一種鑑別花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺苗種的引物和方法
2023-04-26 09:34:21 2
一種鑑別花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺苗種的引物和方法
【專利摘要】本發明應用微衛星標記對花鰻鱺（Anguilla?marmorata）和太平洋雙色鰻鱺（Anguilla?bicolor?pacifica）苗種進行鑑別，發明的一對引物命名為E-EEL170，序列如SEQ?ID?No.1和2所示。鑑定時用普通DNA提取試劑盒提取2種鰻鱺鰻苗基因組DNA並用該對引物對2種鰻鱺DNA樣品進行PCR擴增，再用1%瓊脂糖凝膠(EB染色)電泳對PCR產物進行檢測，250bp左右大小的條帶為花鰻鱺鰻苗，500bp左右大小的條帶為太平洋雙色鰻鱺鰻苗。本發明僅需剪取少量尾鰭而不處死魚苗即可進行鑑別，具有穩定性高、重複性好、實用性強、操作簡單並可快速準確鑑別等優點。
【專利說明】一種鑑別花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺苗種的引物和方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於水產養殖學領域分子標記技術在生產實踐中的應用。具體地說，本發明涉及應用微衛星標記技術對花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺苗種進行鑑別。
【背景技術】
[0002]花鰻鱺(Anguilla marmorata)隸屬於硬骨魚綱、鰻鱺目、鰻鱺科、鰻鱺屬，俗稱魚盧鰻，大鰻，鰻王，鱔王等，屬於降河洄遊性魚類，花鰻鱺分布於中國、澳大利亞、日本、東南亞和非洲等熱帶、亞熱帶地區，在我國福建、廣東、廣西、海南和臺灣均有零星分布。花鰻鱺營養豐富，蛋白質含量高於同屬鰻鱺，同時脂肪含量遠低於同屬鰻鱺，胺基酸組分豐富齊全，又稱「淡水人參」，是一種經濟價值極高的名貴魚類，1988年被列為國家二級野生保護動物。
[0003]太平洋雙色鰻鱺(Anguilla bicolor pacifica)同屬於硬骨魚綱、鰻鱺目、鰻鱺科、鰻鱺屬，俗稱黑鰻，也屬於降河洄遊性魚類。該鰻鱺分布於印度太平洋區，我國兩廣、臺灣和菲律賓附近海域為太平洋雙色鰻鱺的主要產地。
[0004]花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺各具特色，太平洋雙色鰻鱺雖然生長性能優異，生長速度快於花鰻鱺，具集約化養殖的潛力，但是口感和營養價值均不及花鰻鱺。目前2種鰻鱺市場需求量與日俱增，在我國南部沿海和東南亞等地兩種魚的養殖規模也在逐年擴大，苗種需求量也大幅度的增加，隨之而來的是鰻苗的來源問題。由於花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺在鰻苗期外觀體型十分相似，即使是養殖經驗豐富的漁民用肉眼也難以區分2者。多年來鰻鱺的人工繁殖技術仍未有所突破，花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺的苗種均通過捕撈天然玻璃鰻獲得，而2種鰻苗的產區混雜，在菲律賓海域以及我國海南海域一帶捕撈到的往往是2種鰻苗的混合群體。致使我國鰻苗市場常常魚龍混雜，但由於2種鰻鱺苗種的需求對象不同，且2種商品鰻鱺市場價格相差很大。若不能有效地把2種鰻苗區分出來，將極大影響到養鰻企業和漁民的經濟效益。
[0005]由於花鰻鱺鰻苗和太平洋雙色鰻鱺鰻苗在形態學上的相近和產地的混雜，迫切需要找到一種高效而且準確的方法去區分這2種鰻苗。而基因組中的微衛星DNA遵守孟德爾遺傳法則，呈共顯性表達，且同時具有分布廣、遺傳信息含量高和便於PCR檢測等優點，已被廣泛用於魚類親緣關係鑑定、遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖構建及系統進化等方面的研究。研究表明:微衛星側翼序列在屬內種間和有較近親緣關係的屬間相當保守。因此，鑑於2種鰻苗形態學鑑定的不確定性，我們利用微衛星分子標記技術對2種鰻鱺苗種進行鑑別區分，從而指導我國鰻鱺產業的健康發展。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種快速準確鑑別花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺苗種的鑑別引物和方法，以克服現有從形態學上鑑定存在主觀性強且不能有效地鑑定2種鰻苗的缺陷，本發明只需剪取少量尾鰭而不處死鰻苗即可進行鑑別，具有穩定性高、操作簡單重複性好、實用性強並可快速準確鑑別等優點。[0007]本發明的技術方案是
[0008]一種花鰻鱺鰻苗和太平洋雙色鰻鱺苗種的鑑別引物，命名為E-EEL170，序列如下:
[0009]F:5，-GCCCGAAAATACCAAGATGA-3, (SEQ ID N0.1)
[0010]R:5，-CCTGCTCCCAAAACATCCTA-3, (SEQ ID N0.2)
[0011]本發明還公開了花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺苗種的鑑別方法，包括下列步驟:
[0012]I)提取鰻鱺鑑定樣品DNA ；
[0013]2)用上述引物對步驟I)提取的樣本進行DNA擴增，獲得PCR產物；
[0014]3)用1%瓊脂糖凝膠(EB染色)電泳對PCR產物進行檢測，250bp左右大小的條帶為花鰻鱺，500bp左右大小的條帶為太平洋雙色鰻鱺。
[0015]本發明是首次基於分子生物學手段建立起對花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺苗種進行鑑別的方法，利用從花鰻鱺中合成、篩選的特異微衛星引物E-EEL170，建立了一個普通的PCR反應就可以實現鑑別2種鰻鱺種質的新方法。本方法無需依賴專業的魚類分類學知識，也不需要具有長期從事魚類鑑別的豐富經驗，僅需取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測得到穩定、清晰、差異明顯的擴增條帶，成本低，操作簡單，實用性強，可以用於指導鰻鱺養殖生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1:E_EEL170引物在花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺2個群體中的擴增結果。
[0017]M-Marker ;1_10為花鰻鱺；11-20為太平洋雙色鰻鱺。
【具體實施方式】
[0018]以下結合附圖實施例對本發明作進一步的詳細描述。
[0019]實施例
[0020]1.花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺基因組DNA的提取及定量
[0021]採用北京Trans海洋生物基因組試劑盒快速提取2種幼鰻尾鰭10~30mg。(來源於海南島南部海域，體長7~10cm，經形態學綜合鑑定，確定為花鰻鱺鰻苗和太平洋雙色鰻鱺鰻苗各10尾)的DNA，試劑盒提取樣品DNA較之傳統方法提取樣品DNA具有提取效率高、速度快、提取DAN質量高等特點。
[0022]2.微衛星位點的篩選及引物的合成
[0023]將I中所得花鰻鱺鰻苗樣品的基因組DNA交給生物公司測序，利用所得數據篩選出微衛星位點併合成其引物。
[0024]3.花鰻鱺鰻苗和太平洋雙色鰻鱺苗鑑別引物的篩選
[0025]用PCR儀檢驗2中引物在花鰻鱺鰻苗和太平洋雙色鰻鱺鰻苗中的擴增情況
[0026]I) PCR擴增體系
[0027]PCR擴增反應體系如下:滅菌水(12.3 μ L)，10 X buffer緩衝液(2 μ L)，2mM的dNTP (2μ L)，2.5mM 的 Mg2+ (1.5μ L),5U 的 Taq 酶(0.2 μ L)，IOuM 正反引物(各 0.5 μ L)，鰻苗模板DNA (lyL)。
[0028] 2) PCR擴增反應[0029]在PCR擴增儀上於94°C預變性5min，30個循環:94°C變性30sec，49 °C下退火30sec，72°C延伸 lmin，最後 72°C延伸 5min，4°C保存。
[0030]3)瓊脂糖凝膠電泳檢測
[0031]取PCR擴增反應產物5 μ L進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色並用紫外凝膠成像系統拍照。
[0032]4)鑑別引物的確定
[0033]挑選出能在花鰻鱺鰻苗和太平洋雙色鰻鱺鰻苗中成功擴增且產物經3)檢測可得出明顯差別條帶的一對引物，所述的引物序列為:
[0034]F:5，-GCCCGAAAATACCAAGATGA-3, (SEQ ID N0.1)；
[0035]R:5, -CCTGCTCCCAAAACATCCTA-3, (SEQ ID N0.2)。
[0036]此對引物所得產物的電泳圖如圖1所示，根據電泳條帶與標準Marker比較:250bp左右大小的條帶為花鰻鱺鰻苗，500bp左右大小的條帶為太平洋雙色鰻鱺鰻苗。
[0037]4.其他鰻鱺屬鰻苗幹擾的排除
[0038]在菲律賓海域以及我國海南海域一帶捕撈到的往往是花鰻鱺鰻苗和太平洋雙色鰻鱺鰻苗的混合群體，屬於熱帶鰻鱺種類，可排除同屬其它鰻鱺種類的幹擾。
【權利要求】
1.一種花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺苗種的鑑別引物，其特徵在於所述該引物命名為E-ELL170，其序列如下: F:5，-GCCCGAAAATACCAAGATGA-3,；
R:5，-CCTGCTCCCAAAACATCCTA-3,。
2.一種花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺苗種的鑑別方法，其特徵在於，包括下列步驟: 1)提取待鑑定的鰻苗DNA； 2)用權利要求1所述引物對步驟1)提取的樣本進行DNA擴增，獲得PCR產物； 2)用1%瓊脂糖凝膠EB染色電泳對PCR產物進行檢測，250bp大小的條帶為花鰻鱺鰻苗，500bp大小的條帶為太平洋雙色鰻鱺鰻苗。
【文檔編號】C12N15/11GK103911444SQ201410101871
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月19日 優先權日:2014年3月19日
【發明者】尹紹武, 王小魯, 賈一何, 李麗, 許芳, 胡亞麗 申請人:南京師範大學