一種檢測焦磷酸酶的螢光傳感器及其製備方法
2023-04-26 09:32:06
一種檢測焦磷酸酶的螢光傳感器及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測焦磷酸酶的螢光傳感器及其製備方法，在未加入焦磷酸酶，只有焦磷酸存在時，焦磷酸與二價銅形成絡合物，抗壞血酸鈉不能夠還原絡合的二價銅為一價銅作為催化劑，疊氮香豆素和丙炔醇也不能發生1,3-偶極環加成反應，從而體系的螢光強度很低；但是在同時加入焦磷酸酶的情況下，焦磷酸酶能夠水解焦磷酸抑制二價銅絡合物的形成，點擊化學反應能夠繼續發生，體系的螢光強度大幅爭強且螢光強度與加入的焦磷酸酶的量存在線性關係。該傳感器成功地應用於焦磷酸酶抑制劑氟化鈉的檢測，本發明具有操作簡單、成本低、靈敏度高、特異性好等優點。
【專利說明】一種檢測焦磷酸酶的螢光傳感器及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於分析化學領域，具體涉及一種基於點擊化學的螢光化學傳感器檢測焦磷酸酶的方法。
【背景技術】
[0002]焦磷酸酶(EC 3.6.1.1)或無機焦磷酸酶是一種水解酶類可以特異性地把焦磷酸(P2074_，PPi)水解為無機磷酸鹽。焦磷酸酶水解焦磷酸是一個高能量釋放反應，它可偶聯到一些熱力學上不利的轉化過程，以便驅動這些轉化進行(Biswas et al.，2013.Nucleic acids research 41，e56.; Cestari et al.，2013.Journal of b1molecularscreening 18，490-497.)。早期研究表明，焦磷酸酶在脂代謝(包括脂合成與分解)、鈣吸收以及骨形成和脫氧核糖核酸(DNA)合成中扮演重要角色(Ilias et al.，2006.B1chimica et b1physica acta 1764, 1299-1306.; Heinonen, J., 1970.Analyticalb1chemistry 37，32-43.)。因此焦磷酸酶在能量合成等代謝過程中至關重要,生物體中焦磷酸酶的損耗可導致細胞的死亡(Tamburini et al., 2014.Soil Science Society ofAmerica Journal 78, 38.X
[0003]點擊化學(Kolbet al.，2001.Angew.Chem 40, 2004-2021.)是在 2001 年由諾貝爾化學獎獲得者美國化學家Sharpless首先提出的，主旨是通過小單元的拼接，來快速可靠地完成形形色色分子的化學合成。點擊化學具有模塊化、可靠、高效率、高選擇性、反應條件溫和、產物收率高、副反應少、分離提純簡單等特點，被廣泛應用於環境、化學及生物醫學等眾多領域。
[0004]目前檢測焦磷酸酶的方法有放射性標記法(Cartier et al., 1971.Analyticalb1chemistry 44, 397-403.),生物發光法(Eriksson et al., 2001.Analyticalb1chemistry 293, 67-70.),酸喊度分析法(YA et al., 1982.Acta ChemicaScandinavica.Series B: Organic Chemistry and B1chemistry 36, 689—694.),納米金比色法(Deng et al., 2013.Analytical chemistry 85, 9409-9415.)等。但是這些方法的普遍缺點是要麼需要用到大型的儀器設備，這類儀器設備不但價格昂貴，操作複雜，而且不方便操作，要麼需要特殊的試劑，價格較高且有些會對人體產生傷害。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種檢測焦磷酸酶的螢光傳感器及其製備方法，基於點擊化學的以螢光信號採集方式的能夠快速、簡便的檢測焦磷酸酶的方法。該方法對焦磷酸酶的檢測靈敏度高、特異性好。在0.5 mU到10 mU的濃度範圍內對焦磷酸酶的檢測呈現良好的線性響應，檢測限為0.2 mU。
[0006]為實現上述目的，本發明採用如下技術方案:
一種檢測焦磷酸酶螢光傳感器的製備方法，配置不同濃度單位的焦磷酸酶溶液，將不同濃度相同體積焦磷酸酶溶液分別加入到含有焦磷酸的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩衝液中，水浴保溫，加入銅離子繼續保溫，繼續加入疊氮香豆素，丙炔醇及抗壞血酸鈉，避光放置，用螢光分光光度計測定體系的螢光強度，記錄數據。
[0007]具體包括以下步驟:
(O配置不同濃度單位的焦磷酸酶溶液；
(2)將步驟(I)中不同濃度相同體積焦磷酸酶分別加入到含有125uM焦磷酸的10mM,pH 7.2 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩衝液中，水浴37°C保溫60分鐘；
(3)將10uM銅離子加入到上述溶液中繼續保溫20分鐘；
(4)在混合液中繼續加入250uM疊氮香豆素，250uM丙炔醇及400uM抗壞血酸鈉；避光放置15分鐘；
(5)用970-CRT螢光分光光度計測定體系的螢光強度，記錄數據；
(6)根據焦磷酸酶濃度和螢光強度值，計算得到其線性方程為Y=404.6+3331gX，其中Y為螢光強度值；X為其所對應的焦磷酸酶濃度，單位為mU。
[0008]步驟(I)中所述的焦磷酸酶溶液是用購置於sigma公司的凍乾粉稱取一定量配成高濃度母液稀釋得到。
[0009]步驟(2)中所述的不同濃度焦磷酸酶加入量為2 uL，含有焦磷酸的緩衝液體積為178 uL ；
步驟(3)中所述的銅離子加入量為2 uL ；
步驟(4)中所述的疊氮香豆素根據文獻(Qiu et al., 2013.B1sensors andB1electronics 42，332-336.)合成,未做進一步提取純化；疊氮香豆素和丙炔醇加入的量均為5 uL，抗壞血酸鈉加入量為8 uL ；
步驟(5)中所述螢光測定條件為:石英比色皿容量300 uL，光程10mm，激發光波長395nm，採集的發射波長範圍為400_600nm，激發與發射波長狹縫均為10nm。
[0010]本發明的顯著優點在於:
(I)本發明的所用的點擊試劑疊氮香豆素合成方法簡單、容易得到且具有良好的活性和穩定性，其他試劑也都比較便宜。
[0011](2)本發明的操作步驟簡單、便捷、靈敏、成本低而且無毒害，實用性強。
[0012](3)本發明的傳感器在識別焦磷酸酶及酶抑制劑氟化鈉的過程中，能快速測定螢光值，有利於快速的分析檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為本發明所述的基於點擊化學的螢光化學傳感器對焦磷酸酶檢測的示意圖。
[0014]圖2為本發明所述的螢光傳感器在不同焦磷酸酶濃度中螢光光譜；從a到i濃度分別為 0.0mU、0.5 mU、l mU、2 mU、4 mU、6 mU、8 mU、10 mU 和 20 mU。
[0015]圖3為本發明所述的螢光傳感器在其它不同蛋白質或酶中的螢光光譜；從左到右分別為空白、葡萄糖氧化酶(0.22 U)、溶菌酶(0.48 U)、人血清白蛋白(6.0X10_5M)、核酸外切酶I (0.1 U)、核酸外切酶III (I U)和焦磷酸酶(4mU)。
[0016]圖4為本發明所述的螢光傳感器應用於焦磷酸酶抑制劑氟化鈉的檢測的螢光光譜。從 a 至Ij f 依次為 0μΜ、2.0μΜ、1.6μΜ、1.2μΜ、0.8μΜ、0.4μΜ。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
以下實施例結合附圖來說明應用本發明所述方法製備螢光焦磷酸酶傳感器並將其應用於焦磷酸酶抑制劑氟化鈉濃度的檢測的操作過程:
1、焦磷酸酶水解焦磷酸。具體步驟如下:
A、將酶凍乾粉稱取一定重量配置為IU/μ L的母液，並按照梯度稀釋為所需的濃度；
B、將2μ L不同梯度的焦磷酸酶加入到含有125 μ M焦磷酸的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩衝溶液(1mM HEPES, ρΗ=7.2)中混合均勻，室溫下置於37°C水浴60分鐘；
C、在混合溶液中加入2μ L濃度為1mM的硫酸銅溶液，37°C水浴繼續反應20分鐘。
[0018]2、點擊化學螢光檢測焦磷酸酶活力，具體步驟如下:
(I)將實施例1-1中的混合液從水浴中取出，加入5μ L濃度為1mM疊氮香豆素，5 μ L濃度為1mM丙炔醇及8 μ L濃度為1mM抗壞血酸鈉，振蕩均勻後避光放置15分鐘。
[0019](2)用移液槍移取100 μ L反應混合液至石英比色皿中，測量體系的螢光強度。
[0020]實施例2
1、焦磷酸酶抑制劑氟化鈉濃度的檢測，具體步驟如下:
向含有4.0 mU焦磷酸酶的緩衝液中分別加入O μ Μ、2.0μΜ、1.6、1.2μΜ、0.8μΜ和
0.4 μ M酶抑制劑氟化鈉，室溫放置30分鐘後，加入125 μ M焦磷酸水浴37°C保溫60分鐘，然後加入100 μ M硫酸銅，繼續水浴保溫20分鐘，最後加入點擊試劑避光放置15分鐘後用螢光分光光度計測量螢光，記錄數據。
[0021]2、本發明所述方法製備螢光焦磷酸酶傳感器對焦磷酸酶檢測的特異性，具體步驟如下:
為了檢測本發明所述的螢光焦磷酸酶傳感器的特異性，將實施例1-1中所使用的焦磷酸酶換成其他幹擾物質，分別為空白溶液、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、人血清白蛋白、核酸外切酶1、核酸外切酶III。如圖3所示，從左到右為該傳感器在不同幹擾物質中所示的螢光強度值，從左到右分別為空白溶液、葡萄糖氧化酶(0.7 1111)、溶菌酶(0.4 mM)、人血清白蛋白(0.5 mM)、核酸外切酶I (0.7 mM)、核酸外切酶III (0.5 mM)和焦磷酸酶的濃度為4 mU,其相對應的螢光顏色變化如圖中所示，從左到右分別為空白溶液、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、人血清白蛋白、核酸外切酶1、核酸外切酶III和焦磷酸酶，除了焦磷酸酶有明顯的黃綠色螢光，其餘均為淺黃色。結果說明本發明所述方法製備螢光化學傳感器對焦磷酸酶檢測有較好的特異性。在0.5 mU到10 mU的濃度範圍內對焦磷酸酶的檢測呈現良好的線性響應，檢測限為0.2 mU。
[0022]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。
【權利要求】
1.一種檢測焦磷酸酶螢光傳感器的製備方法，其特徵在於:配置不同濃度單位的焦磷酸酶溶液，將不同濃度相同體積焦磷酸酶溶液分別加入到含有焦磷酸的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩衝液中，水浴保溫，加入銅離子繼續保溫，繼續加入疊氮香豆素，丙炔醇及抗壞血酸鈉，避光放置，用螢光分光光度計測定體系的螢光強度，記錄數據。
2.根據權利要求1所述一種檢測焦磷酸酶螢光傳感器的製備方法，其特徵在於:具體包括以下步驟: (O配置不同濃度單位的焦磷酸酶溶液； (2)將步驟(I)中不同濃度相同體積焦磷酸酶溶液分別加入到含有125μΜ焦磷酸的10mM、pH 7.2 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩衝液中，37°C水浴保溫60分鐘； (3)將100μ M銅離子加入到上述溶液中繼續保溫20分鐘； (4)在混合液中繼續加入250μ M疊氮香豆素,250 μ M丙炔醇及400 μ M抗壞血酸鈉；避光放置15分鐘； (5)用螢光分光光度計測定體系的螢光強度，記錄數據。
3.—種如權利要求1所述的方法製得的用於檢測焦磷酸酶的螢光傳感器。
4.一種如權利要求1所述的方法製得的用於檢測焦磷酸酶的螢光傳感器的應用，其特徵在於:通過點擊反應藉助於螢光光譜對溶菌酶進行檢測。
【文檔編號】G01N21/64GK104237193SQ201410547685
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】林振宇, 徐可豐, 郭隆華, 邱彬, 陳國南 申請人:福州大學