酶檢測裝置的製作方法

2023-04-26 19:27:51 3

專利名稱：酶檢測裝置的製作方法
酶檢測裝置 本發明涉及酶檢測裝置，更具體來說，涉及用於檢測能夠修飾所提供的底物的酶
的酶檢測裝置，該底物在其修飾或未修飾狀態下可以被特異性結合分子識別。本發明還涉 及能夠修飾底物的酶的檢測方法。 在許多臨床和研究情況下，能夠檢測樣品中具有特定催化活性的酶的存在，是有 用的。這種酶的一個例子是蛋白酶，它通過水解和切割肽鍵來消化蛋白。因此，被蛋白酶降 解的蛋白被切成兩個或多個更小的肽。另一個例子是唾液酸酶，它從較大的糖上切下唾液
酸基團。 在US2006/0003394中公開了在樣品中檢測酶的診斷測試試劑盒。試劑盒含有"反 應複合物"，它們各含有與報告物和特異性結合元件相連的靶配體。靶配體可以被待檢測的 酶切開，以釋放出報告物。隨後將反應複合物與樣品的混合物施加到層析介質上。層析介 質含有能夠捕獲靶配體上的特異性結合元件的第一個檢測區，以及能夠結合報告物的第二 個檢測區。因此，在使用中，樣品與反應複合物的混合物被施加到層析介質上，首先流過第 一個檢測區，然後流過第二個檢測區。靶配體在第一個檢測區處被捕獲。樣品中的任何酶 將報告物從靶配體上切下，切下的報告物被捕獲在第二個檢測區處，在第一個檢測區留下 任何未被切下的報告物仍連接在靶配體上。因此，樣品中酶的存在，通過在第二個檢測區處 存在報告物(或第一個檢測區不存在報告物)來確定。 在US2006/0003394中公開的試劑盒的一個問題是試劑盒可能傾向於給出不準確 的結果，這是因為當混合物沿著層析介質流過時，酶一直是有活性的。當反應複合物固定化 在第一個檢測區時，酶不斷從靶配體上切下報告物。因此，第一個檢測區和第二個檢測區處 的信號可傾向於隨著時間而變化，反應沒有明確的終點。 US2006/0003394的試劑盒的另一個問題是，它只能檢測切開耙配體的酶，而不能
檢測具有其他效應、例如向靶配體添加基團(例如磷酸化或糖基化作用)的酶。 US2006/0003394的試劑盒的另一個問題是，它不能檢測必須水解耙配體的末端的
酶，例如外切肽酶或外切糖酶的活性，因為需要在末端連接報告物，這將改變末端的化學性
質，其程度可能阻止與酶的活性位點的相互作用。 本發明力圖緩解上述一種或多種問題。 根據本發明的一個方面，提供了用於檢測樣品中能夠修飾所提供底物的酶的存在 的酶檢測裝置，包含 (i)含有修飾區的底物，所述修飾區對從未修飾狀態轉變為修飾狀態的酶修飾敏 感，； (ii)底物識別分子，它能夠與修飾或未修飾狀態的修飾區特異性結合，底物識別 分子的結合位點使得底物識別分子和酶在混合時競爭與修飾區的結合；以及
(iii)可以與底物識別分子偶聯的可檢測標記物。 根據本發明的另一方面，提供了用於檢測樣品中能夠修飾所提供底物的酶的存在 的酶檢測裝置，包含 (i)含有修飾區的底物，所述修飾區對從未修飾狀態轉變為修飾狀態的酶修飾敏感，； (ii)底物識別分子，它能夠與未修飾狀態的修飾區特異性結合，底物識別分子的 結合位點使得當混合時，與酶相比，底物的修飾區傾向於(或競爭性地)被所述底物識別分 子結合；以及 (iii)可以與底物識別分子偶聯的可檢測標記物。 有利情況下，底物識別分子對底物的親和性包含相對低的解離速率(kd)。 優選情況下，底物識別分子對底物的親和性包含相對低的解離速率(kd)和相對高
的結合速率GO 。 優選情況下，底物識別分子的解離速率(kd)在10—4. s—1到10—7. s—1之間，更優選在 10—5. s—1到lO—6. s—'之間。 優選情況下，底物識別分子的結合速率(ka)在105. s—1到109. s—1之間，更優選在 107. s—1到108. s—'之間。 有利情況下，底物識別分子與酶相比，具有對底物較低的解離速率(kd)和較高的 結合速率(ka)。 方便的是，底物還含有連接區域，酶檢測裝置還含有固相支持物，連接區域可以連 接到固相支持物上。 優選情況下，酶檢測裝置還含有層析介質。 有利情況下，底物還含有可以與層析介質相連的連接區域。 方便的是，層析介質含有固定化在層析介質上或其中並能夠與底物的連接區域結 合的第一種捕獲識別分子。 優選情況下，層析介質還含有固定化在層析介質上或其中，並且能夠與底物識別 分子以及可選的底物的片段結合的第二種捕獲識別分子。 有利情況下，第一種捕獲識別分子與連接區域和/或第二種捕獲識別分子與底物 識別分子各為結合對的兩半，其中結合對是抗原與抗體或其特異性抗原結合片段；生物 素與親和素、鏈親和素、中性鏈親和素或c即tavidin ;蛋白A與蛋白G ;糖與凝集素；兩個互 補的核苷酸序列；效應子與受體分子；激素與激素結合蛋白；酶的輔因子與酶；酶的抑制劑 與酶；纖維素結合結構域與纖維素纖維；固定化的氨基苯硼酸與帶有順式二元醇的分子； 木葡聚糖與纖維素纖維及其類似物、衍生物和片段。 方便的是，底物識別分子是能夠與修飾或未修飾狀態下的修飾區結合的抗體或其 抗原結合片段，凝集素，核苷酸序列，受體分子，或激素結合蛋白。 或者，底物識別分子是能夠結合未修飾生物素的親和素、鏈親和素、中性鏈親和素 或c即tavidin。 優選情況下，酶是水解酶，優選為肽酶、脂肪酶、核酸酶、糖酶、磷酸酯酶、硫酸酯 酶、神經氨酸酶、酯酶、DNA酶或RNA酶。 或者，酶是激酶、糖基轉移酶、氧化酶、還原酶或轉氨酶。 有利情況下，酶檢測裝置還含有與底物識別分子相連的可檢測標記物。 方便的是，可檢測標記物與底物識別分子共價連接。 優選情況下，標記物是螢光團、金顆粒、生色團、發光化合物；放射活性化合物；可 見化合物，脂質體或其他含有信號產生物質的囊泡，電活性物質，或酶與其底物的組合。
有利情況下，酶檢測裝置包含第一和第二種底物，它們各含修飾區，第一種底物的
修飾區對第一種酶的修飾敏感，第二種底物的修飾區對第二種酶的修飾敏感。 根據本發明的另一方面，提供了能夠修飾底物的酶的檢測方法，包括下列步驟 (i)提供含有修飾區的底物，該修飾區對從未修飾狀態轉變為修飾狀態的酶修飾
敏感，； (ii)提供懷疑含有酶的樣品； (iii)提供與未修飾狀態或修飾狀態下的修飾區特異性結合的底物識別分子，底
物識別分子的結合位點使得底物識別分子和酶在混合時競爭與修飾區的結合； (iv)將樣品與底物混合，使得至少一些樣品中的酶修飾底物；以及 (v)使底物與底物識別分子相接觸，並檢測底物與底物識別分子之間的相互作用。 根據本發明的另一方面，提供了能夠修飾底物的酶的檢測方法，包括下列步驟 (i)提供含有修飾區的底物，該修飾區對從未修飾狀態轉變為修飾狀態的酶修飾
敏感，； (ii)提供懷疑含有酶的樣品； (iii)提供與未修飾狀態下的修飾區特異性結合的底物識別分子，底物識別分子 的結合位點，使得當混合時，與酶相比，底物的修飾區傾向於(或競爭性地)被所述底物識 別分子結合； (iv)將樣品與底物混合，使得至少一些樣品中的酶修飾底物；以及 (v)使底物與底物識別分子相接觸，並檢測底物與底物識別分子之間的相互作用。 有利情況下，底物識別分子對底物的親和性包含相對低的解離速率(kd)。 優選情況下，底物識別分子對底物的親和性包含相對低的解離速率(kd)和相對高
的結合速率GO 。 優選情況下，底物識別分子的解離速率(kd)在10—4. s—1到10—7. s—1之間，更優選在 10—5. s—1到lO—6. s—'之間。 優選情況下，底物識別分子的結合速率(ka)在105. s—1到109. s—1之間，更優選在 107. s—1到108. s—'之間。 有利情況下，底物識別分子與酶相比，具有對底物較低的解離速率(kd)和較高的 結合速率(ka)。 方便的是，底物還含有連接區域，其中步驟(i)還包含提供固相支持物以及將底 物的連接區域連接到固相支持物上的步驟。 優選情況下，步驟(i)包含在固相支持物上提供能夠與連接區域結合的第一種捕 獲識別分子。 有利的是，(v)還包括將底物和底物識別分子沉積在層析介質上或其中。 方便的是，層析介質含有固定化在層析介質上或其中的第一種捕獲識別分子，底
物還包含連接區域，第一種捕獲識別分子能夠結合連接區域，方法還包括檢測底物識別分
子在第一種捕獲識別分子上的固定化的步驟。 優選情況下，層析介質還含有固定化在層析介質上或其中的第二種捕獲識別分 子，第二種捕獲識別分子能夠結合底物識別分子以及可選的與底物的片段組合，其中方法 還包括檢測底物識別分子在第二種捕獲識別分子上的存在的步驟。
7
有利情況下，第一種捕獲識別分子與連接區域和/或第二種捕獲識別分子與底物 識別分子是結合對的兩半，其中結合對是抗原與抗體或其抗原結合片段；生物素與親和素、 鏈親和素、中性鏈親和素或c即tavidin;免疫球蛋白(或其適合的結構域)與蛋白A和G; 糖與凝集素；兩個互補的核苷酸序列；效應子與受體分子；激素與激素結合蛋白；酶的輔因 子與酶；酶的抑制劑與酶；纖維素結合結構域與纖維素纖維；固定化的氨基苯硼酸與帶有 順式二元醇的分子；或木葡聚糖與纖維素纖維及其類似物、衍生物和片段。
方便的是，底物識別分子是能夠與修飾或未修飾狀態下的修飾區結合的抗體或其 抗原結合片段，凝集素，核苷酸序列，受體分子，或激素結合蛋白。 或者，底物識別分子是能夠結合未修飾生物素的親和素、鏈親和素、中性鏈親和素 或c即tavidin。 優選情況下，酶是水解酶，優選為肽酶、脂肪酶、核酸酶、同寡糖酶或異寡糖酶、同 多糖酶或異多糖酶、糖酶、磷酸酯酶、硫酸酯酶、神經氨酸酶、酯酶、DNA酶或RNA酶。
或者，酶是激酶、糖基轉移酶、氧化酶、還原酶或轉氨酶。 有利情況下，方法還包含提供與底物識別分子相連的標記物的步驟，並且其中步 驟(v)包含檢測標記物的存在。 方便的是，標記物與底物識別分子共價連接。
優選情況下，標記物是螢光團、金顆粒、生色團、發光化合物；放射活性化合物；可 見化合物，脂質體或其他含有信號產生物質的囊泡，電活性物質；或酶與其底物的組合。
有利情況下，步驟(i)包含第一和第二種底物，它們各含修飾區，第一種底物的修 飾區對第一種酶敏感，第二種底物的修飾區對第二種酶的修飾敏感，並且其中步驟(v)包 含檢測第一和第二種底物與底物識別分子之間的相互作用。 方便的是，步驟(iii)包含提供第一和第二種底物識別分子，它們各自分別與修 飾或未修飾狀態下的第一和第二種底物的修飾區特異性結合，第一和第二種底物識別分子 的結合位點，使得與第一種酶相比，第一種底物的修飾區傾向於(或競爭性地)被所述第一 種底物識別分子結合，與第二種酶相比，第二種底物的修飾區傾向於(或競爭性地)被所述 第二種底物識別分子結合，並且其中步驟(v)包含檢測第一和第二種底物與第一和第二種 底物識別分子之間的相互作用。 因此，本發明提供了用於檢測樣品中能夠修飾所提供的底物的酶的存在的酶檢測 裝置，該底物具有對從未修飾狀態轉變成修飾狀態的酶的修飾敏感的修飾區。裝置將酶活 性轉換成親和結合分析，其中酶活性的存在被表示成結合的標記物，例如信號線的相對強 度。在本方法中，未修飾的底物被結合未修飾狀態下底物的修飾區的底物識別分子檢測和 結合。在使用中，當混合時，與酶分子相比，底物傾向於(或競爭性地)被底物識別分子結 合。這是因為與酶相比，底物識別分子具有較低的解離速率(kd)。典型情況下，酶具有高的 解離速率(kd)，使得產物快速離開酶的活性位點，以便獲得高的周轉。底物識別分子也對底 物具有高的結合速率GO，進一步使它與底物的結合優選於酶與底物的結合。這樣的解離 和結合速率使用例如Biacore技術進行測量。測量到的底物識別分子對酶的親和性高於酶 對底物的親和性，即在存在底物識別分子和酶二者的情況下，混合物中存在的底物的量沒 有可注意到的減少。裝置還包含了與底物識別分子偶聯的可檢測標記物。
本發明的底物識別分子封閉(sequester)底物的可修飾區，在這樣做時，它阻止
8了酶對底物的進一步修飾。這種特徵可以有利地用於終點分析中(參考動力學分析)。它 能使分析過程受到緊密控制，因為在預定的時間段後，酶的催化活性可以被精確地終止。這 防止了底物轉化活性的可變和不受控制的繼續進行，即通過底物識別分子對底物修飾區的 封閉精確地控制和限定分析的終點。 為了可以更充分地理解本發明以便進一步認識到其特點，現在將通過例子並參考 隨附的圖對本發明的實施方案進行描述，在圖中

圖1是根據本發明的一個實施方案的酶檢測裝置的一個部件的示意圖；
圖2是根據本發明的實施方案的酶檢測裝置的另一個部件的作用圖；
圖3是根據本發明的一個實施方案的酶檢測裝置的另一個部件的示意圖；
圖4是根據本發明的一個實施方案的酶檢測裝置在使用中的示意圖；以及
圖5是根據本發明的一個實施方案的酶檢測裝置在使用中的示意圖。
參考圖l，顯示了用於檢測被分析物酶的酶檢測裝置1的一些部件的橫截面示意 圖。酶檢測裝置1含有硝酸纖維素試驗片條2，它形成了層析介質。試驗片條2具有上遊和 下遊末端3、4。靠近試驗片條2的上遊末端3，提供了含有吸附墊片的樣品接收區5。進一 步朝向試驗片條2的下遊末端4，提供了固定化在試驗片條2表面上的大量第一種捕獲識別 分子6。第一種捕獲識別分子形成了第一個檢測區7。從第一個檢測區7進一步朝向試驗 片條2的下遊末端4，提供了固定化在試驗片條2表面上的大量第二種捕獲識別分子8。第 二種捕獲識別分子8形成了第二個檢測區9。 現在參考圖2，將描述酶檢測裝置的另一個部件，即底物10。底物10含有與第二個 區12相連的不可修飾的配體11。不可修飾的配體11能夠被第一個檢測區7的第一種捕獲 識別分子6識別和捕獲。也就是說，不可修飾的配體11形成了結合對的一半，結合對的另 一半是一個第一種捕獲識別分子6。第二個區12含有第二種配體(被稱為"修飾區")14， 它通過任選的惰性核心(連接)結構13與不可修飾的配體11連接。第二種配體14可以 被被分析物酶修飾。如圖2中所示，被分析物酶是蛋白酶，通過切割結構的一部分釋放出片 段15來修飾第二種配體14。但是，在其他實施方案中，酶對修飾區14(即第二種配體)進 行了不同的修飾，例如添加磷酸鹽(酯)基團。其他的示例性修飾包括將糖基從供體分子 轉移到接受位點的糖基轉移酶，氧化靶位點的氧化酶，還原靶位點的還原酶，以及在胺基酸 和酮酸之間轉移氨基的轉氨酶。 參考圖3，現在將描述酶檢測的另一種部件。結合元件16含有能夠與底物10的修 飾區14特異性結合的底物識別分子17。此外，底物識別分子17在被檢測的酶結合和修飾 的區域(修飾區14)處與底物10結合。也就是說，如果將酶和底物識別分子與修飾區14 混合，與酶相比，底物的修飾區14傾向於(或競爭性地)被底物識別分子17結合。此外， 底物識別分子17與酶相比，對修飾區14具有更高的結合親和性。因此，在修飾區14被底 物識別分子17結合後，酶不能與修飾區14結合，因此不能催化修飾區14的修飾。
與底物識別分子17偶聯的是可檢測標記物或報告分子18，它是例如螢光團。
現在將參考圖4描述符合本實施方案的酶檢測裝置1的使用。在本實施例中，提 供了不含酶的樣品。在能夠允許樣品中的任何酶修飾修飾區14的條件下，將樣品與底物10 混合。正如前面陳述的，在該具體的例子中，樣品不含酶，因此不發生修飾區14的修飾。然 後將樣品與底物10的混合物與結合元件16，在允許結合元件16結合底物10的條件下相接觸。然後將樣品、底物10和結合元件16的混合物，沉積在試驗片條2上的樣品接收區5。 由於試驗片條2的層析性質，混合物沿著從試驗片條2的上遊末端3向試驗片條2的下遊 末端4的液體流動路徑，沿著和/或通過試驗片條2流動；也就是說以箭頭19的方向。
混合物與第一個檢測區7相接觸，每個底物10的不可修飾的配體11與第一個檢 測區7的捕獲識別分子6結合。因此，底物10被固定化在第一個檢測區7上。此外，因為 結合元件16與底物10結合，因此結合元件16也被固定化在第一個檢測區7上。儘管混合 物的其他成分繼續以箭頭19的方向沿著試驗片條2流動，只有很少或沒有結合元件16結 合到第二個檢測區9上。因此，樣品中不存在酶，由第一個檢測區7處存在報告分子18和 第二個檢測區9不存在報告分子18所指示。 現在參考圖5，將描述符合本發明的本實施方案的酶檢測裝置l，用於檢測樣品中 酶的存在。將底物10與樣品在使酶能夠修飾底物10的修飾區14的條件下進行混合。在 本實施方案中，酶切開修飾區IO，釋放出片段15。在預定的時間段後，將底物IO和酶的混 合物與結合元件16，在使結合元件16結合任何未修飾的修飾區14的條件下進行接觸。在 這樣做時，結合元件16阻斷了酶接近修飾區14，使酶的催化活性終結。更具體來說，在本實 施方案中，底物10停止被酶切開。 然後將混合物20沉積在樣品接收區5上，沿著或通過試驗片條2以箭頭19的方向 流動。樣品20首先與第一個檢測區7接觸，在那裡，每個底物10的不可修飾的配體11與 第一種捕獲識別分子結合。因此修飾和未修飾的底物10固定化在第一個檢測區7處。此 外，結合元件16不能結合底物10，因為修飾區15已被切開，失去了片段15。結合元件16 對於未修飾的(在本實施方案中也就是說"完整的")修飾區特異，不能結合不完整的配體 14。因此，剩餘的樣品20繼續沿著試驗片條2以箭頭19的方向流動，直到它與第二個檢測 區9接觸，在那裡底物識別分子16被第二種捕獲識別分子8結合併固定化。因此，結合元 件16、包括報告分子18，被固定化在第二個檢測區9處。因此，樣品中酶的存在，由固定化 在第二個檢測區9處的報告分子18的存在和第一個檢測區7中報告分子18的不存在所指 示。 應該認識到，對於本發明來說，對修飾區14的修飾不必需是將其切開。例如，在某 些其他實施方案中，待檢測的酶通過向修飾區14添加基團來修飾修飾區14。樣品中酶的存 在仍然導致結合元件16固定化在第二個檢測區9而不是第一個檢測區7處，區別是沒有釋 放出片段15。相反，底物10保持完整，但是結合元件16不能與修飾狀態下的修飾區結合， 因此在第一個檢測區7上流過，到達第二個檢測區9，它在那裡被結合。
此外，本文還公開了裝置和方法，其中結合元件16對修飾狀態下的修飾區特異。 例如，在酶通過添加基團對修飾區14進行修飾的實施方案中，結合元件16當基團存在而不 是當基團不存在時與修飾區14結合。因此，如果樣品不含酶，結合元件16固定化在第二個 檢測區9處，而如果樣品中存在酶，結合元件16固定化在第一個檢測區7處。因此，樣品中 酶的存在，由固定化在第一個檢測區7處的報告分子18的存在和第二個檢測區9不存在報 告分子18所指示。 在某些實施方案中，評估第一和第二個檢測區7、9處報告分子18的相對濃度，以 指示樣品中酶的相對濃度。例如，在報告分子18是可視標記物例如金顆粒的實施方案中， 對第一和第二個檢測區7、9之間標記物的相對強度進行了比較。
在本發明的實施方案中，待檢測的酶可以是水解酶。例如，酶可以是蛋白酶、肽酶、 脂肪酶、核酸酶、同寡糖酶或異寡糖酶、同多糖酶或異多糖酶、糖酶、磷酸酯酶、硫酸酯酶、神 經氨酸酶(例如唾液酸酶)、酯酶、DNA酶或RNA酶。在其他實施方案中，酶以將修飾區切開 之外的方式對修飾區進行修飾。例如，酶可以是激酶、糖基轉移酶、還原酶或轉氨酶。
當然，修飾區14必須適合於待檢測的酶。也就是說，如果酶是蛋白酶，那麼修飾區 14必須是酶切開的肽。作為另一個例子，如果酶是唾液酸酶，那麼修飾區14可以包含唾液 酸化路易斯抗原。其他修飾區包括核酸、糖類、脂類、酯和糖蛋白。在酶是糖基轉移酶的情 況下，糖基團從供體分子轉移到接受位點。當酶是氧化酶時，耙位點被氧化(例如葡萄糖被 氧化成葡萄糖酸)。如果酶是還原酶，它還原靶位點(例如醌還原酶將醌還原成苯酚)。轉 氨酶在胺基酸和酮酸之間轉移氨基。 捕獲識別分子6和不可修飾的配體11可以是特異性結合對的任何適合成分。例 如，它們可以是抗原與抗體或其抗原結合片段；生物素與親和素、鏈親和素、中性鏈親和 素或c即tavidin;免疫球蛋白(或其適合的結構域)與蛋白A和G;糖與凝集素；兩個互補 的核苷酸序列；效應子與受體分子；激素與激素結合蛋白；酶的輔因子與酶；酶的抑制劑與 酶；纖維素結合結構域與纖維素纖維；固定化的氨基苯硼酸與帶有順式二元醇的分子；木
葡聚糖與纖維素纖維及其類似物、衍生物和其片段。 特別優選情況下，不可修飾的配體11是生物素基團，第一種捕獲識別分子是固定 化在試驗片條2表面上的鏈親和素基團。 底物識別分子17優選是特異性針對修飾區14的抗體或其抗原結合片段。這樣的 抗體被產生成使它們的結合分析性能，即kd和ka適合於所需分析方法，例如具有高的結合 速率和低的解離速率。這通過本技術領域的專業人員熟悉的免疫技術來獲得。高親和性抗 體通過向動物重複地施用降低濃度的抗原來產生。典型情況下，山羊和綿羊被用於產生高 親和力抗體。 在其他實施方案中，底物識別分子17是能夠與修飾或未修飾狀態下的修飾區結 合的凝集素、核苷酸序列、受體分子或激素結合蛋白。或者，可以使用任何上述的特異性 結合分子對，只要底物識別分子17所識別的適合的靶配體可以摻入到底物10中，並仍然 被被分析物酶修飾，導致底物識別分子17與修飾區14相互作用的能力發生變化。例如， 在修飾區含有生物素的實施方案中，底物識別分子可以是能夠結合未修飾的生物素，但是 不能結合已經被待檢測的酶的作用修飾過的生物素的親和素、鏈親和素、中性鏈親和素或 c即tavidin。特別優選情況下，底物識別分子17是綿羊抗體，第二種捕獲識別分子8是抗 綿羊抗體。 在本發明的某些實施方案中，結合元件16在試驗片條2的結構中，在樣品接收區5 中或在樣品接收區5和第一個檢測區7之間被乾燥。在這些實施方案中，樣品與底物10在 允許酶修飾底物10的修飾區14的條件下進行混合。然後將混合物施加到樣品接收區5，與 試驗片條2表面上的結合元件16相接觸。也就是說，在將樣品沉積到試驗片條2上之前， 樣品與結合元件16沒有混合。 在某些實施方案中，在試驗片條2上樣品接收區5的下遊提供了可溶性阻擋層。 樣品和底物的混合物在一段預定的時間內不能透過可溶性阻擋層，隨後阻擋層被突破，混 合物繼續沿著試驗片條流動。特別優選情況下，該特徵與結合元件16在試驗片條2上可溶
11性阻擋層的緊下遊處乾燥的特徵相結合。在這樣的實施方案中，在混合物溶解可溶性阻擋 層，並與結合修飾區14的結合元件16相接觸，阻止酶在修飾區14處催化任何進一步反應 之前，樣品和底物被提供有足夠的時間以進行混合和使任何酶修飾修飾區14。然後按照上 面的描述操作試驗片條2。可溶性阻擋層可以由例如PVA、特別是低分子量(麗)PVA，或冷水 可溶性明膠製成。 任何實施方案中的報告分子18可以是任何能夠直接或間接產生可檢測信號的物 質。適合的報告分子是生色團，發光化合物(例如螢光或磷光)；放射活性化合物；可見化合 物(例如乳膠或金屬顆粒例如金)，脂質體或其他含有信號產生物質的囊泡；電活性物質； 或酶與其底物的組合。優選的報告分子是金顆粒，它們積累起來，在第一和/或第二個檢測 區7、9處形成了肉眼可見的區(參見圖l)。還應該認識到，在本發明的某些實施方案中，底 物識別分子17不是永久地與報告分子18偶聯，而是可以通過如上所述的特異性結合對與 它偶聯。 在某些實施方案中，酶檢測裝置1包含兩種不同的底物IO，各具有對不同酶的修 飾敏感的修飾區14。在某些實施方案中，兩種底物IO是相同的，使得無論樣品中存在哪種 酶，試驗片條2都提供同樣的信號。在其他實施方案中，提供了第一和第二種結合元件16， 各自對一種底物10而不對另一種底物10的修飾區14特異。與一種酶相比，一種底物的修 飾區14傾向於(或競爭性地)被第一種結合元件16結合，而與另一種酶相比，另一種底物 的修飾區14傾向於(或競爭性地)被第二種結合元件16結合。此外，第一種結合元件16 的報告分子18提供了與第二種結合元件16的報告分子18不同的信號。因此，每種酶的存 在可以通過任何一種信號的存在來區分。在其他實施方案中，提供了第一和第二種結合元 件，它們與前述實施方案相同，只是兩種結合元件都帶有相同的報告分子18，並且第二個檢 測區還補充有第三個檢測區。第二和第三個檢測區分別具有第二和第三種捕獲識別分子。 第二和第三種捕獲識別分子分別對第一和第二種結合元件特異。因此，任何一種酶的存在 可以通過在第二或第三個捕獲區處存在或不存在報告分子18來區分。
在提供了第一和第二種結合元件16的實施方案的某些變體中，酶檢測裝置1含有 單一樣品接收區5，它與第一和第二個試驗片條(例如彼此平行地排列或從樣品接收區5向 外輻射排列)流體連通。第一個試驗片條具有結合第一種底物的第一個檢測區7和結合特 異性針對第一種底物的結合元件16的第二個檢測區9。類似地，第二個試驗片條具有結合 第二種底物的第一個檢測區7和結合特異性針對第二種底物的結合元件16的第二個檢測 區9。通過這種方式，第一和第二個試驗片條分別提供了表明樣品中存在或不存在第一和第 二種酶的結果。 在上面描述的具體實施方案中，裝置含有試驗片條2方式的層析介質。但是，在可 選實施方案中，沒有提供層析介質。例如，在一個實施方案中，第一種捕獲識別分子6被固 定化在固相支持物例如柱子或珠子上。按照前面描述的實施方案，將樣品與底物io混合， 然後與結合元件16混合。然後將樣品、底物10和結合元件16的混合物在支持物上洗過，使 特異性結合元件11與捕獲識別分子6結合。然後洗掉任何未結合的材料，或允許其排掉。 如果樣品中存在酶，那麼修飾區14被切開，結合元件16不能結合底物10，因此報告分子18 沒有固定化在固相支持物上。因此，樣品中酶的存在，由固相支持物上不存在報告分子所指 示。如果樣品中不存在酶，那麼結合元件16結合底物10，因此將報告分子18固定化在固相支持物上。因此，樣品中不存在酶，由存在固定化在固相支持物上的報告分子18所指示。 在某些實施方案中，這種類型的步驟在96孔微量滴定板中，以本技術領域的專業
人員公知的方式進行。或者，步驟可以在機器人系統中，使用各種不同的固相捕獲材料，或
使用微陣列系統來進行。 實施例1 試劑盒含有下列部件 1)用於收集樣品流體(例如從傷口 )的帶杆拭子。 2)安裝在塑料盒中的側向流試驗片條。試驗片條具有第一個檢測區，它含有作為 橫過試驗片條流通路徑的第一條測試線吸附的鏈親和素，以及第二個檢測區，它含有作為 橫過試驗片條流通路徑的第二條測試線吸附的抗綿羊抗體，所述第二條測試線位於第一條 測試線的下遊。在塑料盒中有觀察窗，通過它可以看見第一和第二條測試線。在第一條測 試線上遊還存在整合的樣品接收墊片。此外，試驗片條具有帶有綿羊抗體(底物識別分子) 的金顆粒，它們乾燥成樣品接收墊片與第一條測試線之間的試驗片條，或乾燥成樣品接收 墊片本身。 3)試管，其中可以將拭子與樣品提取緩衝液和底物放置在一起。試管被製造成具 有帶翻蓋的出口 ，當樣品/提取流體/底物混合物準備好分發到試驗片條上時，它可以被就 地扣上。樣品可以從倒置的試管通過出口逐滴施加。 4)提取流體，由pH 7. 2的磷酸緩衝鹽水(PBS)和0. 1%吐溫20 (Tween 20)組 成。 5)底物(可以預先溶解在提取流體中)。底物由含有匪P-9偏好的胺基酸序列的
肽組成。序列(G)PQGIFG(Q)是特別適合的，但許多其他序列也是可用的，它們可以源自於
科學文獻。底物帶有末端生物素基團，通過聚乙二醇連接物/連接序列相連。肽被連接有
金顆粒的綿羊抗體識別。 試劑盒的使用步驟如下 第一步利用試劑盒提供的拭子收集流體樣品(測試樣品)。將帶有流體樣品的 拭子放置在含有提取緩衝液和確定量底物(底物的準確量是重要的，因為它必須是有限的 量，當測試樣品中不存在酶時，剛剛能夠飽和第一條線)的試管中。將拭子在提取流體中劇 烈轉動以釋放出流體樣品，使它能夠與配體混合。將該反應混合物在環境溫度下溫育預定
長度的時間(例如io分鐘)。 第二步在溫育期結束時，將拭子取出或者將杆折斷，將出口蓋放置在頂部。然後 將試管倒置並擠壓，使4滴液體滴在樣品接收墊片上。當液體遷移到試驗片條中時，它與連 接金顆粒的乾燥的綿羊抗體接觸。它們被測試樣品重新水合，因此綿羊抗體與任何未修飾 的底物結合。當液體和金顆粒移動通過側向流試驗片條時，它們遇到第一條線，在那裡生物 素(在底物上)被識別和捕獲。任何與完整底物結合的金顆粒通過底物的末端生物素被捕 獲在該第一條線上。那些沒有與底物結合或與切開的底物結合的金顆粒通過，被捕獲在第 二條(抗綿羊抗體)線處。 用戶觀察已經形成的線，並評估它們的相對強度。不存在第一條線和存在完全強 度的第二條線，表明測試樣品中存在高水平的蛋白酶。相反的結果表明零或低於可檢測極 限的低蛋白酶水平。在這些極端之間的階段表示測試樣品中不同的蛋白酶水平。在某些實施方案中，結果通過光-電子片條讀取器讀數，讀數通過簡單的算法自動解釋，將簡單的結 果呈遞給用戶。 在本實施例的變體中，金顆粒(帶有綿羊抗體)在溫育期結束時添加到反應混合 物中，而不是將它們整合在試驗片條中。
權利要求
用於檢測樣品中能夠修飾所提供底物的酶的存在的酶檢測裝置，包含(i)含有修飾區的底物，所述修飾區對從未修飾狀態轉變為修飾狀態的酶修飾敏感；(ii)底物識別分子，其能夠與未修飾狀態的修飾區特異性結合，底物識別分子的結合位點，使得當混合時，與酶相比，底物的修飾區傾向於被所述底物識別分子結合；以及(iii)能與底物識別分子偶聯的可檢測標記物。
2. 權利要求l的酶檢測裝置，其中底物識別分子對底物的親和性包含相對低的解離速率。
3. 權利要求l的酶檢測裝置，其中底物識別分子對底物的親和性包含相對低的解離速 率和相對高的結合速率。
4. 權利要求l的酶檢測裝置，其中底物識別分子與酶相比，具有對底物較低的解離速 率和較高的結合速率。
5. 權利要求1的酶檢測裝置，其中底物還含有連接區域，酶檢測裝置還含有固相支持 物，連接區域能連接到固相支持物上。
6. 權利要求1的酶檢測裝置，還包含層析介質。
7. 權利要求6的酶檢測裝置，其中底物還含有能連接至層析介質的連接區域。
8. 權利要求7的酶檢測裝置，其中層析介質含有固定化在層析介質上或其中並能夠與 底物的連接區域結合的第一種捕獲識別分子。
9. 權利要求8的酶檢測裝置，其中層析介質還含有固定化在層析介質上或其中，並能 夠任選的與底物的片段組合與底物識別分子結合的第二種捕獲識別分子。
10. 權利要求8或9的酶檢測裝置，其中第一種捕獲識別分子與連接區域和/或第二種 捕獲識別分子與底物識別分子各為結合對的兩半，其中結合對是抗原與抗體或其特異性 抗原結合片段；生物素與親和素、鏈親和素、中性鏈親和素或c即tavidin ;蛋白A與蛋白G ; 糖與凝集素；兩個互補的核苷酸序列；效應子與受體分子；激素與激素結合蛋白；酶的輔因 子與酶；酶的抑制劑與酶；纖維素結合結構域與纖維素纖維；固定化的氨基苯硼酸與帶有 順式二元醇的分子；木葡聚糖與纖維素纖維及其類似物、衍生物和片段。
11. 前述權利要求任一項的酶檢測裝置，其中底物識別分子是能夠與修飾或未修飾狀 態下的修飾區結合的抗體或其抗原結合片段，凝集素，核苷酸序列，受體分子，或激素結合 蛋白。
12. 權利要求1到10任一項的酶檢測裝置，其中底物識別分子是能夠結合未修飾生物 素的親和素、鏈親和素、中性鏈親和素或c即tavidin。
13. 前述權利要求任一項的酶檢測裝置，其中酶是水解酶，優選為肽酶、脂肪酶、核酸 酶、糖酶、磷酸酯酶、硫酸酯酶、神經氨酸酶、酯酶、DNA酶或RNA酶。
14. 權利要求1到12任一項的酶檢測裝置，其中酶是激酶、糖基轉移酶、氧化酶、還原酶 或轉氨酶。
15. 前述權利要求任一項的酶檢測裝置，還含有與底物識別分子連接的可檢測標記物。
16. 權利要求15的酶檢測裝置，其中可檢測標記物與底物識別分子共價結合。
17. 權利要求15或16的酶檢測裝置，其中標記物是螢光團、金顆粒、生色團、發光化合 物；放射活性化合物；可見化合物，脂質體或其他含有信號產生物質的囊泡，電活性物質， 或酶與其底物的組合。
18. 前述權利要求任一項的酶檢測裝置，包含第一和第二種底物，它們各含修飾區，第 一種底物的修飾區對第一種酶的修飾敏感，第二種底物的修飾區對第二種酶的修飾敏感。
19. 能夠修飾底物的酶的檢測方法，包括下列步驟(i) 提供含有修飾區的底物，該修飾區對從未修飾狀態轉變為修飾狀態的酶修飾敏感；(ii) 提供懷疑含有酶的樣品；(iii) 提供與未修飾狀態下的修飾區特異性結合的底物識別分子，底物識別分子的結 合位點，使得當混合時，與酶相比，底物的修飾區傾向於被所述底物識別分子結合；(iv) 將樣品與底物混合，使得樣品中的至少一些酶修飾底物；以及(v) 使底物與底物識別分子相接觸，並檢測底物與底物識別分子之間的相互作用。
20. 權利要求19的方法，其中底物識別分子對底物的親和性包含相對低的解離速率。
21. 權利要求19的方法，其中底物識別分子對底物的親和性包含相對低的解離速率和 相對高的結合速率。
22. 權利要求19的方法，其中底物識別分子與酶相比，具有對底物較低的解離速率和 較高的結合速率。
23. 權利要求19的方法，其中底物還含有連接區域，其中步驟(i)還包含提供固相支持 物以及將底物的連接區域連接到固相支持物上的步驟。
24. 權利要求23的方法，其中步驟(i)包含在固相支持物上提供能夠與連接區域結合 的第一種捕獲識別分子。
25. 權利要求19的方法，其中步驟(v)還包括將底物和底物識別分子沉積在層析介質 上或其中。
26. 權利要求25的方法，其中層析介質含有固定化在層析介質上或其中的第一種捕獲 識別分子，底物還包含連接區域，第一種捕獲識別分子能夠結合連接區域，該方法還包括檢 測底物識別分子在第一種捕獲識別分子上的固定化的步驟。
27. 權利要求26的方法，其中層析介質還含有固定化在層析介質上或其中的第二種捕 獲識別分子，第二種捕獲識別分子任選的與底物的片段組合能夠結合底物識別分子，其中 該方法還包括檢測底物識別分子在第二種捕獲識別分子上的存在的步驟。
28. 權利要求26或27的方法，其中第一種捕獲識別分子與連接區域和/或第二種捕獲 識別分子與底物識別分子是結合對的兩半，其中結合對是抗原與抗體或其抗原結合片段； 生物素與親和素、鏈親和素、中性鏈親和素或c即tavidin ;免疫球蛋白(或其適合的結構 域)與蛋白A和G ;糖與凝集素；兩個互補的核苷酸序列；效應子與受體分子；激素與激素結 合蛋白；酶的輔因子與酶；酶的抑制劑與酶；纖維素結合結構域與纖維素纖維；固定化的氨 基苯硼酸與帶有順式二元醇的分子；或木葡聚糖與纖維素纖維及其類似物、衍生物和片段。
29. 權利要求19到28任一項的方法，其中底物識別分子是能夠與修飾或未修飾狀態下 的修飾區結合的抗體或其抗原結合片段，凝集素，核苷酸序列，受體分子，或激素結合蛋白。
30. 權利要求19到28任一項的方法，其中底物識別分子是能夠結合未修飾生物素的親 和素、鏈親和素、中性鏈親和素或c即tavidin。
31. 權利要求19到30任一項的方法，其中酶是水解酶，優選為肽酶、脂肪酶、核酸酶、 同寡糖酶或異寡糖酶、同多糖酶或異多糖酶、糖酶、磷酸酯酶、硫酸酯酶、神經氨酸酶、酯酶、DNA酶或RNA酶。
32. 權利要求19到30任一項的方法，其中酶是激酶、糖基轉移酶、氧化酶、還原酶或轉 氨酶。
33. 權利要求19到32任一項的方法，還包含提供與底物識別分子連接的標記物的步 驟，並且其中步驟(v)包含檢測標記物的存在。
34. 權利要求33的方法，其中標記物與底物識別分子共價結合。
35. 權利要求33或32的方法，其中標記物是螢光團、金顆粒、生色團、發光化合物；放 射活性化合物；可見化合物，脂質體或其他含有信號產生物質的囊泡，電活性物質；或酶與 其底物的組合。
36. 權利要求19到35任一項的方法，其中步驟(i)包含提供第一和第二種底物，它們 各含修飾區，第一種底物的修飾區對第一種酶敏感，第二種底物的修飾區對第二種酶的修 飾敏感，並且其中步驟(v)包含檢測第一和第二種底物與底物識別分子之間的相互作用。
37. 權利要求36的方法，其中步驟(iii)包含提供第一和第二種底物識別分子，它們各 自分別與未修飾狀態下的第一和第二種底物的修飾區特異性結合，與第一種酶相比，第一 種底物的修飾區傾向於被所述第一種底物識別分子結合，與第二種酶相比，第二種底物的 修飾區傾向於被所述第二種底物識別分子結合，並且其中步驟(v)包含檢測第一和第二種 底物與第一和第二種底物識別分子之間的相互作用。
全文摘要
用於檢測樣品中能夠修飾所提供的底物(10)的酶的存在的酶檢測裝置(1)。裝置(1)包含具有修飾區(14)的底物，該修飾區對從未修飾狀態轉變為修飾狀態的酶修飾敏感。裝置(1)還包含與修飾或未修飾狀態下的修飾區(14)結合的底物識別分子(16)。當混合時，與酶相比，底物的修飾區(14)傾向於被底物識別分子(16)結合。裝置還包含與底物識別分子(17)偶聯的可檢測標記物(18)。
文檔編號G01N33/543GK101784671SQ200880104093
公開日2010年7月21日 申請日期2008年8月26日 優先權日2007年8月23日
發明者保羅·詹姆士·戴維斯 申請人:莫洛迪克有限公司