4) AFP :在成人，如果血清中出現高濃度的AFP，強烈提示HCC或生殖腺胚胎腫瘤。此外，極少數胃、胰，膽管、結直腸癌AFP也可升高，但其絕對值不如HCC高。血清AFP是當前診斷HCC特異性、靈敏度最高的腫瘤標誌物。除上述，尚有一些其他腫瘤標誌物如Y-GT及其同エ酶、CA125，CA242、CA50等等均對臨床診斷有不小的價值。基因學診斷目前認為致癌過程是多階段的，包括多個連續的「獨立」事件，是多個遺傳物質，即基因累積性改變的結果，主要包括癌基因的激活，如myc、ras、abl，抑癌基因的失活，典型的如APC、p53、Rb基因等。APC在結腸癌上皮増殖中起「看門」作用，故又稱為「看門基因」。目前對於基因突變的檢測包括免疫組織化學染色、聚合酶鏈反應(PCR)、變性梯度凝膠電泳法(DGGE)、限制性片段長度多態性分析(RFLP)以及寡核苷酸探針雜交法等。 隨著後基因組時代的到來，表觀遺傳學(Epigenetics)已成為生命學科的研究前沿。表觀遺傳學是針對遺傳學而言的，是指研究DNA序列不發生改變的可遺傳的基因表達變化的科學，它可以解釋ー些經典遺傳學所不能解釋的問題，例如單卵雙生的兄弟具有完全相同的基因型，並在同樣的環境下成長，但僅其中一人患胃癌，而另外一人身體健康，因此表觀遺傳信息提供了何時、何地以何種方式去應用遺傳信息的指令。在消化系統腫瘤領域中，表觀遺傳學研究主要集中DNA甲基化及組蛋白こ醯化上。DNA甲基化修飾是基因組表觀遺傳調控中主要的方式，人類腫瘤的發生、發展與DNA甲基化的異常有關，基因啟動子區CpG島高甲基化可導致抑癌基因表達沉默進而導致腫瘤發生。DNA甲基化是指在甲基化轉移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到CG 二核苷酸胞嘧啶的5號碳原子上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化異常是細胞癌變過程中早期、頻發事件，因此特異基因的甲基化可作為癌症早期診斷的分子標誌物、治療靶點和判斷預後手段。隨著技術的進步，檢測甲基化的手段也豐富起來，不僅可探測某段DNA序列的甲基化分布，而且還能大通量的了解整個基因組的甲基化程度。目前主要方法有兩類ー是亞硫酸氫鈉法(SodiumBisulfite)，包括亞硫酸氫鈉法依賴的基因測序法、亞硫酸氫鈉聯合限制性內切酶分析法(COBRA)、甲基化特異性PCR (Methylation Specific PCR, MSP)、甲基化敏感的單核苷酸擴增法(Ms-SNuE)等；另一類是甲基化敏感的限制性內切酶法，包括Southern法、甲基化敏感的限制性圖譜(MSRF)、限制性標記基因組掃描技術(RLGS)、差異性甲基化雜交分析(DMH)、甲基化CpG島擴增子分析(MCA)等。值得ー提的是MS-PCR，自1996年Herman發明了此項技術後，大大簡化了 DNA甲基化的檢測方法，使得表觀遺傳學研究更加迅速的向前發展，其突出的優點在於高特異性、高靈敏度、操作簡便、費用及耗時均較少、不受限制性內切酶的限制，目前MS-PCR已成為用以研究基因甲基化狀態的應用最為廣泛的方法，尤其對於大批的臨床標本甲基化狀態的研究更是首選方法。MS-PCR的基本原理是DNA經過亞硫酸鹽硫化修飾後，CpG島上沒有發生甲基化的CG 二核苷酸中的胞嘧啶就轉化為尿嘧啶，最後轉化為胸腺嘧啶，而發生甲基化的胞嘧啶則保持不變，因此針對上述區別分別設計甲基化引物及非甲基化引物，分別進行PCR擴增，擴增產物進行凝膠電泳照相觀察結果，得出是否為甲基化的結論。
DACHl基因最初在研究Ellipse(Elp)突變體果蠅眼睛的發育時，發現在這種突變體中，眼睛的起始發育細胞不能正常分化，基因學證據表明Elp等位基因是果蠅屬EGFR同族體，隨後，Graeme Mardon等人在Elp突變果蠅中鑑定出Ellipse突變的抑制基因，使得突變果蠅眼睛和腿能正常發育，因為該基因缺失的果蠅為短腿表型，因此將其命名為 dachshund (DACH)(Mardon, G. , N. M. Solomon, and G. M. Rubin, dachshund encodesa nuclear protein required for normal eye and leg development in Drosophila.Development, 1994. 120 (12) p. 3473-86.)。DACHl 基因位於人 13 號染色體長臂ニ區ニ帶，即13q22，外顯子數12。下面簡述DACHl基因的結構與功能DAC基因在多細胞動物的發育過程中起著至關重要的作用，調控著眼睛、腿和性腺的發育。在眼睛的發育調節中，dac基因是視網膜決定基因網絡(RDGN)的重要成員，保證正常的眼睛發育起始(Chen, R. , et al. , Dachshund and eyes absent proteins forma complex and function synergisticaily to induce ectopic eye development inDrosophila. Cell, 1997. 91 (7) :p. 893-903)。研究發現，從果蠅、鼠到人，DAC 基因在結構上存在兩個高度保守結構域，功能上也高度一致(Hammond，K. L.，et al.，Mammalianand Drosophila dachshund genes are related to the Ski proto-oncogene and are expressed in eye and limb. Mechanisms of development,1998. 74(1-2) :p.121-31·)，DAC基因家族主要包括DACH1、DACH2，DACH1主要與眼睛、腿、性腺等的發育有關，DACHl突變鼠胚胎出生後伴有多器官損傷，很快夭折(Backman, M.，et al.，Targeted disruption ofmouse Dacnl results in postnatal lethality. Developmental dynamics an officialpublication of the American Association of Anatomists,2003. 226(I) p.139-44.；Davis, R. J.，et al.，Dachl mutant mice bear no gross abnormalities in eye, limb，and brain development and exhibit postnatal lethality. Molecular and cellularbiology，2001. 21 (5) :p. 1484-90.)。比較之下，DACH2的功能似乎不及DACHl那麼重要，DACH2突變的小鼠並未表現出明顯的發育異常(Davis, R. J.，et al.，Characterizationof mouse Dach2，a homologue of Drosophila dachshund. Mechanisms of development，2001. 102(1-2) p. 169-79.)。DACHl基因是視網膜決定基因網絡(RDGN)成員之一，編碼ー種保守的核蛋白，DAC基因在基因組中約佔20kb，含有12個外顯子，編碼出的蛋白包括1081個胺基酸殘基，含有兩個高度保守的結構域，DachBox-N和DachBox-C，在人類，DachBox-N與SKI/SN0蛋白胺基酸序列高度一致，所以又稱為DACH SKI/SN0(DS) domain。DACHl通過該結構域與HDAC3、SIX6、NCoR 結合發揮作用(Kim, S. S. , et al.，Structure of the retinal determinationprotein Dachshund reveals a DNA binding motif. Structure,2002. 10(6) :p. 787-95.)。除與發育相關外，目前，DACHl基因與腫瘤之間關係的研究是學術界關注的熱點。研究資料表明，DACHl不僅與腫瘤的發生機制，而且與腫瘤的預後相關。目前研究發信在乳腺癌、前列腺癌、子宮內膜癌等中均有DACHl的表達異常。在乳腺癌中，DACHl明顯低表達，並且與CyclinDl成負相關，分析2200名患者的DACHl表達和預後關係，發現DACHl低表達患者預後較差，DACHl低表達患者較正常表達患者至少提前3年死亡OVu，K. et al. (2006)DACHl is a ce丄丄 fate determination factor thatinhibitscyclinDl and breast tumor growth. Mol. Cell. Biol. 26, 7116-7129) 0 DACHl 可以抑制 C-jun誘導的 DNA 合成和細胞增通(Wu, K.，et al.，Cell fate determination factor DACHlinhibits c-Jun—induced contact-independent growth. Molecular biology of thecell, 2007. 18(3) :p. 755-67.)。研究表明DACHl可以通過抑制TGF-β信號通路抑制腫瘤的發生發展(Wu,K. ,et al. ,DACHl inhibits transforming growtn factor-beta signalingthrough binding Smad4.The Journal of biological chemistry,2003.278(51)p. 51673-84.)。本發明首次通過MSP的方法在消化系統腫瘤中成功驗證了細胞DACHl啟動子區的高甲基化。因此推斷該基因的啟動子區高甲基化狀態可能是ー個新的消化系統腫瘤分子標記物，細胞DACHl基因可能是ー個新的消化系統腫瘤相關抑癌候選基因。以此為堅實的理論依據，本發明人應用MSP的方法對大量臨床消化系統腫瘤(胃癌、結直腸癌、肝癌、食管癌)及正常胃、結直腸、肝、食管標本進行檢測，以明確其細胞DACHl基因啟動子區甲基化狀態
發明內容
本發明的目的是提供ー種檢測細胞DACHl基因啟動子區甲基化狀態的引物對，SP用於檢測細胞DACHl基因啟動子區甲基化狀態和非甲基化狀態的ー對特異性引物對，其包括甲基化引物和非甲基化引物，同時，本發明還提供ー種含有上述甲基化引物或非甲基化引物的試劑盒。本發明提供ー種用於檢測細胞DACHl基因啟動子區甲基化狀態的引物對，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上遊引物核苷酸序列為5' -GGAAAAAATTATTAGTTTTCGCGGAC-3'，下遊引物核苷酸序列為5, -AAACCGAAAACACAAAAATAACGATCG-3』；所述非甲基化引物的上遊引物核苷酸序列為5' -TTTGGAAAAAATTATTAGTTTTTGTGGAT-3'，下遊引物核苷酸序列為5' -AAAAAACCAAAAACACAAAAATAACAATCA-3/。本發明還提供ー種用於檢測消化系統腫瘤細胞的試劑盒，其中，該試劑盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物，所述消化系統腫瘤包括胃癌、結直腸癌、肝癌、食管癌。本發明具有如下優點利用本發明所述引物對及試劑盒檢測胃、食管、結直腸黏膜細胞或肝的活檢組織細胞，在腫瘤細胞中DACHl基因啟動子區呈高甲基化狀態，甲基化率在胃癌、結直腸癌、肝癌及食管癌中分別約為66%、50. 4%、49%、70%，而在正常胃、結直腸、肝、食管組織細胞中，DACHl基因啟動子區呈非甲基化狀態，表明該基因啟動子區的甲基化狀態對於消化系統腫瘤細胞具有特異性；同時應用本發明所述引物對及試劑盒可使檢測消化系統腫瘤細胞的靈敏度達到0. 5%，即1000個細胞中有5個癌細胞就能夠被檢測出，這說明DACHl基因啟動子區甲基化狀態可作為消化系統腫瘤中新的分子標誌。本試劑盒首次選用細胞DACHl基因作為目標基因，具有首創性。因此，應用本發明引物及試劑盒來檢測細胞DACHl基因啟動子區高甲基化狀態可作為消化系統腫瘤如胃癌、結直腸癌、肝癌和食管癌的診斷、療效觀察、預後判斷等的有力手段，而且，操作簡便、穩定性好，具有深遠的臨床意義和推廣性。
圖I以硫化修飾後的人外周血淋巴細胞DNA(非甲基化對照)，硫化修飾後的結腸癌細胞系HCTl 16細胞DNA(甲基化對照)和去離子水(陰性系統對照)建立對照體系。分別用甲基化引物及非甲基化引物對胃癌、結直腸癌、肝癌、食管癌組織標本進行MSP檢測，同時檢測正常結腸、胃、肝和食管細胞DNA。擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果(分別擴增，混合點樣)如圖所示。圖2將結腸癌細胞系HCT116的DNA(DACH1基因啟動子區100%甲基化)與正常結腸組織細胞的DNA(DACH1基因啟動子區100%非甲基化)按比例混合，進行硫化修飾，此後用甲基化引物進行擴増，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果(分別擴增，混合點樣)如圖所
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具體實施例方式經過反覆的試驗與推敲，本發明人選出ー對特異性很好的甲基化引物對及非甲基化引物對，應用敏感度較高的瓊脂糖凝膠電泳技術作為結果的檢出手段，得出可靠的實驗結果，實驗結果表明=DACHl基因啟動子區的高甲基化狀態在人類消化系統腫瘤中具有較 高的特異性。利用所述引物對及試劑盒檢測細胞DACHl基因甲基化狀態的靈敏度高，解決了上述現有技術中其他方法的檢出率低、結果難以分析、僅能顯示大體的基因學異常等一系列技術問題，因此，本發明所述的引物及試劑盒可用於消化系統腫瘤的早期診斷、療效判定等。本發明提供的用於檢測細胞DACHl基因啟動子區甲基化狀態的引物對，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上遊引物核苷酸序列如SEQ ID No. I所述，S卩5' -GGAAAAAATTATTAGTTTTCGCGGAC-3'，下遊引物核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所述，即5^ -AAACCGAAAACACAAAAATAACGATCG-3;;所述非甲基化引物的上遊引物核苷酸序列如 SEQ ID No. 3 所述，S卩5' -TTTGGAAAAAATTATTAGTTTTTGTGGAT-3'，下遊引物核苷酸序列如 SEQ ID No. 4 所述，SP :5' -AAAAAACCAAAAACACAAAAATAACAATCA-3'。利用上述甲基化引物，以硫化修飾後的DNA為模板進行MSP擴增，如果DACHl基因啟動子區存在甲基化，則會得到124bp大小的片段；如果DACHl基因未發生甲基化，則不產生擴增產物。基於此，本申請將該引物稱為甲基化引物。所述甲基化引物，其上遊引物的Tm69. 7，GC 含量 48. 1%，下遊引物的 Tm 70. 2，GC 含量 33. 3%。利用該非甲基化引物，以硫化修飾後的DNA為模板進行MSP擴增，如果DACHl基因未發生甲基化，則會得到130bp大小的片段。基於此，本申請將該引物稱為非甲基化引物。所述非甲基化引物，其上遊引物的Tm 66.7，GC含量20. 7%，下遊引物的Tm67. 2，GC含量20%。本發明提供的用於檢測消化系統腫瘤細胞的試劑盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物，所述消化系統腫瘤包括胃癌、結直腸癌、肝癌、食管癌。進ー步地，本發明的試劑盒還含有甲基化對照MSP模板，該模板為硫化修飾後的細胞DACHl基因啟動子區為100%甲基化的腫瘤細胞DNA。在此，對該腫瘤細胞沒有特別的限制，只要滿足「硫化修飾後的細胞DACHl基因啟動子區100%甲基化」即可，例如可以為消化系統腫瘤細胞等，所述消化系統腫瘤包括胃癌、結直腸癌、肝癌、食管癌。進ー步地，本發明的試劑盒還含有非甲基化對照MSP模板，該模板為硫化修飾後的細胞DACHl基因啟動子區為100%非甲基化的正常細胞DNA。在此，對該正常細胞沒有特別的限制，只要滿足「硫化修飾後的細胞DACHl基因啟動子區100%非甲基化」即可，例如可以為正常外周血淋巴細胞、正常消化系統組織細胞等，所述正常消化系統組織包括正常胃、結直腸、肝、食管組織。進ー步地，本發明的試劑盒還含有作為陰性系統對照的去離子水。進ー步，本發明的試劑盒還含有MSP反應所需的下列成分50mM MgCl2,10XMSPbuffer,IOmMdNTPmixture, Hot start Taq 酶。為更詳細地了解本發明，以下通過實施例對本發明作進ー步的闡述。實施例一I、模板的製備(基因組DNA的提取及硫化修飾過程)DNA的製備獲取胃癌、結直腸癌、肝癌、食管癌標本及正常上述組織標本。在本 實施例中結直腸癌8例(CRC1-CRC8)、胃癌8例(GC1-GC8)、肝癌5例(HCC1-HCC5)、食管癌5例、正常結直腸(NC1-NC3)、正常胃(NG1-NG2)、一例正常肝(NH)和一例正常食管，應用酚-氯仿抽提的方法分別提取基因組DNA，紫外分光光度儀測定吸光度(A)值確定其含量及純度。亞硫酸鹽修飾參考herman (J. G. Herman, J. R. Graff, S. Myohanen,B.D.NelkinandS.B.Baylin, Methylation-specific PCR a novel PCR assayformethylation status of CpG islands, Proc. Natl. Acad. Sci. USA93 (1996),9821-9826.)等報導的方法加以改迸。取上述製備的基因組DNA，經稀釋後，在液氮中反覆凍融2次，再用26G注射器抽吸40次，應用紫外分光光度計測定DNA濃度，並精確取2ugDNA，加去離子水至終體積50ul，加入新鮮配製的2M的NaOH 5. 5ul，37°C孵育15min。之後加入新鮮配製的IOmM的氫醌30ul及3M亞硫酸氫鈉520ul混合均勻(其內已加入新鮮配製的2M的NaOH，計算方法10ml 3M亞硫酸氫鈉中加入2M的NaOH 740ul)，50°C孵育16h，此後應用DNA純化試劑盒(promega公司產品)純化並回收DNA，應用50ul去離子水洗脫DNA，向其內加入5. 5ul 3M的NaOH以終止硫化修飾，加入Iul糖原和17ul 7. 5Mこ酸銨，用3倍體積的無水こ醇沉澱DNA，最終硫化修飾後的DNA重新溶解在20ul去離子水中，得到DNA模板,立即使用或-20°C保存。2、MSP 擴增以甲基化引物進行擴增的MSP反應體系，以總體積25ul計，包括模板(硫化修飾後的DNA) 2ul ；甲基化引物(50pmol/ul)上遊引物(5'-GGAAAAAATTATTAGTTTTCGCGGAC-3' ) 0. 5ul,下遊引物(5'-AAACCGAAAACACAAAAATAACGATCG-3' ) 0. 5ul ；50mM MgCl2 (Invitrogen 公司)0. 75ul ；10 XMSP buffer (緩衝液,Invitrogen 公司)2. 5ul ；IOmMdNTP mixture (Invitrogen 公司)1. 25ul ；Hot start Taq 酶(Invitrogen 公司，濃度為 5U/ μ L) :0. Iul ；去離子水17.4ul以非甲基化引物進行擴增的MSP反應體系與以甲基化引物進行擴增的MSP反應體系的不同之處僅在於引物不同。具體地，以非甲基化引物進行擴增的MSP反應體系，以總體積25ul計,包括非甲基化引物(10pmol/ul)上遊引物(5'-TTTGGAAAAAATTATTAGTTTTTGTGGAT-3/ ) 0. 5ul,下遊引物(5'-AAAAAACCAAAAACACAAAAATAACAATCA-3' ) 0. 5ul ；其餘組分及其用量均與以甲基化引物進行擴增的MSP反應體系中的相同。以上僅分別列舉了以甲基化引物和非甲基化引物進行擴增的MSP反應體系中各組分的用量的ー個例子，使用不同公司生產的MgCl2、MSP buffer緩衝液、dNTP mixture、Hotstart Taq酶時，反應體系中各組分的用量會有所不同，可以根據實際需要進行調整。本發明對MSP反應體系中各組分的用量沒有特別的限制，使用常規的用量即可。利用上面建立的MSP反應體系對製備的33個硫化DNA模板——結直腸癌8例 (CRC1-CRC8)、胃癌 8 例(GC1-GC8)、肝癌(HCC1-HCC5) 5 例、食管癌(EC1-EC5) 5 例，正常結直腸(NC1-NC3) 3例、正常胃(NG1-NG2) 2例、正常肝(NH) I例和正常食管(NE) I例分別進行擴增，並以與上述組織同時硫化修飾後的結腸癌細胞系HCT116細胞DNA為甲基化對照(IVD)，以硫化修飾後的人外周血淋巴細胞DNA為非甲基化對照(NL)，以去離子水作為陰性系統對照(H2O)，擴增程序為95°C下預變性5min，接著進入循環，在95°C下變性30s，在60°C下退火30s，在72°C下延伸40s，共35個循環，之後，繼續在72°C下延伸7min。3. MSP反應產物的檢測MSP產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射分析儀檢測並照相。4.結果圖I以硫化修飾後的人外周血淋巴細胞DNA(非甲基化對照)，硫化修飾後的結腸癌細胞系HCT116細胞DNA(甲基化對照)，去離子水(陰性系統對照)建立對照體系，分別用甲基化引物及非甲基化引物對胃癌、結直腸癌、肝癌、食管癌組織標本進行MSP檢測，同時檢測正常結腸、胃、肝和食管細胞DNA。擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果(分別擴增，混合點樣)如圖所示。Marker 為 DL2OOOmarker (分子量標準)M標記的2、4、6、8、10、12、14、16泳道為甲基化引物擴增的產物；U標記的3、5、7、9、11、13、15、17泳道為非甲基化引物擴增的產物；NC1、NC2、NC3為正常結直腸，NG1、NG2為正常胃；CRC1 CRC8為結直腸癌；GC1 GC8為胃癌；HCC1 HCC5為肝癌；NH為正常肝；ECl EC5為食管癌；NE為正常食管。另有IVD標記的為甲基化對照，NL標記的非甲基化對照，H2O陰性系統對照(去離子水)。結果判讀方法如下用甲基化引物(圖中以M表示)進行擴增，有擴增產物，而用非甲基化引物(圖中以U表示)進行擴增，無擴增產物的標本，判讀為完全甲基化；用甲基化引物及非甲基化引物進行擴增，均有擴增產物的標本，判讀為部分甲基化；用非甲基化引物進行擴增，有擴增產物，用甲基化引物進行擴增，無擴增產物的標本，判讀為非甲基化。部分甲基化及完全甲基化的標本均判讀為甲基化。如圖I 所示，結直腸癌 CRC2、CRC4、CRC6、CRC7，胃癌 GC1、GC3、GC4、GC5、GC6、GC7，肝癌HCC1、HCC2、HCC5，食管癌EC1、EC3、EC4為部分甲基化(其中，EC4接近完全甲基化)；結直腸癌CRC1、CRC3、CRC5、CRC8，胃癌GC2、GC8、肝癌HCC3、HCC4和食管癌EC2、EC5為非甲基化。正常結直腸(NC1-NC3)、胃(NG1-NG2)、肝(NH)、食管(NE)均為非甲基化。對照體系反應正常，結果可信。實施例ニ臨床標本檢測取胃癌臨床標本65例，結直腸癌標本100例，肝癌標本55例和食管癌60例。進行MSP擴增，模板製備、PCR擴增體系及條件、擴增產物的檢測均與實施例一中的相同，檢測結果請見下表I :表I
權利要求
1.ー種用於檢測細胞DACHl基因啟動子區甲基化狀態的引物對，包括甲基化引物和非甲基化弓I物，其中，所述甲基化弓I物的上遊引物核苷酸序列W -GGAAAAAATTATTAGTTTTCGCGGAC-3'，下遊引物核苷酸序列為5' -AAACCGAAAACACAAAAATAACGATCG-3';所述非甲基化引物的上遊引物核苷酸序列為5' -TTTGGAAAAAATTATTAGTTTTTGTGGAT-3'，下遊引物核苷酸序列為5' -AAAAAACCAAAAACACAAAAATAACAATCA-3/。
2.ー種用於檢測消化系統腫瘤細胞的試劑盒，其特徵在於含有權利要求I中所述的甲基化引物或非甲基化引物，所述消化系統腫瘤包括胃癌、結直腸癌、肝癌、食管癌。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於還含有甲基化對照MSP模板，該模板為硫化修飾後的細胞DACHl基因啟動子區100%甲基化的腫瘤細胞DNA。
4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於還含有非甲基化對照MSP模板，該模板為硫化修飾後的細胞DACHl基因啟動子區100%非甲基化的正常細胞DNA。
5.根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於還含有作為陰性系統對照的去離子水。
6.根據權利要求2至5中任一項所述的試劑盒，其特徵在於還含有MSP反應所需的下列成分50mM MgCl2,10 XMSP buffer, IOmMdNTP mixture, HotstartTaq 酶。
全文摘要
本發明提供用於檢測細胞DACH1基因啟動子區甲基化狀態的引物對及試劑盒。本試劑盒首次選用細胞DACH1基因作為目標基因，該基因是本發明人通過MSP技術證明在胃癌、結直腸癌、肝癌和食管癌細胞中啟動子區呈高甲基化狀態的基因，具有首創性。利用本發明所述引物對及試劑盒檢測胃癌、結直腸癌、肝癌及食管癌細胞的特異性好，在胃癌中為66％，結直腸癌50.4％，肝癌49％，食管癌70％；靈敏度高，達到0.5％，即1000個細胞中有5個癌細胞就能夠被檢測出。應用本發明試劑盒來檢測細胞DACH1基因啟動子區高甲基化狀態可作為消化系統腫瘤診斷、療效觀察、預後判斷、殘留病灶檢測等的有力手段，而且，操作簡便、穩定性好，具有深遠的臨床意義和推廣性。
文檔編號C12N15/11GK102851354SQ20121001296
公開日2013年1月2日 申請日期2012年1月16日 優先權日2012年1月16日
發明者郭明洲, 楊雲生, 閆文姬, 韓為東, 朱宏斌 申請人:中國人民解放軍總醫院