一種快速定量線蟲存活率的方法及試劑盒的製作方法

2023-04-26 09:14:56

專利名稱：一種快速定量線蟲存活率的方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種快速定量線蟲存活率的方法及試劑盒，該方法及試劑盒可在藥物篩選、農藥篩選、環境評價、水質評價等方面應用，屬於生物技術領域。
背景技術：
秀麗隱杆線蟲(C We^ms)是一種生長在土壤中的線蟲，以細菌為食，很容易在實驗室培養。成蟲體長1mm，且通體透明，在顯微鏡下易於觀察。L3 L4期對外界敏感。從一個受精卵發育成可以產卵的成蟲，它只需要3天。在自然狀態下，秀麗隱杆線蟲絕大部分個體為雌雄同體，其一生能產生約300個受精卵，如果在一個培養皿上放幾隻線蟲，幾天之後就可得到大量的後代(龐林海等，2007)。上述這些特點使得秀麗隱杆線蟲在很多方面都有應用(秦峰松和楊崇林，2006)。廈門大學柯翎等人(2004)以秀麗隱杆線蟲作為重金屬汙染的指示生物，研究了 Cu2+，Cd2+，Pb2+, Si2+等4種重金屬離子對秀麗隱杆線蟲的毒性，發現重金屬離子濃度越高， 毒性越強，線蟲死亡率越高。在高濃度組中線蟲的中毒反應較迅速，短期內就出現死亡；而在低濃度組，中毒反應較慢，經較長時間才出現死亡，對照組相對其他各組，存活時間最長。 北京師範大學的鄢雯等(2005)人將秀麗隱杆線蟲用於環境水質的監測，同樣發現秀麗隱杆線蟲存活率與水樣毒性之間存在緊密的關係，水樣毒性越大，線蟲死亡率越高，因此可用秀麗隱杆線蟲的存活率評價飲用水源水和水廠工藝水水樣毒性。王曉等人(2007)也將秀麗隱杆線蟲用於對造紙廠廢水中酸鹼類毒物的追蹤。實驗顯示，用秀麗隱杆線蟲指示重金屬危害、水樣毒性大小等既降低了實驗成本，又提高了檢測效率。萬樹青(1993)等人用秀麗隱杆線蟲的死亡率來評價棉酚，克線磷，甲基異柳磷，氧樂果，滅多威，硫酸銅等多種農藥的殺蟲效果。國外將秀麗隱杆線蟲用於體內驅蟲藥物藥效篩選的研究已有相關的文章發表 (tooula等，2007)，為驅蟲藥的體外研究提供了可行方法，並且呈現良好的選擇性、準確度及重複性，而且成本低廉。這些研究表明，線蟲死亡率的大小反應了供試藥物的藥效和毒性的大小。王擺(2006)以自由海洋線蟲aroaai/ori/^ sp.為模型動物，選擇水溶性的重金屬鎘離子和不溶於水的環境雌激素雙酚A，以線蟲的死亡率為指標，測試了兩種化學物質對 Chromadorina sp.的急性毒性。由此可見，線蟲可在藥物篩選、農藥篩選、環境評價、水質評價等方面應用。在以上諸多方面的應用中對線蟲死活的判斷是關鍵技術。在涉及線蟲死亡或存活進行判斷的現有技術中，萬樹青等(1993)人試圖通過染色方法來區分死活線蟲從而測定被測物殺線劑的活性，他們比較了中性紅，甲基藍，番紅花紅，曙紅等4種染料的染色效果，發現這4種染料都能使死線蟲著色，而活線蟲不著色，番紅花紅效果最好。但是這種方法仍然需要在顯微鏡下一一計數，工作量很大。國外學者用MTT法檢測了驅蟲藥物左旋咪唑對自由生活的幼體線蟲存活率的影響(Catherine等，2007 ；Smith等2009)，但此方法用MTT對線蟲染色的時間為3至對小時，且用DMSO溶出甲臢需要1小時，比較費時。而且，MTT價格昂貴，sigma公司產品Ig參考價格為1413. 36元，而同為sigma公司產品的TTC 5g參考價格為243元。美國專利(專利號為20060191023)公開了一種應用螢光染色劑法來鑑別死活線蟲的染色方法。這種方法已用於驅蟲藥物的篩選研究，由於染色後活的線蟲無螢光，而死亡的線蟲有螢光，利用測試螢光強度的大小來確定線蟲的死亡率，這樣為高通量篩選提供了保證，但此法需要螢光酶標儀，對設備要求很高，難以在普通實驗室和基層得以推廣和應用。中國專利(專利號為200710202068. 8)公開了一種應用中性紅染料來鑑別死活線蟲的染色方法。該方法可以使死線蟲著色，活線蟲不著色，但染色後需要裂解線蟲釋放染料後再測定染料的吸光值，步驟繁瑣，比較費時。通過對上述涉及線蟲死亡或存活進行判斷的現有技術分析可以看出，現有技術費時、費力、而且成本較高或需要昂貴的儀器設備，市場急需一種簡單易行、成本低廉、不需昂貴的儀器設備就能進行快速定量線蟲存活率的新方法，可以廣泛應用於新藥篩選、農藥篩選、環境評價及水質評價等領域。參考文獻
1.龐林海等，秀麗隱杆線蟲的培養與保存方法，浙江農業學報，2007，19(1):34 36.
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3.柯翎，4種重金屬離子對秀麗小杆線蟲急性毒性研究，廈門大學學報，2004，43(6) 133 135.
4.鄢雯等，線蟲存活率指標對水樣相對毒性的初步分析，北京師範大學學報，2005，41
(6)616 619.
5.王曉等，利用模式生物線蟲追蹤造紙廠廢水中酸鹼類毒物的研究，環境科學，2007， 28 (4) 876 880.
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9.Smith R. A. , L. Pontiggia, C. Waterman, M. Lichtenwalner, J. ffasserman, Comparison of motility, recovery, and methyl-thiazolyl- tetrazolium reduction assays for use in screening plant products for anthelmintic activity. Parasitol Res, 2009， 105:1339-1343.
10.GILL M, S.，A. 0LSEN, G. J. LITHGOff, Automated method for high throughput screening of nematodes. US20060191023A1。

發明內容
鑑於現有技術存在的缺陷，本發明提供了一種簡單易行、成本低廉的快速定量線蟲存活率的新方法及試劑盒，可以廣泛應用於新藥篩選、農藥篩選、環境評價及水質評價等領域。具體內容如下一種快速定量線蟲存活率的方法，採用染料對線蟲進行染色，由於活線蟲著色，死線蟲不著色，且光吸收值與活線蟲的數量成正比，從而直接可反映線蟲的存活率，該方法應用的染料是紅四氮唑或稱四氮紅唑(全稱為2，3，5_三苯基氯化四氮唑；英文名稱為 2, 3, 5-Triphenyl tetrazolium chloride,簡寫為 TTC 或 TZ),分子式為 C19H15ClN40
TTC原理存活狀態的線蟲存在呼吸作用，在呼吸過程中產生還原態脫氫輔酶I或 II (NADH2或NADPH2)。當TTC的無色溶液滲入活線蟲的活細胞內並作為氫受體被脫氫輔酶上的氫還原時，生成一種紅色、穩定、不會擴散和不溶於水的三苯基甲臢(TTF)。化學方程式如下
權利要求
1.一種快速定量線蟲存活率的方法，採用染料對線蟲進行染色，由於活線蟲著色，死線蟲不著色，且光吸收值與活線蟲的數量成正比，從而直接可反映線蟲的存活率，其特徵在於該方法應用的染料是紅四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride, TTC)，分子式為C19H15ClN40
2.根據權利要求1所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特徵在於該方法中的線蟲是自由生活的種類，或者是寄生生活的種類，優選秀麗隱杆線蟲(femorA^i/iiis elegans)。
3.根據權利要求1至2中任意一項所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特徵在於該方法中的線蟲是處於任一發育階段的線蟲，自由生活的線蟲是選自一期幼體線蟲至成蟲的任一發育階段線蟲，寄生生活的是自由生活時期的幼體線蟲。
4.根據權利要求1至3中任意一項所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特徵在於染色溫度為4°C 35°C、染料濃度為0. 1% 20%、染色時間為5min 45min。
5.根據權利要求1至4中任意一項所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特徵在於應用的線蟲數量為15 1500條。
6.根據權利要求1至5任意一項所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特徵在於該方法採用二甲基亞碸(DMSO)或甲醇將在線蟲體內顯色的染料溶出。
7.根據權利要求1至5任意一項所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特徵在於染色後還可以採用甘油作為透明劑，然後採用酶標儀直接測定吸光值。
8.根據權利要求1至7任意一項所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特徵在於該方法在新藥篩選、農藥篩選、環境評價及水質評價領域應用。
9.一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有染料紅四氮唑 (2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)，分子式為 C19H15ClN40
10.一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特徵在於該試劑盒可以含有線蟲，其中的線蟲是自由生活的種類，或者是寄生生活的種類，優選秀麗隱杆線蟲(femorA^i/iiis elegans)。
11.根據權利要求9至10中任意一項所述的一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特徵在於該試劑盒中的線蟲是處於任一發育階段的線蟲，自由生活的線蟲是選自一期幼體線蟲至成蟲的任一發育階段線蟲，寄生生活的是自由生活時期的幼體線蟲。
12.根據權利要求9至11中任意一項所述的一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特徵在於染色溫度為4°C 35°C、染料濃度為0. 1% 20%、染色時間為5min 45min。
13.根據權利要求9至12中任意一項所述的一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特徵在於應用的線蟲數量為15 1500條。
14.根據權利要求9至13任意一項所述的一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有二甲基亞碸(DMSO)或甲醇。
15.根據權利要求9至14任意一項所述的一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有甘油。
16.根據權利要求9至15任意一項所述的一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特徵在於該試劑盒在新藥篩選、農藥篩選、環境評價及水質評價領域應用。
全文摘要
本發明涉及一種快速定量線蟲存活率的方法及試劑盒，具體是首先採用染料TTC對線蟲進行染色，由於活線蟲著色，死線蟲不著色，且光吸收值與活線蟲的數量成正比，從而直接可反映線蟲的存活率，並據此製備試劑盒。這種方法及試劑盒可以在以線蟲存活率為指標的藥物篩選、農藥篩選、環境評價、水質評價等方面應用。本發明在操作上快速、簡單易行，對設備要求不高，成本低廉，具有很高的應用價值。
文檔編號G01N1/30GK102213672SQ20101013862
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月3日 優先權日2010年4月3日
發明者周婷, 支德娟, 李紅玉 申請人:李紅玉